基因診斷和基因治療

1、基因診斷和基因治療,概念,基因是攜帶生物遺傳信息的基本功能單位，是位于染色體上的一段特定DNA序列。基因的改變，會(huì)導(dǎo)致各種表型的改變，進(jìn)而引起疾病的發(fā)生,將基因或其組成部分發(fā)生異常的疾病統(tǒng) 稱(chēng)為基因病,基因病分為三大類(lèi),一、單基因?。?由單個(gè)基因突變引起的一類(lèi)疾病。 如：血友病、地中海貧血等,二、多基因?。河啥鄠€(gè)基因突變綜合作用引起的 疾病。如：惡性腫瘤、高血壓、動(dòng)脈硬化、 糖尿病、先天畸形等,三、獲得性基因病：指外源基因（DNA）侵入， 在機(jī)體產(chǎn)生疾病，一旦將其清除便可痊愈。 如：艾滋病及各種微生物感染病,第一節(jié) 基因診斷 （DNA diagnosis,一、基因診斷的概念和基本概況,臨床診斷

2、 生化學(xué)診斷 免疫學(xué)診斷,臨床疾病診斷四種方式,以疾病表型改變?yōu)橐罁?jù)。 （細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)變化、代謝產(chǎn)物異常、特定蛋白分子識(shí)別差異等,基因診斷,對(duì)患者基因直接分析,基因診斷定義（概念,基因診斷是利用現(xiàn)代分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的技術(shù)方法，直接檢測(cè)患者體內(nèi)基因結(jié)構(gòu)及其表達(dá)水平是否正常，從而對(duì)疾病作出診斷或輔助診斷,基因診斷是在DNA/RNA水平檢測(cè)分析基因的存在、結(jié)構(gòu)變異和表達(dá)狀態(tài)，與傳統(tǒng)診斷方法比較有其特點(diǎn),基因診斷的特點(diǎn),1、病因診斷,直接瞄準(zhǔn)病理基因，不僅對(duì)表型出現(xiàn)的疾病作出診斷，還可能發(fā)現(xiàn) 潛在的致病因素，如: 確定有遺傳家族史的人攜帶致病基因,2、特異性強(qiáng)、靈敏度高,選用特定基因序列作為探針

3、，單拷貝基因采用高度擴(kuò)增PCR技術(shù),3、穩(wěn)定性高,4、診斷范圍廣，適應(yīng)性強(qiáng),目的基因是否處于活化狀態(tài)均可。樣品可長(zhǎng)期保存,可檢測(cè)正在生長(zhǎng)的病原體或潛在病原體,與以疾病表型改變?yōu)橐罁?jù)的 診斷技術(shù)相比,基因診斷的基本概況,伴隨分子生物學(xué)理論技術(shù)的發(fā)展而建立和發(fā)展,DNA雙螺旋 遺傳密碼破譯 DNA重組 癌基因與抑癌基因研究 地中海貧血病基因治療和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體開(kāi)發(fā) PCR、分子雜交等一系列技術(shù)發(fā)展,二、基因診斷的對(duì)象,1、病原生物的侵入,病原體：病毒、支原體、細(xì)菌、寄生蟲(chóng),檢查診斷方法：顯微鏡、免疫學(xué)方法、基因診斷等,尤其是當(dāng)無(wú)抗體時(shí)，基因診斷成為唯一手段,2、先天遺傳性疾病,遺傳性疾病: 發(fā)病的

4、原因?yàn)樘囟ɑ虻耐蛔?腫瘤的發(fā)生,發(fā)病機(jī)理尚不請(qǐng)。 初步認(rèn)為是個(gè)別細(xì)胞基因突變而引起的 細(xì)胞無(wú)限增殖.（包括抑癌基因和癌基因,3、后天基因突變引起的疾病,二、基因診斷的對(duì)象,1）用核心順序的串聯(lián)重復(fù)序列組成探針進(jìn)行雜交研 究，可同時(shí)檢出具有高度多態(tài)性位點(diǎn)。 （2）用southern 雜交得到DNA指紋圖譜,個(gè)體識(shí)別、親子鑒定、法醫(yī)物證,4、其他,二、基因診斷的對(duì)象,遺傳穩(wěn)定，個(gè)體特異，因而用于法醫(yī)和親子鑒定,基因診斷的基本策略,1、檢測(cè)已知的能產(chǎn)生某種特定功能蛋白的基因,這些基因根據(jù)其特定功能已被克隆，并被定位在染色體上，基因序列亦被測(cè)定，致病時(shí)的基因改變亦較清楚,如：已被克隆的病毒、細(xì)菌、霉

5、菌和寄生蟲(chóng)的基因、 與致病有關(guān)的癌基因、抗癌基因、 地中海貧血、苯丙酮尿癥等遺傳病基因,2、檢測(cè)與某種遺傳標(biāo)志連鎖的致病基因,遺傳連鎖同一染色體相鄰的二個(gè)或二個(gè)以上的基因或限制性酶切位點(diǎn)，由于位置十分靠近，在遺傳時(shí)分離幾率很低，常一起遺傳-稱(chēng)連鎖,染色體遺傳連鎖圖用限制性?xún)?nèi)切酶酶切位點(diǎn)作遺傳 標(biāo)志，定位與之相連鎖的正常基因與致病基因，建立相應(yīng)的遺傳連鎖圖譜,定位性克隆根據(jù)遺傳連鎖圖進(jìn)行定位性克隆。比較正常 和異?；虻牟顒e，可找出導(dǎo)致遺傳病的分子缺陷。 定位性克隆策略是當(dāng)前基因診斷的重要基礎(chǔ),3、檢測(cè)表型克隆基因,針對(duì)多基因?。ㄈ纾褐囟确逝帧⑾?、高血壓、癲癇、精神病、多種自身免疫性疾病,表型

6、克隆技術(shù)是將有關(guān)表型與基因結(jié)構(gòu)結(jié)合，直接 分離該表型的相關(guān)基因，并對(duì)疾病相關(guān)的一組基因進(jìn)行 克隆，然后用作多種探針，來(lái)診斷多基因遺傳病,該策略既不需預(yù)先知道基因的生化功能或圖譜定位，也不受 基因數(shù)目及其相互作用方式的影響,方法,1、DD-RT-PCR：分析正常和異?；蚪M 尋找兩者之間的差異序列,2、基因組錯(cuò)配篩選技術(shù)：尋找兩者的全同序列，分離、鑒定與疾病相關(guān)的基因，確定導(dǎo)致疾病的分子缺陷,基因診斷的基本步驟,1、獲得待檢樣品：提取核酸 （PCR提高靈敏度,2、制備和標(biāo)記核酸探針,3、基因檢測(cè)分析,三、基因診斷的常用技術(shù),核酸分子雜交 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR） 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RELP）

7、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（AFLP） 等位基因特異的寡核苷酸（ASO） 單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP） 基因芯片,1、核酸分子雜交,原理： 利用核酸的變性、復(fù)性及堿基互補(bǔ)的性質(zhì)，用已知基因的核酸序列作探針，與變性后的單鏈基因組DNA/RNA雜交，檢測(cè)核酸樣品中是否存在與探針互補(bǔ)的同源核酸序列，進(jìn)行DNA或RNA定性定量分析,基因檢驗(yàn)的兩個(gè)必要條件,1、必需的特異探針（標(biāo)記的） 2、必需的基因組DNA,核酸分子雜交核酸印跡雜交,DNA印跡雜交（ Southern blot） RNA印跡雜交 （Nouthern blot） 斑點(diǎn)印跡雜交 （Dot-blot） 原位雜交 (situ hybridization

8、,核酸印跡雜交基本過(guò)程,提取DNA或RNA 酶切 凝膠電泳 膠變 性處理（DNA） 轉(zhuǎn)印核酸片段到NC膜上。 （RNA可直接用變性膠電泳，轉(zhuǎn)膜,1、制備樣品,核酸印跡雜交基本過(guò)程,2）制備探針,探針：一段能和待檢測(cè)核酸分子按堿基互補(bǔ)配對(duì) 原則而結(jié)合的核酸分子片段。 探針需要標(biāo)記可直接檢測(cè)的元素或分子。 如：同位素、熒光、生物素等,核酸印跡雜交基本過(guò)程,核酸印跡雜交可檢測(cè)pg水平的靶分子,4）檢測(cè)： 方法依標(biāo)記的探針而不同 *放射性同位素 *生物素 *地高辛 *熒光素,3）雜交： 預(yù)雜交封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn) 雜交探針與核酸分子結(jié)合,核酸印跡雜交基本過(guò)程,2、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR,原理,以待擴(kuò)增D

9、NA為模板，在互補(bǔ)模板兩端序列的寡核苷酸引物介導(dǎo)下，通過(guò)耐高溫DNA聚合酶催化下，按半保留復(fù)制機(jī)制延模板鏈延伸，快速、特異地?cái)U(kuò)增特定的DNA,一種體外模擬自然DNA復(fù)制過(guò)程的核酸擴(kuò)增技術(shù)。 （無(wú)細(xì)胞分子克隆技術(shù),耐高溫DNA聚合酶Taq酶,寡核苷酸引物：設(shè)計(jì)引物和確定退火溫度是PCR 成功的關(guān)鍵,PCR的基本過(guò)程：（循環(huán)程序,變性（95） 退火（5565 ） 延伸（72,35分,401分,100bp/1分,源自水棲高溫菌，最適反應(yīng)溫度為72，且經(jīng) 90以上加溫后仍可在溫度恢復(fù)后復(fù)性,呈2n 擴(kuò)增速度,PCR基本過(guò)程和原理,特點(diǎn)：特異性強(qiáng) 靈敏度高 樣品可以是： 毛發(fā)、血痕 單細(xì)胞、 病原體、

10、腫瘤殘留物、 犯罪現(xiàn)場(chǎng)遺留物,基因診斷中常用的PCR技術(shù),1）、DNA PCR,2）、RT- PCR,以DNA為模板，擴(kuò)增特定核苷酸序列。用于檢測(cè)特 定基因片段的存在，分析鑒定基因突變,以總RNA或mRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后擴(kuò)增。用 于檢測(cè)特定基因表達(dá)水平的主要方法之一,3）、PCR-SSCP,檢測(cè)基因未知突變的常用技術(shù)。簡(jiǎn)單、快捷、靈敏,4）、多重 PCR,指在一次PCR反應(yīng)中加入多對(duì)引物，同時(shí)擴(kuò)增DNA 序列上不同序列片段的一種PCR技術(shù)。用于一些“超大” 基因中大片段缺失分析,5）、原位 PCR,直接用組織切片和細(xì)胞進(jìn)行PCR或RT-PCR，在組織、 細(xì)胞原位檢測(cè)單拷貝或低拷貝的

11、特點(diǎn)基因序列,6）、實(shí)時(shí)定量 PCR,借助特異性結(jié)合DNA的熒光染料，實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測(cè)PCR 擴(kuò)增的DNA量的變化,其他重要的PCR衍生技術(shù),反向PCR（IPCR） 標(biāo)記引物PCR（labelled primers PCR） 錨定PCR（anchored PCR） 差異展示PCR（DD-PCR,見(jiàn)書(shū)“分子生物學(xué)技術(shù)”章節(jié),3、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP,檢出方法： Southern 印跡,概念,用同一限制性?xún)?nèi)切酶完全切割同一物種的不同個(gè)體的基因組DNA，出現(xiàn)分子質(zhì)量不同的同源片段，這種由限制性?xún)?nèi)切酶酶切位點(diǎn)變化導(dǎo)致的DNA片段差異，稱(chēng)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP,人類(lèi)基因組中由中性突變導(dǎo)致個(gè)

12、體間核苷酸 的差異稱(chēng)DNA多態(tài)性,RFLP類(lèi)型,2、由于鏈內(nèi)發(fā)生較大片段的缺失、重復(fù)、插入和重 排導(dǎo)致DNA順序的變化，因而酶切片段改變 序列多態(tài)性,1、單個(gè)堿基的突變引起酶切位點(diǎn)的變化 點(diǎn)多態(tài)性,致病基因附近或內(nèi)部一般存在RFLP,可用于連鎖 分析的基因診斷,四）擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（AFLP,應(yīng)用于基因突變性質(zhì)不明的連鎖分析,AFLP串聯(lián)重復(fù)的短片段的長(zhǎng)度多態(tài)性通過(guò)PCR擴(kuò)增,經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶酶切后電泳,產(chǎn)生顯示擴(kuò)增片段多態(tài)性,AFLP原理,首先利用可產(chǎn)生粘性末端的限制性?xún)?nèi)切酶酶切研究對(duì)象的基因組序列，產(chǎn)生不同長(zhǎng)度的酶切片段。然后，將這些酶切片段與含有與其有共同粘性末段的人工接頭連接，形成模板

13、。為達(dá)到選擇性擴(kuò)增的目的，再在模板末端添加具有選擇性核苷酸（13個(gè)）的不同引物，然后PCR擴(kuò)增，結(jié)果只有那些兩端序列與選擇性核苷酸配對(duì)的酶切片段被擴(kuò)增。最后將被擴(kuò)增的片段在高分辨率的測(cè)序凝膠上電泳，這樣其多態(tài)性即根據(jù)擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度與數(shù)量的不同而被分開(kāi),PCR擴(kuò)增產(chǎn)物即等位片段之間 差別只有幾個(gè)bp,5、等位基因特異的寡核苷酸（ASO,方法,1、合成兩種探針： 已知突變位點(diǎn)的核苷酸序列（M） 正?；驂A基序列（N,2、雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果,M+ N- 受檢者是突變基因的純合子,M- N+ 受檢者是不存在突變基因,M- N- 受檢者的缺陷基因可能是一種新的突變類(lèi)型,M+ N+ 受檢者是突變基因的雜合子,原

14、理： 已知基因突變部位和性質(zhì)，合成基因特異的核苷酸探針（20bp），標(biāo)記后與受檢者DNA雜交診斷。（可與 PCR聯(lián)用：PCR-ASO,6、單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP,日本Orita等研究發(fā)現(xiàn)，單鏈DNA片段呈復(fù)雜的 空間折疊構(gòu)象，當(dāng)有一個(gè)堿基發(fā)生改變時(shí)，會(huì)或 多或 少地影響其空間構(gòu)象，使構(gòu)象發(fā)生改變， 空間構(gòu)象有差異的單鏈DNA分子在聚丙烯酰胺 凝膠中受排阻大小不同.因此，通過(guò)非變性聚丙 烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，可以非常 敏銳地將構(gòu) 象上有差異的分子分離開(kāi),PCR-SSCP,PCR-SSCP基本過(guò)程,PCR擴(kuò)增靶DNA 將特異的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物變性后快速?gòu)?fù)性; 將單 鏈DNA進(jìn)行非變性聚丙烯酰

15、胺凝膠電泳; 通過(guò)放射性自顯影、銀染或溴化乙錠顯 色分析結(jié)果.若發(fā)現(xiàn)單鏈DNA帶遷移率與正常對(duì)照的相比發(fā)生改變，就可以判定該鏈構(gòu)象發(fā)生改變，進(jìn)而推斷該DNA片段中有堿基突變,7、基因芯片,將指大量寡核苷酸分子固定于支持物上，然后與標(biāo)記的樣品進(jìn)行雜交，通過(guò)檢測(cè)根據(jù)雜交分子和未雜交分子信號(hào)的強(qiáng)弱進(jìn)而判斷樣品中靶分子的數(shù)量,基本原理,生物集成模片、DNA陣列、或寡核苷酸微芯片,基因芯片技術(shù),目的：檢測(cè)外源性基因的侵入,目標(biāo),1、微生物 2、病毒 如： HIV（致艾滋病 AIDS） 3、寄生蟲(chóng)、 4、不易體外培養(yǎng)的病原體（毒性大腸桿菌、麻風(fēng)分枝 桿菌） 5、實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的病原體（克立氏體,四、基因診斷的

16、 臨床應(yīng)用,1、在感染性疾病檢測(cè)中應(yīng)用,艾滋病與HIV病毒,艾滋病由HIV通過(guò)接觸、血液、血制品及母嬰傳播感染所致。HIV特異地侵犯輔助性T細(xì)胞（CD4），引起人體細(xì)胞免疫嚴(yán)重缺陷，導(dǎo)致頑固的機(jī)會(huì)性感染，惡性腫瘤和神經(jīng)系統(tǒng)損傷。 HIV 感染后，95%感染者5個(gè)月可檢出抗體（也有3-4年仍不能檢出抗體）。有必要進(jìn)行PCR技術(shù)檢測(cè),艾滋病與HIV病毒,檢測(cè)技術(shù)：巢式-PCR、Southern、DNA序列分析,引物的設(shè)計(jì)：應(yīng)在保守區(qū)（基因：pol, env, gag, tat,病毒特點(diǎn),HIV病毒由兩條單鏈RNA組成，9.7k / RNA， 主要基因結(jié)構(gòu)和組成形成與其他逆轉(zhuǎn)錄病毒相同，但較 之復(fù)雜

17、，故稱(chēng)復(fù)雜反轉(zhuǎn)錄病毒,HIV屬反轉(zhuǎn)錄病毒即單鏈RNA反轉(zhuǎn)錄成雙鏈DNA， 進(jìn)入宿主細(xì)胞染色體,非典型性肺炎（SARS,由一種新型冠狀病毒（SARS-CoV）引起，多種 途徑傳播，傳染性強(qiáng)、高致死率的急性疾病,診斷依靠： 流行病學(xué)、臨床表現(xiàn)、放射診斷、 血清學(xué)（熒光免疫、ELISA,PCR作為一種靈敏的早期病原學(xué)診斷必不可少 （關(guān)鍵是引物的合成,2、在遺傳病檢測(cè)中的應(yīng)用,產(chǎn)前診斷 檢測(cè)妊娠812周的絨毛DNA或羊水細(xì)胞 PCR診斷一系列遺傳疾病,鐮刀狀細(xì)胞貧血的診斷 方法：RFLP診斷 Mst酶切識(shí)別序列：CCTNAGG 切割正常鏈序列：CCTGAGG 不切割突變序列：CCTGTGG ASO探針

18、診斷,3、在腫瘤檢測(cè)中的應(yīng)用,原癌基因 生物正常細(xì)胞基因中編碼關(guān)鍵性調(diào)控蛋白的 癌基因,抑癌基因 一類(lèi)抑制細(xì)胞增殖的基因，其失活可引起細(xì) 胞轉(zhuǎn)化,兩類(lèi)基因協(xié)同調(diào)控，使細(xì)胞生長(zhǎng)處于平衡狀態(tài),癌基因激活變化及檢測(cè),1、基因擴(kuò)增：即染色體某區(qū)段基因拷貝數(shù)增加，或癌基 因的擴(kuò)增,檢測(cè)方法： Southern 雜交 定量PCR,2、基因的過(guò)量表達(dá)：包括基因擴(kuò)增基礎(chǔ)上的過(guò)量表達(dá)及非 DNA水平的過(guò)量表達(dá),檢測(cè)方法： Northern 雜交 RT-PCR,3、點(diǎn)突變： 檢測(cè)方法為各種基于PCR的方法,抑癌基因的檢測(cè)：Southern PCR,大片段的缺失、和點(diǎn)突變,兩個(gè)等位抑癌基因突變才能引起腫瘤，需檢 出

19、兩個(gè)等位抑癌基因,方法：RFLP結(jié)合PCR，進(jìn)行缺失檢測(cè) 點(diǎn)突變主要采用PCR,腫瘤標(biāo)志物：指特征性存在于惡性腫瘤或由惡性腫瘤細(xì) 胞異常產(chǎn)生的物質(zhì)或宿主對(duì)腫瘤反應(yīng)而產(chǎn) 生的物質(zhì),1）酶類(lèi)腫瘤標(biāo)志物,2）激素類(lèi)標(biāo)志物,3）胚胎抗原,4）特殊蛋白標(biāo)志物,5）糖蛋白類(lèi)抗原,6）血中癌基因蛋白,7）唾液酸和唾液酸?；D(zhuǎn)移酶,8）多胺,免疫組化篩選提高檢出率,法醫(yī)學(xué)鑒定,針對(duì)人類(lèi)DNA 遺傳差異進(jìn)行的個(gè)體識(shí)別和親子鑒定,常用技術(shù),DNA指紋分析（VNTR） 短串聯(lián)重復(fù)序列（STR）遺傳特征分析 PCR-擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（AmP-FLP) PCR-mtDNA技術(shù),根據(jù)可變串聯(lián)重復(fù)序列（小衛(wèi)星DNA）多態(tài)

20、性 高度的個(gè)體特異性,DNA指紋（圖譜）分析,選擇核心序列作探針，選在核心序列上無(wú)切割 位點(diǎn)的限制性?xún)?nèi)切酶，酶解樣品， Southern blot得到DNA指紋圖譜,針對(duì)可變串聯(lián)重復(fù)序列（VNTR） （VNTR是判斷個(gè)體的遺傳標(biāo)志,針對(duì)VNTR側(cè)翼保守區(qū)序列設(shè)計(jì)探針，用PCR 對(duì)該區(qū)擴(kuò)增，電泳得到個(gè)體之間長(zhǎng)度不同的條 帶圖譜。（VNTR片段較長(zhǎng)PCR不易擴(kuò)增,第二節(jié) 基因治療（gene therapuy,概念,將外源正常基因?qū)氚屑?xì)胞，以糾正或補(bǔ)償因缺陷和異?；蛞鸬募膊?，達(dá)到治療目的,導(dǎo)入的基因可以與缺陷基因?qū)?yīng)、在體內(nèi)表達(dá)具有特異功能的同源基因、也可以是與缺陷基因無(wú)關(guān)的治療基因,概念的擴(kuò)

21、展,凡是采用分子生物學(xué)方法原理，將某種遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移 到患者細(xì)胞內(nèi)，使其在體內(nèi)發(fā)揮作用，達(dá)到治療目的 的方法，都可稱(chēng)為基因治療,基因治療策略,總原則,直接補(bǔ)替缺陷基因 抑制非正常基因產(chǎn)物表達(dá) 間接調(diào)節(jié)機(jī)體本身免疫系統(tǒng)的抗病能力。 利用外源基因?qū)Σ∽兗?xì)胞造成特異性殺傷,1、基因矯正將致病基因的堿基進(jìn)行糾正，而正常部分予以保留,2、基因置換用正?；蛲ㄟ^(guò)體內(nèi)基因同源重組，原位置換病變細(xì) 胞內(nèi)的致病基因，使細(xì)胞內(nèi)的DNA完全恢復(fù)正常,3、基因增補(bǔ)將目的基因?qū)氩∽兗?xì)胞或其它細(xì)胞，不去除異常 基因，而是通過(guò)目的基因的非定點(diǎn)整合，使其表達(dá) 產(chǎn)物補(bǔ)償缺陷基因的功能或使原有功能得以加強(qiáng),4、基因失活利用反義技

22、術(shù)特異封閉基因表達(dá)，抑制有害基因 的表達(dá),5、免疫調(diào)節(jié)將抗體、抗原或細(xì)胞因子的基因?qū)氩∪梭w內(nèi)， 改變病人免疫狀態(tài)，達(dá)到預(yù)防和治療的目的,基因治療的策略,6、調(diào)節(jié)性基因治療： 導(dǎo)入編碼調(diào)控蛋白的基因，治療 基因表答異常的疾病,7、化療保護(hù)性基因治療： 導(dǎo)入單相或多相細(xì)胞毒性藥 物的抗性基因，使正常細(xì)胞耐受化療藥物的能力大 大提高,8、特異性細(xì)胞殺傷性基因治療：利用DNA重組技術(shù)構(gòu)建 特異性殺傷靶細(xì)胞為目標(biāo)的“奇異彈頭”，“彈頭”部分是 分子重組的各種生物細(xì)胞毒素，它們以酶催化方式發(fā)揮 抑制蛋白合成作用，造成細(xì)胞殺傷,9、生殖細(xì)胞基因治療：生殖細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞補(bǔ)償性治療,基因治療基本程序,方法,

23、1、體外法 （ex vivo,2、體內(nèi)法 (in vivo,將受體細(xì)胞在體外培養(yǎng)，轉(zhuǎn)入外源基因，經(jīng)適當(dāng)選擇系統(tǒng)，將重組的受體細(xì) 胞回輸患者體內(nèi)，以改善癥狀。（普遍采用,直接將外源基因?qū)塍w內(nèi)有關(guān)的組織器官,使其進(jìn)入相應(yīng)的細(xì)胞并轉(zhuǎn)錄、表達(dá)而發(fā)揮治療作用,基本程序,選擇目的基因,選擇基因載體,選擇靶細(xì)胞,基因轉(zhuǎn)移,外源基因表達(dá)及檢測(cè),回輸體內(nèi),治療基因的來(lái)源,1、野生型基因： -單基因缺陷遺傳病基因 -反義核酸封閉活化的原癌基因 -轉(zhuǎn)入相關(guān)的抑癌基因，抑制腫瘤,2、重組DNA和分子克隆技術(shù)，人工合成特異 基因,1、選擇治療的目的基因,用于基因治療的基因應(yīng)滿(mǎn)足以下條件,1）體內(nèi)僅少量表達(dá)就可顯著改善

24、癥狀。 （2）該基因的過(guò)量表達(dá)不會(huì)對(duì)機(jī)體造成危害、 （3）在抗病毒和抗病原體的基因治療中，所選 擇的靶基因應(yīng)在病毒和病原體的生活史中 起重要作用，并且該序列是特異的,理想的載體具有以下特征,1、容易生產(chǎn)- 商業(yè)化生產(chǎn)，廣泛應(yīng)用，易運(yùn)輸，易保存,2、持續(xù)表達(dá)- 一旦轉(zhuǎn)入體內(nèi)，應(yīng)能在一定時(shí)間內(nèi)持續(xù)表達(dá)基因產(chǎn) 物，或能通過(guò)某種方法精細(xì)調(diào)節(jié)其表達(dá),3、弱免疫源- 轉(zhuǎn)入后不應(yīng)引起免疫反應(yīng),4、組織靶向性- 定向輸入某種細(xì)胞,5、包裝容量載體對(duì)轉(zhuǎn)染基因的大小應(yīng)沒(méi)有限制,6、復(fù)制、分裂和整合能力：特異性定位整合，或以游離基因形式 存在于細(xì)胞核內(nèi),7、能感染分裂期細(xì)胞和未分裂期細(xì)胞,2、選擇基因載體,基因載體

25、,非病毒載體 （裸DNA、脂質(zhì)體,病毒載體 （反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒,分類(lèi),優(yōu)點(diǎn)： 大量生產(chǎn)，毒性小，低免疫性 缺點(diǎn)：效率低,優(yōu)點(diǎn)：多數(shù)病毒可感染特異細(xì)胞，不易降解， RNA病毒能整合到宿主染色體，表達(dá) 水平高等,病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移,1、逆轉(zhuǎn)錄病毒：正鏈RNA病毒,逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu),基因組組成,1）5帽子；3尾巴,2） 每個(gè)單鏈RNA含6個(gè)區(qū)： 5-LTR（長(zhǎng)末端重復(fù)序列） + （組裝所需的非編碼序列） gag（編碼衣殼結(jié)構(gòu)蛋白基因） pol（編碼反轉(zhuǎn)錄酶基因） env（編碼外殼蛋白基因） 3-LTR,逆轉(zhuǎn)錄病毒生活周期,1、感染靶細(xì)胞,2、利用自身編碼的逆反轉(zhuǎn)錄酶，以RNA為模板合成D

26、NA,3、將病毒DNA轉(zhuǎn)運(yùn)至宿主細(xì)胞核,4、病毒DNA整合到宿主染色體,5、以病毒DNA為模板轉(zhuǎn)錄RNA,6、在細(xì)胞中翻譯Gag、Pol和Env蛋白,7、形成衣殼，RNA單鏈和反轉(zhuǎn)錄酶一起包裝進(jìn)衣殼,8、形成病毒顆粒并分泌到胞外,逆轉(zhuǎn)錄病毒,病毒RNA,宿主細(xì)胞,RT,RT,逆轉(zhuǎn)錄酶,cDNA,雙鏈,插入,基因組DNA,逆轉(zhuǎn)錄病毒感染過(guò)程,病毒RNA,構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,1）構(gòu)建重組野生性病毒：插入相關(guān)外源基因，改造成DNA載體（包括插入選擇性標(biāo)記），替代病毒的編碼基因。 （2）制備輔助細(xì)胞（293T細(xì)胞），為載體DNA提供其喪失的功能。 （3）載體DNA導(dǎo)入輔助細(xì)胞，產(chǎn)生病毒載體。 （4）用

27、病毒載體感染細(xì)胞，外源基因在宿主細(xì)胞中表達(dá),逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的缺陷,1、只能轉(zhuǎn)染處于增殖狀態(tài)的細(xì)胞,2、所攜帶的外源基因不能太大,3、感染依賴(lài)靶細(xì)胞表面受體的限制,4、理論上不擴(kuò)散其它細(xì)胞，但某些情況會(huì)造成 野生型病毒爆發(fā),5、有致細(xì)胞癌變的可能,6、逆轉(zhuǎn)錄病毒不能耐受純化和濃縮過(guò)程,腺相關(guān)病毒(AVV,一種小的、非致病的、單鏈DNA病毒。是從屬病毒，需 要其他基因才能復(fù)制,結(jié)構(gòu)： rep基因編碼病毒的復(fù)制、整合功能所需蛋白 cap基因編碼病毒結(jié)構(gòu)組分 ITRs序列反向末端重復(fù)，定義基因的開(kāi)始和 結(jié)束，制約DNA序列大小，包裹入 衣殼,細(xì)胞對(duì)AVV病毒的親和力高，AVV載體適用范圍廣泛,骨髓細(xì)胞

28、、皮膚成纖維細(xì)胞、肝細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、肌細(xì)胞,選擇原則,1、較堅(jiān)固，耐受處理，易于由人體分離，便于輸 回體內(nèi)。 2、具有增殖優(yōu)勢(shì)，生命周期長(zhǎng)，能存活幾個(gè)月或幾年， 至病人的整個(gè)生命。 3、易于受外源遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)化。 4、在選用病毒載體時(shí)，目的基因具表達(dá)最好具有組織特異 性的細(xì)胞,3、選擇靶細(xì)胞,禁止使用生殖細(xì)胞，只能用體細(xì)胞,1、骨髓細(xì)胞：最被重視和常用的靶細(xì)胞,常用細(xì)胞,優(yōu)點(diǎn)：易接受各種處理、已積累豐富經(jīng)驗(yàn)，多數(shù)遺傳疾病 涉及骨髓細(xì)胞、源自骨髓的細(xì)胞遍布全身,缺點(diǎn)： -骨髓干細(xì)胞含量少（占骨髓細(xì)胞0.1%） -治療基因在核骨髓細(xì)胞表達(dá)時(shí)間短（幾個(gè)月）。 -只有部分干細(xì)胞有活性 -造血干細(xì)胞分化可能導(dǎo)致基因失活。 -有些遺傳疾病與骨髓干細(xì)胞無(wú)關(guān),2、肝細(xì)胞：是許多遺傳代謝缺陷的靶細(xì)胞,3、皮膚細(xì)胞：易于繁殖及轉(zhuǎn)化,4、淋巴細(xì)胞：易采集、分離，大量繁殖，連續(xù) 多次輸入,5、癌細(xì)胞：腫瘤治療常用細(xì)胞,方法,1、物理法,顯微注射法 電穿