HPV基因診斷試劑盒.ppt

1、子宮頸癌與人乳頭瘤病毒 （HPV）的研究進展,一、宮頸癌的概述及其病因?qū)W研究進展 二、HPV的生物學(xué)研究 三、宮頸癌的早期篩查 四、宮頸病變的治療,一、宮頸癌的概述及其病因?qū)W研究進展,宮頸癌最常見的婦科惡性腫瘤 據(jù)世界范圍內(nèi)統(tǒng)計，每年大約有50萬左右的宮頸癌新發(fā)病例，占所有癌癥新發(fā)病例的5%，其中80%的病例發(fā)生在發(fā)展中國家。我國每年宮頸癌新發(fā)病例約13.15萬，占世界宮頸癌新發(fā)病例總數(shù)的28.8% ，發(fā)病率僅次于乳腺癌位居第二。 隨著篩查制度的建立，世界宮頸癌的發(fā)病率和死亡率已經(jīng)大幅下降。我國由70年代的10.28/10萬下降到90年代的3.25/10萬，但在高發(fā)病區(qū)，死亡率仍高居不下,患病

2、年齡更趨于年輕化（發(fā)病年齡提前到45歲），發(fā)病史縮短。如吉林省在80年代統(tǒng)計宮頸癌 患者中小于35歲的婦女占4.8，而2000年已經(jīng)占到34.1,子宮頸癌的危險因素： 行為危險因素：如性生活過早、多個性伴侶、多孕多產(chǎn)、社會經(jīng)濟地位低下、營養(yǎng)不良及性混亂等； 生物學(xué)因素：如細(xì)菌、病毒和衣原體等各種微生物的感染。 目前僅有少量研究表明宮頸癌可能存在著家族聚集現(xiàn)象,宮頸癌的生物學(xué)病因研究進展 ：*早在十九世紀(jì)四十年代，一位意大利醫(yī)生Regoni Stern最早提出結(jié)婚與否與宮頸癌的發(fā)生可能有關(guān)；*6070年代，人們的主要研究對象是HSV,HCMV等病原體；*1974年zur Hausen首次提出HP

3、V感染與宮頸腫瘤有密切關(guān)系；*1977年Laverty在電鏡中觀察到宮頸癌活檢組織中存在人乳頭狀瘤病毒（Human papillomavirus，HPV）顆粒；*1995年IARC專題討論會：高危型HPV持續(xù)感染是宮頸癌的主要病因。 - 99.7的宮頸癌患者都能發(fā)現(xiàn)高危型HPV感染,二、HPV的生物學(xué)研究,人乳頭瘤病毒（Human Papillomaviruses, HPV,雙鏈DNA無包膜病毒 環(huán)狀DNA，約8Kb； 病毒顆粒直徑為5055nm； 依靠宿主細(xì)胞進行復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯,HPV病毒電鏡圖,型別：已發(fā)現(xiàn)100多種不同的亞型（如果DNA序列同源性小于90，則定為新的亞型）。其中超過35

4、種可以感染人類的生殖器官，約30種與腫瘤有關(guān)。 1）低危型：宮頸上皮內(nèi)低度病變，引起外生殖器濕疣等良性性?。℉PV 6、11、42） ； 2）高危型： 宮頸上皮內(nèi)高度病變，與宮頸癌的發(fā)生有關(guān)（HPV 16、 18、 31、 33、35、 39、45、 51、 52、 53、56、 58、59、 66及 68）； 分布：有些亞型和地區(qū)、宮頸癌的病理類型有關(guān)。 HPV45在非洲西部很常見，HPV39和59在美洲中部和南部常見，HPV52，58在中國常見。 在宮頸鱗狀上皮細(xì)胞癌中以HPV16（占51），在腺癌和腺鱗癌中HPV18分別占56和39,型別與分布,表 HPV型別與宮頸病變,HPV在歐洲的常

5、見分型和感染率,最常見的低危型（HPV6、11） 最常見的高危型（HPV16、18、31、33、45、58,宮頸癌患者中高危型HPV感染率(歐州2000年資料,深圳不同HPV亞型的檢出頻率統(tǒng)計 （WHO項目,注：1.本表統(tǒng)計樣本數(shù)為1153例，其中陽性樣本數(shù)為119例； 由于檢測樣本中存在復(fù)合感染，故亞型的檢出頻率（該亞型的檢出次數(shù) / 所有亞型的檢出次數(shù)）100， 所有亞型檢出次數(shù)為226。 2. 本表統(tǒng)計數(shù)據(jù)由WHO深圳項目提供，HPV分型基因檢測試劑由亞能生物技術(shù)（深圳）有限公司提供,浙江12000例HPV檢測初步結(jié)果,分型情況：16型占26%左右，其他依次為58、33、52、45、18

6、。與其他地區(qū)的統(tǒng)計有明顯差異。 高危人群陽性率在30%左右，普通人群在11%左右。 溫州地區(qū)麗水地區(qū)陽性率明顯高于省內(nèi)其他地區(qū)。 進一步的研究正在進行中,HPV基因結(jié)構(gòu),按功能可分為早期區(qū)(E區(qū))、晚期區(qū)(L區(qū))和非編碼區(qū) （ LCR）三個區(qū)域。 E區(qū)分為E1E7開放閱讀框架，主要編碼與病毒復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、調(diào)控和細(xì)胞轉(zhuǎn)化有關(guān)的蛋白（ HPV無E3）。 L區(qū)分L1和L2，分別編碼主要衣殼蛋白和次要衣殼蛋白。 LCR是E區(qū)與L區(qū)間-6.41.0Kb的DNA片段，可負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的調(diào)控,HPV的致癌機理,HPV以游離態(tài)感染上皮細(xì)胞后，可以持續(xù)存在于染色體外，不引起任何病變，或引起良性病變和低度病變，如尖

7、銳濕疣或輕度不典型增生等。而癌變則與病毒DNA整合入宿主染色體密切相關(guān)。 高危型HPV DNA鏈通常在E1或E2的開放讀碼框內(nèi)斷裂，使HPV DNA整合入染色體脆弱區(qū)。E6和E7具有促進和維持整合狀態(tài)的功能。 HPV E6蛋白間接抑制 p53活性，阻礙細(xì)胞對DNA損傷的反應(yīng)。（負(fù)向調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長和分化） HPV E7蛋白與pRb結(jié)合后使其功能失活，改變細(xì)胞周期的正常調(diào)控,國內(nèi)對不同亞型感染致病性研究近況,北京大學(xué)第一臨床醫(yī)院趙健等對1715例患者研究表明：在高危型中，致癌性最強的是16型，其次是33和31型。（十五攻關(guān)資助項目）。 在北京中日友好醫(yī)院進行的591例研究中，發(fā)現(xiàn)多重感染患者發(fā)生宮

8、頸癌的危險性明顯高于單一感染者，對放療敏感性差，無進展生存期和帶瘤生存期比單一感染者明顯縮短,HPV感染途徑及危險因素,感染途徑： 主要為性傳播和直接皮膚接觸 特別案例：母親分娩過程中傳播至嬰兒的口腔 危險因素： 1、年齡因素：30歲以后HPV感染率下降，但危險性提高。 2、性行為的影響：初次性交年齡越小，性伴侶數(shù)量越多，感染率越高； 3、避孕方法：尚無一致意見； 4、免疫抑制狀態(tài)使HPV感染的危險性增加：如HIV感染后、腎移植等,三、宮頸癌的早期篩查,未見上皮內(nèi)病變鱗狀上皮細(xì)胞異常腺上皮細(xì)胞異常 ASC（Atypical Squamous Cells)：非典型鱗狀上皮細(xì)胞 ASC-US（AS

9、C of Undetermined Signification）:意義不明確的非典型鱗狀上皮細(xì)胞 ASC-H（ASC cannot exclude HSIL）：意義不明確的非典型鱗狀上皮細(xì)胞不除外高度鱗狀上皮內(nèi)病變 L-SIL（Lowgrade Squamous Intraepithelial Lesion）：低度鱗狀上皮內(nèi)病變HPV感染、CIN I H-SIL（Highgrade SIL）：高度鱗狀上皮內(nèi)病變與CIN II、CIN III或原位癌含義一致 SCC（Squamous Cell Carcinoma）：鱗狀細(xì)胞癌 AGC（ Atypical Glandular Cells)：非典型

10、腺上皮細(xì)胞 AIS（Adenocarcinoma In Situ)：腺原位癌 ACA（ Adenocarcinoma）：腺癌 組織學(xué)檢查的分類： CIN（Cervical Intraepithelial Neoplasm)：宮頸上皮內(nèi)瘤變 CIN I：輕度不典型增生 CIN II：中度不典型增生 CINIII：重度不典型增生、原位癌,2001年版TBS（The Bethesda System)報告分類中常見的細(xì)胞學(xué)診斷宮頸癌前病變的幾個術(shù)語解釋,正常婦女,HPV暴露,主要是性傳播 感染幾率：40,HPV,年齡30歲,一過性，80 平均8個月,年齡30歲,平均824個月,CIN I（組織學(xué),CI

11、N II/III（組織學(xué),無細(xì)胞學(xué)改變/HPV消除,子宮頸浸潤癌,機體免疫機制 輔助致癌因素,圖 HPV感染與宮頸病變的自然過程,潛伏感染期 亞臨床感染期 臨床癥狀期 HPV相關(guān)腫瘤期,810年,臨床提示，從HPV的持續(xù)感染到一般的宮頸癌前病變并最終發(fā)展為宮頸癌大約需要8-10年。因此，必須采取適當(dāng)?shù)念A(yù)防和篩查措施，才能夠阻止宮頸癌的發(fā)生并有望最終消滅宮頸癌。在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)技術(shù)的支持下，婦科醫(yī)生應(yīng)該大有作為,篩查是早診早治關(guān)鍵,備注：13年篩查間隔比較安全，隨著篩查間隔的增加，風(fēng)險大幅度增加,表：篩查間隔時間與陽性病變風(fēng)險系數(shù)表,表：不同的篩查頻率，可以降低的宮頸癌的累積發(fā)病率,摘自：Goldie

12、 SJ, et al. 2001.13 ；篩查策略所應(yīng)用方法包括：1-VIA檢查，2-HPV檢測，3-巴氏涂片,篩查對象：三年以上性行為或21歲以上有性行為的婦女。 起始年齡：經(jīng)濟發(fā)達地區(qū)：2530歲，經(jīng)濟欠發(fā)達地區(qū)：3540歲， 高危人群起始年齡應(yīng)相應(yīng)提前。 終止年齡：65歲以上危險性極低 。 篩查間隔：每年一次，若連續(xù)兩次HPV和細(xì)胞學(xué)篩查均為正常，可 延長篩查間隔時間至58年。 發(fā)達國家：1668歲，HPV+TCT，間隔35年,中國癌癥研究基金會（CCRF） 宮頸癌篩查及早診早治指南,中國癌癥研究基金會（CCRF）宮頸癌篩查及早診早治指南,篩查方案：基本方案：肉眼觀察冰醋酸試驗（碘液試驗

13、）（農(nóng)村普查） 一般方案：HPV+pap smear檢測（二級及以上醫(yī)院） 最佳方案：HPV+TCT檢測（發(fā)達地區(qū)） 檢查后隨訪對象：細(xì)胞學(xué)低度病變、CIN I以上者、“特殊職業(yè)”婦女人群、年齡 30 歲以上的高危HPV感染者，每年定期隨訪檢查。 注意事項： 1、月經(jīng)來潮后1018天為最佳檢查時間 2、檢查前48h內(nèi)不要做陰道沖洗，不用使用陰道內(nèi)用藥物 3、檢查前48h內(nèi)不要行性生活,宮頸癌的常規(guī)臨床檢測方法,臨床檢查：如肉眼觀察、陰道鏡等 操作簡便，但準(zhǔn)確率和特異性有待提高（50-70） 細(xì)胞學(xué)檢測：觀察宮頸上皮細(xì)胞的變異，常見方法有：巴氏涂 片、LCT、 TCT等（70%以上） 1）長期宮

14、頸糜爛可導(dǎo)致宮頸上皮細(xì)胞形態(tài)變異，但非HPV引起的細(xì)胞形態(tài)異常與宮頸癌病變沒有直接聯(lián)系。 2）在感染早期，細(xì)胞往往不會出現(xiàn)形態(tài)變化，但此時HPV對細(xì)胞內(nèi)遺傳物質(zhì)的損傷可能已經(jīng)產(chǎn)生。 病毒學(xué)檢測：HPV DNA檢測（PCR方法），常見方法有：基因芯 片分型檢測、HC-2、熒光PCR等 特異性強、靈敏度高，操作簡便快捷 (98,宮頸分泌物HPV結(jié)果,注：亞能和凱普均以13種高危型別統(tǒng)計 若以23種型別計算，亞能HPV陽性129例，陽性率為11.3 。 共剔除18例13種型別以外的型別,HPV基因分型快速診斷試劑,應(yīng)用膜雜交技術(shù)建立的敏感、特異、簡便的檢測方法，可同時對23種HPV亞型 (18種高危

15、型及5種低危型)進行檢測,基因芯片（GeneChip）就是將大量不同序列的探針分子固定于支持物的不同位置上，然后與已做標(biāo)記的樣本進行雜交，通過檢測雜交信號的強度和分布來進行分析。 高度的靈敏性和準(zhǔn)確性 快速簡便 同時檢測多種疾病,HPV基因分型快速診斷試劑操作流程,采集樣本,提取DNA,PCR擴增,雜交,顯色,結(jié)果判斷,檢測結(jié)果：HPV16、HPV43,檢測結(jié)果：HPV33、HPV35,一）宮頸病變的篩查 1、HPV檢測的最大優(yōu)勢之一在于發(fā)現(xiàn)高危型HPV陽性而細(xì)胞學(xué)涂片正常的婦女，因為這一人群中10會在四年內(nèi)發(fā)展成CIN。 2、篩查并濃縮高風(fēng)險人群，便于進行有效監(jiān)控，早期發(fā)現(xiàn)宮頸癌。 3、HP

16、V檢測的陰性預(yù)測值為99，可將篩查間隔延長至3年一次，大大地降低了檢查成本。 敏感性：88100 特異性：98 陰性預(yù)測值：幾乎100,HPV檢測的臨床意義,圖： 德、法、英三個國家研究數(shù)據(jù)總概,HPV（）是宮頸病變的重要依據(jù)，持續(xù)的HPV感染是CINII/CIN III的重要條件，相對于TCT檢測，HPV檢測敏感度更高，更有臨床意義，在歐洲已經(jīng)作為首選篩查方法,GC-HPV與TCT的差異,二）ASCUS和低度病變的分流,1、HPV檢測通過排除可疑的或低度病變，從而提高診斷的可信度，降低漏診的風(fēng)險。 2、把具有潛在宮頸癌風(fēng)險的婦女從低風(fēng)險的婦女中區(qū)分出來，指導(dǎo)陰道鏡的合理使用。 3、比起復(fù)查細(xì)

17、胞學(xué)，HPV檢測提供了更快捷的結(jié)果，從而很有信心地把HPV陰性的婦女重新放回常規(guī)篩查人群中,病例數(shù)：3000例，圖顯示HPV的相對風(fēng)險隨CIN 的級別上升而明顯增加,三）HPV檢查提供了CIN治療后隨診手段,1、可預(yù)測病變惡化或術(shù)后復(fù)發(fā)的風(fēng)險，有效指導(dǎo)術(shù)后追蹤。 2、術(shù)后6個月、12個月檢測HPV陰性，提示病灶切除干凈，可最大限度減少病人的焦慮。 3、若術(shù)后HPV檢測陽性，提示有殘留病灶及有復(fù)發(fā)的可能。 CIN患者： 成功治療率達9095，復(fù)發(fā)率10； 但比正常人發(fā)生浸潤癌的幾率仍高45倍； 危險期：8年左右,病變,進展（惡化,持續(xù)（穩(wěn)定,消退（逆轉(zhuǎn),CIN級別發(fā)展為CC的風(fēng)險評估,說明：CI

18、N級別越高，其消退和逆轉(zhuǎn)的機會越小。各型CIN和宮頸癌中高危型HPV感染率達98%以,四、宮頸病變的治療 “治病”即“治毒” -郎景和教授語錄,一、物理治療 ：電凝、冷凍、微波、激光等。 二、手術(shù)治療 ：LEEP、子宮頸錐切術(shù)等。 三、藥物治療：抗生素、干擾素、HPV疫苗（預(yù)防型和治療型,子宮頸篩查經(jīng)過的處理原則,慢性宮頸炎：物理治療，激光、電烙、微波、冷凍 子宮頸CIN的處理 CIN 物理治療：激光，微波等 CIN Leep治療， CIN 一般情況下會診斷為CIN，不再可能采用物理治療手段 當(dāng)排除了CIS，治療可行Leep治療 已確診為CIS或更嚴(yán)重，目前不可能采用Leep治療，而可能冷刀錐切 若已完成生育者，一經(jīng)診斷為CIS，應(yīng)接受全子宮切除手術(shù),HPV檢測后處理原則（綜合,對可疑病例進行HPV檢查： 陰性：進行常規(guī)治療(針對癥狀體癥進行治療)。 陽性：HPV結(jié)果陽性而未做細(xì)