分子生物學研究方法

1、分子生物學研究方法,分子生物學研究之所以從20世紀中葉開始得到高速發(fā)展，其中最主要的原因就是現(xiàn)代分子生物學研究方法、特別是基因操作和基因工程技術的進步,DNA分子的切割與連接,核酸分子雜交,凝膠電泳,細胞轉(zhuǎn)化,核酸序列分析,基因的人工合成,基因操作,基因的定點突變,PCR擴增等,核心技術,基因工程是指在體外將核酸分子插入病毒、質(zhì)粒或其它載體分子，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，使之進入原先沒有這類分子的寄主細胞內(nèi)并進行持續(xù)穩(wěn)定的繁殖和表達。 外源核酸分子在另一種不同的寄主細胞中的繁衍與性狀表達的過程. 基因工程技術區(qū)別于其它技術的根本特征：具有跨越天然物種屏障、把來自任何生物的基因置于毫無親緣關系的新的

2、寄主生物細胞之中的能力。 本章將在回顧重組DNA技術史上主要事件的基礎上，討論DNA操作技術、基因克隆的常用載體系統(tǒng)以及基因的分離與鑒定等三個環(huán)節(jié),三大成就,1. 40年代確定了遺傳信息的攜帶者，即基因的分子載體是DNA而不是蛋白質(zhì)，解決了遺傳的物質(zhì)基礎問題,Bacterial Strain,Injection,Results,Living S cells,Living R cells,Heat killed S cells,Heat killed S cells mixed with living R cells,Living S cells in blood sample from dea

3、d mouse,capsule,1928 Frederick Griffith &1944 Oswald Avery Transformation of Streptococcus pneumoniae,1952年Hershey和Chase證實噬菌體DNA侵染細菌實驗,2. 50年代揭示了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半 保留復制機制,解決了基因的自我復制和世代交替問題,X-ray source,Crystallized DNA,Rosalind Franklin,Maurice Wilkins,Photographic film,1953- Franklin & Wilkins,Descrip

4、tion of the 3-D structure of DNA,Francis Crick & James Watson,Conservative Model,Semiconservative Model,Frank Stahl,Matt Meselson,Parent cell,First replication,Second replication,1958 -Matthew Meselson & Franklin Stahl proved that DNA replication in bacteria follows the semiconservative pathway,3. 5

5、0年代末至60年代，相繼提出了中心法則和操縱子學說,成功地破譯了遺傳密碼，充分認識了遺傳信息的流動和表達,Jacob and Monod,但是，如果沒有分離和富集單一DNA分子的技術，科學家就無法對這類物質(zhì)進行直接的生化分析,兩大技術保證,1.DNA的體外切割和連接,1962年Arber 發(fā)現(xiàn)限制性核酸內(nèi)切酶，1967Gellert發(fā)現(xiàn)了 DNA 連接酶DNA ligase covalently links two DNA strands,Herbert Boyer, Stanley Cohen 1972年獲得第一個重組DNA分子,Herbert Boyer,重組DNA實驗中常見的主要工具酶,

6、到目前為止，科學家已經(jīng)幾乎能隨心所欲地把任何DNA分子切割成一系列不連續(xù)的片段，再利用凝膠電泳技術將這些片段按照分子量大小逐一分開，以供下一步研究,1972 - Paul Berg,Produced first recombinant DNA using EcoRI,EcoRI recognition sites,phage DNA,EcoRI cuts DNA into fragments,Sticky end,SV40 DNA,The two fragments stick together by base pairing,DNA ligase,Recombinant DNA,僅僅能在體外

7、利用限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶進行DNA的切割和重組遠不能滿足基因研究的需要。 DNA片段在體外不具備自我復制能力，要想得到足夠量和足夠純度的DNA，必須將它們連接到具備自主復制能力的DNA分子上（載體上），并轉(zhuǎn)入寄主細胞中進行繁殖。 這就是基因克隆，或分子克隆,分子克隆的載體-具備自主復制能力的DNA分子（vector），如病毒、噬菌體和質(zhì)粒等小分子量復制子都可以作為基因?qū)氲妮d體,從此，大腸桿菌就成了分子克隆中最常用的轉(zhuǎn)化受體,1970年Mandel和Higa發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌細胞經(jīng)適量氯化鈣處理后，能有效地吸收噬菌體DNA,1972年，Cohen等人又報道，經(jīng)氯化鈣處理的大腸桿菌細胞同樣

8、能夠攝取質(zhì)粒DNA,1973 - Boyer, Cohen & Chang,Transform E. coli with recombinant plasmid,Stanley Cohen & Annie Chan,Herbert Boyer,Kanamycin resistance gene,Plasmid pSC101,Tetracycline resistance gene,E. coli transformed with recombinant plasmid,Transformed cells plated onto medium with kanamycin and tetracy

9、cline,Only cells with recombinant plasmid survive to produce colonies,表明,1）像pSC101這樣的質(zhì)粒DNA分子可以作為基因克隆的載體，從而把外源DNA導入寄主細胞,2）像非洲爪蟾這樣的高等生物的基因也可以被成功地轉(zhuǎn)移到原核細胞中并實現(xiàn)其功能表達,3）質(zhì)粒DNA-大腸桿菌細胞作為一種成功的基因克隆體系，有可能在重組DNA或基因工程研究中發(fā)揮重要作用,2.DNA的核苷酸序列分析技術,DNA核苷酸序列分析法是在核酸的酶學和生物化學的基礎上創(chuàng)立并發(fā)站起來的一門重要的DNA技術學，這門技術，對于從分子水平上研究基因的結(jié)構(gòu)與功能的關

10、系，以及克隆DNA片斷的操作方面，都有著十分廣泛的使用價值,General process of gene engineering,1. 從生物有機體基因組中，分離出帶有目的基因的DNA片段,2. 將帶有目的基因的外源DNA片段連接到能夠自我復制的并具有選擇記號的載體分子上，形成重組DNA分子,3. 將重組DNA分子轉(zhuǎn)移到適當?shù)氖荏w細胞（亦稱寄主細胞）并與之一起增殖,4. 從大量的細胞繁殖群體中，篩選出獲得了重組DNA分子的受體細胞，并篩選出已經(jīng)得到擴增的目的基因,5. 將目的基因克隆到表達載體上，導入寄主細胞，使之在新的遺傳背景下實現(xiàn)功能表達，研究核酸序列與蛋白質(zhì)功能之間的關系,5.2 DN

11、A操作技術,5.2.1 核酸的凝膠電泳,自從瓊脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝膠被引入核酸研究以來，按分子量大小分離DNA的凝膠電泳技術，已經(jīng)發(fā)展成為一種分析鑒定重組DNA分子及蛋白質(zhì)與核酸相互作用的重要實驗手段，也是現(xiàn)在通用的許多分子生物學研究方法，如： DNA分型、DNA核苷酸序列分析、限制性內(nèi)切酶片段分析以及限制酶切作圖等的技術基礎，受到科學界的高度重視,5.2.1.1 基本原理,一種分子被放置到電場中，它就會以一定的速度移向適當?shù)碾姌O。我們把這種電泳分子在電場作用下的遷移速度，叫做電泳的遷移率，它與電場強度和電泳分子本身所攜帶的凈電荷數(shù)成正比。就是說

12、，電場強度越大，電泳分子所攜帶的凈電荷數(shù)量越多，其遷移的速度越快，反之則較慢。由于在電泳中往往使用無反應活性的穩(wěn)定的支持介質(zhì)，如瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠等，故電泳的遷移率與分子的摩擦系數(shù)成反比。 已知摩擦系數(shù)是分子大小、極性及介質(zhì)粘度的函數(shù)，因此，根據(jù)分子大小的不同、構(gòu)型或形狀的差異以及所帶的凈電荷的多寡，便可以通過電泳將蛋白質(zhì)或核酸分子混合物中的各種成分彼此分離開來,在生理條件下，核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基團，是呈離子化狀態(tài)的，所以，DNA和RNA多核苷酸鏈又被稱為多聚陰離子（polyanions），把這些核酸分子放置在電場當中，它們就會向正電極的方向遷移。由于糖-磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的

13、重復性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速度向正電極方向遷移。在一定的電場強度下，DNA分子的這種遷移速度，亦即電泳的遷移率，取決于核酸分子本身的大小和構(gòu)型,大分子量的DNA 移動的慢,小分子量的DNA 移動的快,電泳緩沖液,陽極,陰極,DNA加樣孔,瓊脂糖凝膠電泳,瓊脂糖凝膠分辨DNA片段的范圍為0.250kb之間,聚丙烯酰胺凝膠電泳,聚丙烯酰胺凝膠，其分辨范圍為1個堿基對到1000個堿基對之間,凝膠的分辨能力同凝膠的類型和濃度有關，凝膠濃度的高低影響凝膠介質(zhì)孔隙的大小，濃度越高，孔隙越小，其分辨能力就越強。反之，濃度降低，孔隙就增大，其分辨能力也就隨之減弱,在

14、凝膠電泳中，加入適量溴化乙錠（ethidium bromide，簡稱EtBr）染料對核酸分子進行染色，然后將電泳標本放置在紫外光下觀察，可十分靈敏而快捷地檢測出凝膠介質(zhì)中DNA的譜帶部位，即使每條DNA帶中僅含有0.05g的微量DNA，也可以被清晰地檢測出來,在紫外線的照射下結(jié)合溴化乙錠的DNA分子發(fā)出熒光,稱樣,溶解,加熱,制板,倒膠,電泳操作基本程序,取樣,點樣,電泳,檢測,結(jié)果,5.2.2 核酸的分子雜交,將帶有互補的特定核苷酸序列的單鏈DNA或RNA混合在一起，其相應的同源區(qū)段就會退火形成雙鏈結(jié)構(gòu)。如果退火的核酸來自不同的生物有機體，所形成的雙鏈分子就被稱為雜種核酸分子,不同溫度下DN

15、A的構(gòu)型變化一,DNA/DNA的雜交作用，可以用來檢測特定生物有機體之間是否存在著親緣關系，而形成DNA/RNA間雜種分子的能力可被用來揭示核酸片段中某一特定基因的位置,不同溫度下DNA的構(gòu)型變化二,在大多數(shù)核酸雜交反應中，經(jīng)過凝膠電泳分離的DNA或RNA分子，都必須通過毛細管或電導作用被轉(zhuǎn)移到濾膜上，而且是按其在凝膠中的位置原封不動地“吸印”上去的，因此，核酸雜交也被稱為“DNA印跡雜交,Southern Blotting E.M. Southern于1975年首先設計出來的,材料：尼龍濾膜 硝酸纖維素濾膜 二乙氨基乙基纖維素濾膜（DEAE,步驟,第一，將分離的核酸樣品轉(zhuǎn)移到固體支持物濾膜上

16、核酸印跡轉(zhuǎn)移,電泳凝膠核酸印跡法,斑點和狹線印跡法,菌落和噬菌斑印跡法,第二，是將具有核酸印跡的濾膜與帶有放射性或其它標記的DNA或RNA探針進行雜交,雜交模式圖,Southern Blotting的過程 1.堿變性的瓊脂糖凝膠電泳分離的DNA 2.通過電泳液的移動轉(zhuǎn)移膠中的DNA 3.固定膠中的DNA 4.預雜交和雜交（放射性和熒光檢測） 5.結(jié)果檢測,在理想條件下，應用放射性同位素標記的特異性探針和放射自顯影技術，即便每帶電泳條帶僅含有2ng的DNA也能被清晰地檢測出來。由于放射性同位素對人體的危害，近年來又發(fā)展了熒光法檢測雜交信號的技術，雖然靈敏度略低于同位素法，卻使核酸雜交實驗變得更為

17、安全,常用的熒光染料,C5、C3等,2.Northern blotting（諾賽恩RNA印跡技術） 是將RNA分子從電泳凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或其他化學修飾的活性濾紙上，進行核酸雜交的一種實驗方法,Northern Hybridization,Isolate mRNA (Different Lengths,Probe with labeled DNA,3.Western blotting（韋斯頓蛋白質(zhì)雜交技術） 將蛋白質(zhì)從電泳凝膠中轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，然后同放射性同位素125I標記的特定蛋白質(zhì)之抗體進行反應,Step 1. Antibody Recognition of target p

18、rotein/antigen,Step 2. Secondary Antibody recognition of primary Ab,Step 3. Color Development,檢測重組體克隆的菌落雜交技術,原位雜交,In situ hybridization,Localization of DNA,Localization of RNA,1.將快速生長中的大腸桿菌置于經(jīng)低溫（0）預處理的低滲氯化鈣溶液中，便會造成細胞膨脹（形成原生質(zhì)球,所謂細菌轉(zhuǎn)化，是指一種細菌菌株由于捕獲了來自另一種細菌菌株的DNA而導致性狀特征發(fā)生遺傳改變的生命過程。提供轉(zhuǎn)化DNA的菌株叫作供體菌株，接受轉(zhuǎn)化D

19、NA的細菌菌株則被稱為受體菌株。 處于能夠接受外源DNA狀態(tài)的細胞稱為感受態(tài)細胞,5.2.3 細菌轉(zhuǎn)化,步驟,2.與轉(zhuǎn)化混合物中的外源DNA形成粘附在細胞表面的復合物。 3.立即將該體系轉(zhuǎn)移到42下做短暫的熱刺激，復合物便會被細胞所吸收。 4.在全培養(yǎng)基中生長一段時間使轉(zhuǎn)化基因?qū)崿F(xiàn)表達、細胞活性恢復 5. 涂布于選擇性培養(yǎng)基中分離轉(zhuǎn)化子,5.2.4基因擴增,聚合酶鏈式反應，即PCR技術，是一種在體外快速擴增特定基因或DNA序列的方法，故又稱為基因的體外擴增法,DNA 聚合酶,具有在核苷酸底物的存在下，以一條DNA鏈為模板催化新鏈的合成 需要具有 3 -OH 的引物 具有 5 到3 方向聚合的能

20、力 通常具有 3到 5 外切酶活性,PCR技術的原理并不復雜,一DNA 體外擴增技術,1.PCR反應體系 1) 基本原理 PCR技術的基本原理類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性-退火-延伸三個基本反應步驟構(gòu)成,PCR Cycle - Step 1 - Denaturation Template DNA by Heat (95oC,Target Sequence,Target Sequence,PCR原理示意圖,模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物

21、結(jié)合，為下輪反應作準備,PCR Cycle - Step 2 Temperature is lowered (Tm ) and primers anneal to target sequences,Target Sequence,Target Sequence,Primer 1,Primer 2,5,3,5,5,3,5,3,3,模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合,PCR Cycle - Step 3 - At 72 o C Taq DNA polymerase catalyses primer extensio

22、n as complementary nucleotides are incorporated,Target Sequence,Target Sequence,Primer 1,Primer 2,5,3,5,5,3,5,3,3,Taq DNA Polymerase,引物的延伸：DNA模板-引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈,End of the 1st PCR Cycle Results in two copies of target sequence,Target Sequence,Target

23、 Sequence,每完成一個循環(huán)需24分鐘， 23小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍,Target Amplification,No. ofNo. Amplicon CyclesCopies of Target 12 24 38 416 532 664 201,048,576 301,073,741,824,1 cycle = 2 Amplicon,2 cycle = 4 Amplicon,3 cycle = 8 Amplicon,4 cycle = 16 Amplicon,5 cycle = 32 Amplicon,6 cycle = 64 Amplicon,7 cycle = 128

24、 Amplicon,2.降低反應溫度（約50），致冷1分鐘，使寡核苷酸引物與兩條單鏈模板DNA發(fā)生退火作用并結(jié)合在靶DNA區(qū)段兩端的互補序列位置上,3.將反應混合物的溫度上升到72左右保溫1-數(shù)分鐘，在DNA聚合酶的作用下，從引物的3-端加入脫氧核苷三磷酸，并沿著模板分子按53方向延伸，合成新生DNA互補鏈,1.首先是將含有待擴增DNA樣品的反應混合物放置在高溫（91）環(huán)境下加熱1分鐘，使雙鏈DNA變性，形成單鏈模板DNA,4.重復以上操作,PCR的過程,一次循環(huán)2,二次循環(huán)4,三次循環(huán)8,兩條引物結(jié)合位點之間的DNA區(qū)段的拷貝數(shù)，理論上的最高值應是2n,PCR儀,5.2.5 核苷酸序列分析,

25、1968年 華裔科學家吳瑞設計出引物延伸測序策略,Sanger在它的基礎之上發(fā)展了快數(shù)測定DNA的末端終止法,K Mullis完善了PCR擴增DNA方法,5.2.5.1. Sanger雙脫氧鏈終止法(dideoxy-termination sequencing) 原理：雙脫氧（2，3）-核苷酸可以象2-脫氧核苷酸那樣直接摻入新合成的DNA鏈中，但因3 端不具OH基，DNA鏈合成至此中斷。由于雙脫氧核苷酸在每個DNA分子中摻入的位置不同，故可根據(jù)不同長度的DNA片段測定出核苷酸序列,不能和下一個核苷酸通過磷酸二酯鍵連接起來,添加 DNA polymerase 所有4 dNTPs 其中一種標記的d

26、dNTP,ddTTP ddCTP ddGTP ddATP,在四個不同的反應管中各只包含一種ddNTP,每一管中的復制的序列都停留在ddNTPs 處,5,反應終止后，四個反應管中的反應混合液分別進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離. 這四個反應管中延伸的寡核苷酸僅相差一個堿基. 電泳結(jié)構(gòu)通過顯色指示,3 C C T T T A G C T 5,過程：制備ss-DNA與引物退火分為4個反應系統(tǒng)每個系統(tǒng)中加入dNTP（其中dATP常帶同位素標記）和一種雙脫氧核苷酸DNA聚合酶定序反應反應產(chǎn)物變性后電泳凝膠干燥放射自顯影。 該法亦適合mRNA的序列分析。 GC富集區(qū)常出現(xiàn)“隱影”或“停止”現(xiàn)象，如在反應中加入d

27、ITP（脫氧三磷酸次黃嘌呤）或脫氧三磷酸-7-脫氧鳥苷可解決GC富集區(qū)的測序,2. DNA定序的一般程序 酶法測序(Sanger) 化學測序法(Maxam-Gilbert) 待測DNA片段 待測DNA片段 次克隆 5-末端標記 篩選重組子 鏈分離 限制酶切 模板增殖與純化 純化標記的ss-DNA 與引物退火 定序反應 定序反應 聚丙烯酰胺凝膠電泳 真空干燥 放射自顯影 閱讀序列和計算機錄入 核苷酸序列的分析與比較,二. DNA序列測定的自動化 1. DNA測序步驟與自動化 1）模板制備 可自動化 2）定序反應 可自動化 3）凝膠電泳 自動化有一定困難：制膠，點樣，電泳，凝膠干燥，放射自顯影。

28、4）核苷酸序列閱讀與計算機輸入 可自動化 2.自動測序儀 Conney等人于1987年設計了不同熒光染料標記引物，然后做鏈終止測序，用激光掃描閱讀序列。 紅色引物+T反應系統(tǒng)（引物+DNA+dNTP+ddTTP） 黃色引物+G反應系統(tǒng)（引物+DNA+dNTP+ddGTP） 綠色引物+A反應系統(tǒng)（引物+DNA+dNTP+ddATP） 蘭色引物+C反應系統(tǒng)（引物+DNA+dNTP+ddCTP,優(yōu)點：i. 四個反應系統(tǒng)可合并點樣，大大節(jié)省制膠和點樣時間； ii. 可同時讀出多個樣品核苷酸序列，不需干燥凝膠和放射自顯影； iii.可連續(xù)電泳，可讀出較多的核苷酸序列。 缺點：無法保留原始記錄, 四個反應

29、產(chǎn)物點在一條道上,相互間會發(fā)生干擾, 導致讀序時分辨率下降,DNA序列分析自動化包括兩個方面的內(nèi)容， 一是指“分析反應”的自動化， 另一方面則是指“讀片過程”的自動化,5.2.5.3.雜交測序,自從70年代末期DNA測序技術問世以來，人們已經(jīng)做了大量重要的改進，但從根本原理上創(chuàng)新的則只有雜交測序法（sequencing by hybridization，SBH）一種。它利用一組已知序列的寡核苷酸短序列作探針，同某一特定的較長的靶DNA分子進行雜交，從而測定其核苷酸的序列,DNA雜交測序?qū)嵸|(zhì)上包括兩個主要的步驟 首先是將待測定的靶DNA分子同一組已知其核苷酸順序的寡核苷酸探針進行雜交，然后與那些

30、能夠同靶DNA形成完全的雙鏈雜合分子的寡核苷酸探針做比較分析，并據(jù)此推算出靶DNA的核苷酸序列,如果將一種核苷酸順序為5-AGCCTAGCTGAA-3的12-mer的靶DNA，與一組完全隨機的8-mer寡核苷酸探針混合雜交，在總數(shù)為48=65 536種的8-mer探針群體中，僅有5種會與靶DNA形成完全互補的雙鏈體分子。根據(jù)這5種發(fā)生了完全雜交作用的8-mer寡核苷酸探針之間的重疊序列的線性關系，便可推算出這段12-mer的靶DNA分子的核苷酸順序,當然，這只是一種理想化狀態(tài)，實際上此種雜交模式要復雜得多，因為那些沒有同靶DNA片段完全互補的寡核苷酸探針，也仍然會與之形成不穩(wěn)定的雙鏈分子,上圖

31、是兩條長度均為17-mer的靶DNA片段I和II的雜交測序結(jié)果，兩者僅在第8位堿基有不同，分別為C和T。靶DNA片段I可與18共8段彼此相互重疊的8-mer寡核苷酸形成完全的雙鏈分子，但不能與第9段8-mer寡核苷酸形成完全的雙鏈分子。根據(jù)相鄰的兩段8-mer寡核苷酸之間各自具有7個堿基的重疊情況，可以構(gòu)建出互補的DNA序列。靶DNA片段II的雜交結(jié)果表明，橫跨其第8位堿基T的6段8-mer寡核苷酸的雙鏈體，由于含有內(nèi)部的堿基錯配，因此其雜交效率明顯下降；但與第1和第8兩段8-mer寡聚體形成的具有末端G-T錯配的雙鏈分子，其穩(wěn)定性下降并不顯著。與第9段8-mer寡核苷酸能雜交形成完全的雙鏈體

32、分子，證實與片段I相比，它在第8位發(fā)生了由C堿基到T堿基的變化,基因芯片測序,基因芯片測序流程,5.2.6.1. 凝膠阻滯試驗 凝膠阻滯試驗（gel retardation assay），又叫作DNA遷移率變動試驗（DNA mobility shift assay），是用于體外研究DNA與蛋白質(zhì)相互作用的一種特殊的凝膠電泳技術。在凝膠電泳中，由于電場的作用，裸露的DNA朝正電極移動的距離與其分子量的對數(shù)成反比。如果此時DNA分子與某種蛋白質(zhì)相結(jié)合，那么，由于分子量增大，它在凝膠中的遷移作用便會受到阻滯，在特定電壓和時間內(nèi)朝正電極移動的距離也就相應縮短了。所以，當某個DNA片段與細胞提取物混合之

33、后，若它在凝膠電泳中的移動距離變小了，就說明它可能已與提取物中的某種特殊蛋白質(zhì)分子相結(jié)合了,5.2.6 DNA與蛋白質(zhì)相互作用研究,凝膠阻滯實驗的基本原理圖 放射性標記的DNA由于與一種細胞蛋白質(zhì)B結(jié)合，于是在凝膠電泳中移動速度變慢，在放射自顯影中呈現(xiàn)滯后的條帶,放射自顯影,凝膠電泳,放射性標記的DNA,細胞蛋白質(zhì)提取物,蛋白質(zhì)與DNA結(jié)合,B,DNA-蛋白質(zhì)結(jié)合物電泳遷移緩慢,滯后帶表明DNA與蛋白質(zhì)結(jié)合,5.2.6.2. DNaseI足跡試驗 在DNaseI足跡試驗（DNA foot-printing assay）過程中，首先將待檢測的雙鏈DNA分子用32P作末端標記，并用限制性內(nèi)切酶去掉

34、其中的一個末端，得到只有一條鏈的單個末端標記的雙鏈DNA分子，與細胞蛋白質(zhì)提取物混合。待二者結(jié)合之后，再加入少量的DNaseI（它可沿著靶DNA作隨機單鏈切割）消化DNA分子，并控制酶的用量使之達到平均每條DNA鏈只發(fā)生一次磷酸二酯鍵斷裂。如果蛋白質(zhì)提取物中不存在與DNA結(jié)合的特異蛋白質(zhì)，經(jīng)DNaseI消化之后便會產(chǎn)生出距放射性標記末端1個、2個、3個核苷酸等等一系列前后長度均僅相差一個核苷酸的連續(xù)的DNA片段梯度群體。 如果有一種蛋白質(zhì)已經(jīng)結(jié)合到DNA分子的某一特定區(qū)段上，那么，它就將保護這一區(qū)段的DNA免受DNaseI的消化作用，因而也就不可能產(chǎn)生出相應長度的切割條帶。在電泳凝膠的放射自顯

35、影圖片上，相應于蛋白質(zhì)結(jié)合的部位是沒有放射標記條帶的，出現(xiàn)了一個空白的區(qū)域，人們形象地稱之為“足跡,32p,1 5 10,1 4 8 10,加入蛋白質(zhì)X,加入DNaseI凝膠電泳放射自顯影,1,5,10,A B,足跡,a,c,b,DNaseI 足跡實驗,5.3 基因克隆的主要載體系統(tǒng),1. 至少有一個復制起點，因而至少可在一種生物體中自主復制。 2.至少應有一個克隆位點，以供外源DNA插入。 3.至少應有一個遺傳標記基因，以指示載體或重組DNA分子是否進入宿主細胞 4.安全性,大腸桿菌載體 pBR322結(jié)構(gòu)圖,載體特點,基因工程載體是一類可供外源DNA插入并攜帶重組DNA分子進入適當宿主細胞自

36、主復制的DNA分子,5.3.1 質(zhì)粒DNA及其分離純化,細菌質(zhì)粒是存在于細胞質(zhì)中的一類獨立于染色體并能自主復制的遺傳成份。絕大多數(shù)的質(zhì)粒都是由環(huán)形雙鏈DNA組成的復制子，也有線性質(zhì)粒 的報道,質(zhì)粒DNA分子可以持續(xù)穩(wěn)定地處于染色體外的游離狀態(tài)，也可能在一定的條件下被可逆性整合到寄主染色體上，隨著染色體的復制而復制，并通過細胞分裂傳遞到后代,應用質(zhì)粒作為基因克隆的載體分子，最重要的前提是要獲得大量純化的質(zhì)粒DNA分子,Ecoli的質(zhì)粒種類 1) colE1因子（大腸桿菌素因子）多數(shù)不能進行接合轉(zhuǎn)移DNA，屬高拷貝松弛型。 2) R因子（抗藥性因子） 可接合轉(zhuǎn)移DNA，屬低拷貝 嚴緊型， 質(zhì)粒較大

37、，操作不便 3) F因子（性因子,關鍵步驟：寄主細胞的裂解作用是分離質(zhì)粒DNA實驗操作,通常加入溶菌酶或十二烷基硫酸鈉（SDS）來促使大腸桿菌細胞裂解。如果寄主細胞沒有完全裂解，就會顯著降低質(zhì)粒DNA的回收率。假如細胞裂解反應相當溫和，同時實驗操作又十分謹慎仔細，那么絕大部分的染色體DNA分子都將以高分子量的形式釋放出來，可以用高速離心的方法使之與細胞碎片一起被沉淀除去，得到高純度的質(zhì)粒DNA,質(zhì)粒載體DNA的分離 關鍵：如何使質(zhì)粒DNA與宿主染色體DNA分開 原理：質(zhì)粒DNA比染色體DNA 小得多，在DNA抽提過程中，染色體DNA斷裂成小片段(線狀)，質(zhì)粒DNA仍保持超螺旋構(gòu)型,變性法： 變

38、性條件可采用加熱煮沸法或堿變性法 上述方法亦可用于ss環(huán)狀病毒DNA RF型的分離, 質(zhì)粒DNA的氯霉素擴增使用并不廣泛（菌株和載體,5.3.1.1. 氯化銫密度梯度離心法,實驗表明，在細胞裂解及DNA分離的過程中，大分子量的細菌染色體DNA容易發(fā)生斷裂形成相應的線性片段，而質(zhì)粒DNA則由于其分子量較小、結(jié)構(gòu)緊密，因此仍能保持完整的狀態(tài)。這種差別對質(zhì)粒DNA的純化是十分有用的,5.3.1.2. 堿變性法,通過氯化銫-EtBr密度梯度離心法雖然可以得到高純度、高質(zhì)量的質(zhì)粒DNA，但它操作復雜，需要價格昂貴的氯化銫和超速離心機設備，而且溴化乙錠又是一種致癌物質(zhì)，如果操作不慎，不僅會造成環(huán)境污染，還

39、會危及實驗工作人員的身心健康。 實驗觀察發(fā)現(xiàn)，在pH值介于12.012.5的條件下加熱DNA溶液，使染色體DNA變?yōu)閱捂湥|(zhì)粒DNA仍保持環(huán)狀結(jié)構(gòu)，當變性條件發(fā)生迅速變化時，前者仍不能復性，而后者又可回復到天然構(gòu)型。 隨機斷裂產(chǎn)生的線性染色體DNA分子，彼此已經(jīng)分離的互補鏈之間的復性作用就不會那么迅速而準確，往往聚集形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，與變性的蛋白質(zhì)及RNA一道被離心沉淀下來。 用酒精沉淀法可以收集仍然滯留在上清液中的質(zhì)粒DNA,5.3.2 重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體,5.3.2.1. pSC101質(zhì)粒載體,pSC101是一種嚴緊型復制控制的低拷貝數(shù)的大腸桿菌質(zhì)粒載體，平均每個寄主細胞僅有12個拷貝。

40、其分子大小為9.09kb，編碼有一個四環(huán)素抗性基因（tetr）。 pSC101質(zhì)粒不僅具有可插入外源DNA的多個限制性核酸內(nèi)切酶的單克隆位點，而且還具有四環(huán)素抗性的強選擇記號，因此，它被選為第一個真核基因的克隆載體。當然，這個質(zhì)粒載體也有其明顯的缺點，它是一種嚴緊型復制控制的低拷貝質(zhì)粒，從帶有該質(zhì)粒的寄主細胞中提取pSC101 DNA，其產(chǎn)量就要比其它質(zhì)粒載體低得多,5.3.2.2.ColE1質(zhì)粒載體,ColE1質(zhì)粒屬于松弛型復制控制的多拷貝質(zhì)粒。在正常生長條件下，當培養(yǎng)基中用于蛋白質(zhì)合成的氨基酸被耗盡，或是在對數(shù)生長末期的細胞培養(yǎng)物中加入氯霉素以抑制蛋白質(zhì)的合成，寄主染色體DNA的復制便被抑

41、制，細胞的生長也隨之停止。此時，松弛型復制控制的質(zhì)粒DNA仍然可以繼續(xù)進行復制達數(shù)小時之久，使每個寄主細胞中所累積的ColE1質(zhì)?？截悢?shù)增加到10003000個之多，質(zhì)粒DNA大約可占細胞總DNA的50%左右。由此可見，由于質(zhì)粒拷貝數(shù)高，插入的外源DNA片段的產(chǎn)量也就得到相應的提高,5.3.2.3. pBR322質(zhì)粒載體,為改進轉(zhuǎn)化子篩選技術，有必要用人工的方法構(gòu)建一種既帶有多種抗藥性的強選擇記號、又具有低分子量、高拷貝、以及外源DNA插入不影響復制功能的多種限制性核酸內(nèi)切酶單切割位點等優(yōu)點的新的質(zhì)粒載體,pBR322質(zhì)粒是由三個不同來源的部分組成的： 第一部分來源于pSF2124質(zhì)粒轉(zhuǎn)座子T

42、n3的氨芐青霉素抗性基因（ampr）； 第二部分來源于pSC101質(zhì)粒的四環(huán)素抗性基因（tertr）； 第三部分則來源于ColE1的派生質(zhì)粒pMB1的DNA復制起點（ori,第一個優(yōu)點：具有較小的分子量，其長度為4,363bp。由于分子量小，不僅易于純化，而且即使攜帶上一段6-8kb的外源DNA片段，操作起來仍較為便利。 第二個優(yōu)點：具有兩種抗生素抗性基因以用作轉(zhuǎn)化子的選擇記號。質(zhì)粒DNA編碼的抗生素抗性基因的插入失活效應，是檢測重組體質(zhì)粒的一種十分有用的方法。 第三個優(yōu)點：具較高的拷貝數(shù)，若經(jīng)過氯霉素擴增，每個細胞中可累積10003000個拷貝，為重組體DNA的制備提供了極大的方便,pBR3

43、22質(zhì)粒載體的優(yōu)點,5.3.2.4.pUC質(zhì)粒載體,pUC系列質(zhì)粒載體包括如下四個部分： (i)來自pBR322質(zhì)粒的復制起點（ori）； (ii)氨芐青霉素抗性基因（ampr），但它的核苷酸序列已經(jīng)發(fā)生了變化，不再含有原來的限制性核酸內(nèi)切酶的單識別位點； (iii)大腸桿菌-半乳糖酶基因（lacZ）的啟動子及其編碼-肽鏈的DNA序列，此結(jié)構(gòu)特稱為lacZ基因； (iv)位于lacZ基因中的靠近5-端的一段多克隆位點（MCS）區(qū)段，它并不破壞該基因的功能,第一，更小的分子量和更高的拷貝數(shù)。在pBR322基礎上構(gòu)建pUC質(zhì)粒載體時，僅保留下其中的氨芐青霉素抗性基因及復制起點，使其分子縮小了許多，

44、如pUC8為2 750bp，pUC18為2 686bp。同時，由于rop基因缺失，使pUC8質(zhì)粒的拷貝數(shù)比帶有pMB1或ColE1復制起點的質(zhì)粒載體都要高得多，不經(jīng)氯霉素擴增，平均每個細胞即可達500700個拷貝。 第二，可用組織化學方法檢測重組體。pUC8質(zhì)粒結(jié)構(gòu)中具有來自大腸桿菌lac操縱子的lacZ基因，所編碼的-肽鏈可參與-互補作用。因此，可用X-gal顯色法實現(xiàn)對重組體轉(zhuǎn)化子的鑒定。 第三，具有多克隆位點MCS區(qū)段，可以把具兩種不同粘性末端（如EcoRI和BamHI）的外源DNA片段直接克隆到pUC8質(zhì)粒載體上,pUC質(zhì)粒載體優(yōu)點,5.3.2.5. pGEM-3Z質(zhì)粒,pGEM-3Z

45、是一種與pUC系列十分類似的小分子質(zhì)粒載體，總長度為2,743bp，編碼有一個氨芐青霉素抗性基因和一個lacZ基因。 pGEM-3Z具有兩個來自噬菌體的啟動子，即T7啟動子和SP6啟動子，它們?yōu)镽NA聚合酶的附著作用提供了特異性的識別位點。由于這兩個啟動子分別位于lacZ基因中多克隆位點區(qū)的兩側(cè)，故若在反應試管中加入純化的T7或SP6 RNA聚合酶，所克隆的外源基因便會轉(zhuǎn)錄出相應的mRNA。質(zhì)粒載體pGEM-4Z和pGEM-3Z在結(jié)構(gòu)上基本相似，兩者之間的差別僅僅在于SP6和T7這兩個啟動子的位置互換、取向相反而已,5.3.2.6. 穿梭質(zhì)粒載體,所謂穿梭質(zhì)粒載體（shuttle plasmi

46、d vector），是指一類由人工構(gòu)建的具有兩種不同復制起點和選擇記號，因而可在兩種不同的寄主細胞中存活和復制的質(zhì)粒載體。 早期發(fā)展的大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒載體，大多是由這兩種細菌的質(zhì)粒載體融合構(gòu)建的。例如，pHV14是由pBR322和pC194融合而成，pEB10是由pBR322和pUB110融合而成的,大腸桿菌-釀酒酵母穿梭質(zhì)粒載體，含有兩種分別來自大腸桿菌和釀酒酵母的復制起點與選擇標記。它使研究工作者可以自如地在這兩種不同的寄主細胞之間來回轉(zhuǎn)移基因，并單獨或同時在兩種寄主細胞中研究目的基因的表達活性及其它調(diào)節(jié)功能。例如，可將酵母的某種基因亞克隆到穿梭質(zhì)粒載體上，置于大腸桿菌中進行

47、定點突變處理后，再把突變體基因返回到酵母細胞，以便在天然寄主中觀察研究此種突變的功能效應,大腸桿菌-釀酒酵母穿梭載體,5.3.3 噬菌體載體,噬菌體是一類細菌病毒的總稱，英文名叫作Bacteriophage，來源于希臘文“phagos”，如同質(zhì)粒分子一樣，噬菌體也可以用于克隆和擴增特定的DNA片段，是一種良好的基因克隆載體。作為細菌寄生物的噬菌體，它可以在脫離寄主細胞的狀態(tài)下保持自己的生命，但一旦脫離了寄主細胞，就既不能生長也不能復制，因為大多數(shù)的噬菌體只能利用寄主核糖體、合成蛋白質(zhì)的因子、各種氨基酸及能量代謝體系進行生長和增殖,我們將只具有溶菌生長周期的噬菌體叫作烈性噬菌體。而溶源生長周期是

48、指在感染過程中沒有產(chǎn)生出子代噬菌體顆粒，噬菌體DNA被整合到寄主細胞染色體DNA上，成為它的一個組成部分。具有這種溶源周期的噬菌體，叫作溫和噬菌體,以噬菌體DNA分子作載體，克隆含有目的基因的外源DNA片段，如果沒有導致重要的噬菌體基因失活，那么當這種重組的噬菌體DNA分子感染了寄主細胞之后，插入的外源DNA片段便會隨著噬菌體DNA分子一道增殖。用放射性同位素32P標記的特異性探針作噬菌斑放射自顯影雜交，可以十分敏感地檢測出含有這種重組體DNA分子的噬菌斑（即陽性斑點）。獲得了陽性噬菌斑之后，我們就可按照類似于制備質(zhì)粒DNA的方法，分離到大量的重組體噬菌體DNA，實現(xiàn)克隆基因的擴增,噬菌體可被

49、分為溶菌周期和溶源周期兩種不同的類型,噬菌體整個基因組可分為三個部分 左臂：從A到J長約20kb，其中的基因編碼構(gòu)成頭部、尾部、尾絲對組裝完整噬菌體所需要的蛋白質(zhì)。 中段：長約20kb，是DNA整合和切出，溶原生長所需的序列。 右臂：長約10kb，是調(diào)控區(qū)，控制溶菌和溶原生長最重要的調(diào)控基因和序列、以及DNA復制起始均在這區(qū)域內(nèi)。 左右臂包含DNA復制、噬菌體結(jié)構(gòu)蛋白合成、組裝成熟噬菌體、溶菌生長所需全部序列；對溶菌生長來說，中段是非必需的,在噬菌體線性雙鏈DNA分子的兩端，各有一條由12個核苷酸組成的彼此完全互補的5單鏈突出序列，即通常所說的粘性末端。注入到感染寄主細胞內(nèi)的噬菌體的線性DNA

50、分子，會迅速地通過粘性末端之間的互補作用，形成環(huán)形雙鏈DNA分子。隨后在DNA連接酶的作用下，將相鄰的5-P和3-OH基團封閉起來，并進一步超盤繞。這種粘性末端結(jié)合形成的雙鏈區(qū)段稱為cos位點（cohesive-end site，粘性末端位點,5.3.3.1.插入型載體 外源的DNA克隆到插入型載體分子上，就會使噬菌體的某種生物功能喪失效力，即所謂的插入失活效應。根據(jù)插入失活效應的特異性，插入型載體又可以進一步被分為免疫功能失活和大腸桿菌-半乳糖苷酶失活兩種亞型。 (1) 免疫功能失活插入型載體。這類載體的基因組中有一段免疫區(qū)，其中帶有一兩種限制性核酸內(nèi)切酶的單切割位點。當外源DNA片段插入到

51、這種位點上時，就會破壞載體所具有的合成功能性阻遏物的能力，阻礙其進入溶源周期。因此，凡帶有外源DNA插入的重組體都只能形成清晰的噬菌斑，而沒有外源DNA插入的親本噬菌體就會形成混濁的噬菌斑。這種形態(tài)學上的差異，為分離重組體分子提供了方便的標志。 (2) -半乳糖甙酶失活插入型載體。許多種載體的基因組中含有大腸桿菌的lacZ區(qū)段，編碼-半乳糖苷酶基因lacZ。由這種載體感染大腸桿菌的lac-指示菌，涂布在補加有IPTG和X-gal的培養(yǎng)基平板上，會形成藍色的噬菌斑，但在克隆過程中，如果外源DNA插入到lacz區(qū)段上，阻斷了-半乳糖苷酶基因lacZ的編碼序列，那么由這種重組體感染的lac-指示菌，

52、由于不能合成-半乳糖苷酶，只能形成無色的噬菌斑,5.3.3.2.替換型載體 替換型載體又叫作取代型載體（substitution vector）是一類在噬菌體基礎上改建的、在其中央部分有一個可以被外源插入DNA分子所取代的DNA片段的克隆載體。在構(gòu)建此類載體時，安排在中央可取代片段兩側(cè)的多克隆位點是反向重復序列，因此當外源DNA插入時，一對克隆位點之間的DNA片段便會被置換掉，從而有效地提高了克隆外源DNA片段的能力,cosmid”一詞是由英文“cos site-carrying plasmid”縮寫而成的，其原意是指帶有粘性末端位點的質(zhì)粒。因此我們說，所謂柯斯質(zhì)粒其實是一類由人工構(gòu)建的含有D

53、NA的cos序列和質(zhì)粒復制子的特殊類型的質(zhì)粒載體。在柯斯質(zhì)粒載體pHC79中，除cos位點之外，其兩側(cè)還具有與噬菌體包裝有關的DNA短序列。質(zhì)粒DNA部分則是一個完整的復制子，包括一個復制起點和兩個抗菌素抗性基因ampr和tetr。很明顯，pHC79柯斯質(zhì)粒兼具了噬菌體載體和pBR322質(zhì)粒載體兩方面的優(yōu)點，其克隆能力為3145kb，而且能夠被包裝成為具有感染能力的噬菌體顆粒,5.3.4 柯斯質(zhì)粒載體,第一，具有噬菌體的特性?？滤官|(zhì)粒載體在克隆了合適長度的外源DNA，并在體外被包裝成噬菌體顆粒之后，可以高效轉(zhuǎn)染對噬菌體敏感的大腸桿菌寄主細胞。進入寄主細胞之后的柯斯質(zhì)粒DNA分子，能按照噬菌體D

54、NA同樣的方式環(huán)化。 第二，具有質(zhì)粒載體的特性?？滤官|(zhì)粒載體具有質(zhì)粒復制子，因此能像質(zhì)粒DNA一樣在寄主細胞內(nèi)進行復制，并且能在氯霉素作用下，獲得進一步擴增。此外，柯斯質(zhì)粒載體通常也都具有抗菌素抗性基因，可供作重組體分子表型選擇標記，其中有一些還帶上基因插入失活的克隆位點。 第三，具有高容量的克隆能力?？滤官|(zhì)粒載體的分子僅具有一個復制起點，一兩個選擇記號和cos位點等三個組成部分，其分子量較小，一般只有57kb左右。因此，可以插入到柯斯質(zhì)粒載體上并能被包裝成噬菌體顆粒的最大外源DNA片段，即柯斯質(zhì)粒載體的克隆極限可達45kb左右,柯斯質(zhì)粒載體的特點,pBluescript是專用的商品名稱，系指

55、由Stratagene公司發(fā)展的一類從pUC載體派生而來的噬菌粒載體，簡稱為pBS（+/-），如今則更多地叫作pBluescript KS（+/-）或pBluescript SK（+/-）。 SK表示多克隆位點區(qū)的一種取向，即lacZ基因是按照SacIKpnI的方向轉(zhuǎn)錄；（+/ -）表示單鏈噬菌體f1復制起點的兩種相反的取向。f1（+）起點表示當pBluescript噬菌粒載體和輔助噬菌體共感染寄主細胞時，能夠回收到lacZ基因的有意義鏈DNA；而f1（-）起點則表示當pBluesript噬菌粒載體與輔助噬菌體共感染寄主細胞時，可回收到lacZ基因的無意義鏈DNA,5.3.5 pBluescr

56、ipt噬菌粒載體,i) 在多克隆位點區(qū)（MCS）的兩側(cè)，存在一對T3和T7噬菌體的啟動子，用以定向指導插入在多克隆位點上的外源基因的轉(zhuǎn)錄活動； (ii) 同時具有一個單鏈噬菌體M13或f1的復制起點和一個來自ColE1質(zhì)粒的復制起點，保證pBluescript噬菌粒載體在有或無輔助噬菌體共感染的不同情況下，按照不同的復制形式分別合成出單鏈或雙鏈DNA； (iii) 編碼有一個氨芐青霉素抗性基因，作為轉(zhuǎn)化子克隆的選擇標記； (iv) 含有一個lacZ基因，可以按照X-gal-IPTG組織化學顯色法篩選噬菌粒載體的重組子,5.4 基因的分離與鑒定,克?。?多細胞的高等生物個體水平上:表示由具有相同

57、基因型的同一物種的兩個或數(shù)個個體組成的群體，所以說，從同一受精卵分裂而來的單卵雙生子（monozygotic twins）便是屬于同一克隆。 在細胞水平上:指由同一個祖細胞（progenitor cell）分裂而來的一群遺傳上同一的子細胞群體。 基本步驟： (1) 用于基因克隆的DNA材料的選擇以及DNA分子的片段化；(2) 外源DNA片段與載體分子的體外連接反應；(3) 將人工重組的DNA分子導入它們能夠進行正常復制的寄主細胞；(4) 重組體分子的轉(zhuǎn)化子克隆的選擇或篩選,克隆基因的分離,1、應用核酸探針分離克隆目的基因 2、應用mRNA差別顯示技術分離克隆目的基因 3、應用cDNA差示分析法

58、克隆基因 4、應用酵母雙雜交體系克隆基因 5、基因的圖位克隆法 6、DNA微列陣技術進行基因克隆,基因克隆的第一步是要從實驗材料中制備包括“目的基因”在內(nèi)的DNA片段群體，而且這個DNA片段群體必須包容整個基因組的全部序列，DNA片段的大小要適合于基因操作的要求。最簡單的辦法是利用限制性核酸內(nèi)切酶消化供體基因組DNA，并直接將消化產(chǎn)物與載體分子相連接。這個被稱為鳥槍法（shot-gun approach）的方法最明顯的缺點，是所形成的重組體分子帶有大小不同的插入片段。由于高等真核生物的基因組龐大，按一般載體承受外源DNA插入能力（大約為10003000bp）計算，能產(chǎn)生幾十萬個大小不同的DNA

59、片段，形成由幾十萬個大小不同的重組體分子組成的克隆群體。要想從如此巨大的群體中，選出帶有目的基因的克隆，顯然是十分費事的。為了克服上述困難，有人建議采用局部雙酶消化法，保證DNA產(chǎn)物大小在10-30kb左右，通過蔗糖梯度離心或制備凝膠電泳技術，得到分子量約為20kb的隨機群體并將其克隆到合適的載體上,5.4.1 DNA片段的產(chǎn)生與分離,5.4.2 重組體DNA分子的構(gòu)建,5.4.2.1.外源DNA片段定向插入載體分子 若用兩種不同的限制性核酸內(nèi)切酶同時消化一種特定的DNA分子，將產(chǎn)生具有兩種不同粘性末端的DNA片段。因此，如果載體分子和待克隆的DNA分子都是用同一對限制性核酸內(nèi)切酶切割，那么，

60、載體分子和外源DNA片段將按一種取向退火形成重組DNA分子，從而保證外源DNA片段定向插入載體分子。事實上，載體分子和外源DNA插入片段（或稱供體DNA），并不一定總能產(chǎn)生出互補的粘性末端，所以，有時采用平末端連接法或采用附加銜接物的辦法來提高平末端之間的連接效率,5.4.2.2.最佳連接反應,為了使連接反應物中的外源DNA片段都能插入載體分子形成重組DNA，必須設法阻止經(jīng)限制性內(nèi)切酶切割后的線性載體分子的自身再環(huán)化作用，以提高DNA片段的插入效率。目前常用堿性磷酸酯酶處理由內(nèi)切酶消化產(chǎn)生的線性載體分子，除去該DNA的5-P末端，而留下一個5-OH基團。經(jīng)堿性磷酸酯酶處理過的線性載體分子，除非