分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)操作.ppt

1、a,1,重組人白介素-18(rhIL-18)基因工程菌的構(gòu)建,分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)-實(shí)驗(yàn)操作,a,2,基因、載體、受體菌株,基因,載體,菌株,質(zhì)粒,酶切連接,轉(zhuǎn)化,質(zhì)粒提取,PCR,a,3,實(shí)驗(yàn)技術(shù)要求,應(yīng)掌握的實(shí)驗(yàn)技術(shù) 酶切,連接 凝膠回收 制備感受態(tài)細(xì)胞 質(zhì)粒提取 PCR 瓊脂糖凝膠電泳,考察指標(biāo) 電泳 電泳 感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化率 電泳 電泳 電泳,a,4,實(shí)驗(yàn)流程: 第一天,rhIL-18基因的PCR產(chǎn)物,質(zhì)粒pUC18,Bgl和Pst雙酶切,BamH和Pst雙酶切,濃度1%瓊脂糖凝膠電泳,凝膠回收,配制 LB 液體與固體平板培養(yǎng)基,滅菌,a,5,實(shí)驗(yàn)流程: 第二天,凝膠回收與溶液回收,電泳檢驗(yàn),

2、T4連接酶連接過(guò)夜,E .coli DH5菌株 37過(guò)夜培養(yǎng),a,6,實(shí)驗(yàn)流程: 第三天,提取質(zhì)粒DNA,濃度1%瓊脂糖凝膠電泳,a,7,實(shí)驗(yàn)流程: 第四天,PCR,濃度1%瓊脂糖凝膠電泳,a,8,雙酶切反應(yīng)（20L體系,rhIL-18的PCR產(chǎn)物 PCR產(chǎn)物 10L Buffer O 2L 無(wú)菌水 7L Bgl 0.5L Pst 0.5L,質(zhì)粒pUC18 質(zhì)粒 10L BamH Buffer 2L 無(wú)菌水 6.7L BamH 0.3L Pst 1L,37酶切反應(yīng)3小時(shí),a,9,Hybrid site,a,10,培養(yǎng)基配制,LB液體培養(yǎng)基 每1L配量： 蛋白胨 10g 酵母提取物 5g 氯化鈉

3、 5g 調(diào)節(jié)pH到7.0 LB固體培養(yǎng)基: 每100ml液體培養(yǎng)基添加1.5g瓊脂 每組準(zhǔn)備： 1個(gè)30ml 液體培養(yǎng)基,a,11,滅菌,1個(gè)30ml LB 液體培養(yǎng)基 微量移液器槍頭（200uL,a,12,瓊脂糖電泳,瓊脂糖凝膠電泳是分離鑒定和純化DNA 片段的標(biāo)準(zhǔn)方法。 DNA 的分子大小 瓊脂糖濃度 DNA 分子的構(gòu)象 電源電壓 嵌入染料的存在 離子強(qiáng)度影響,a,13,瓊脂糖凝膠回收,瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)，回收酶切產(chǎn)物：使用UNIQ-10柱式凝膠回收試劑盒 分別對(duì)： 目的基因片段（0.5Kb片段）溶液回收 載體片段（2.7Kb片段）進(jìn)行凝膠回收,a,14,1.通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳將目的DNA

4、片段與其他片段盡可能分開(kāi)，然后用干凈的手術(shù)刀切下含需回收DNA的瓊脂塊，放入Ep管。 2.按300L/100mg（3:1）的比例加入 Binding Buffer，置于50-60水浴中10min，使凝膠徹底融化。期間，每2 min混勻一次。 3.將融化的溶膠液轉(zhuǎn)移到套在 2-ml 收集管的UNIQ-10柱中，室溫放置 2 min。12000 rpm 室溫離心 1 min。 4.取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的廢液，將UNIQ-10柱放入同一個(gè)收集管中，加入500L Wash Solution，12000 rpm 室溫離心 1 min。 5.重復(fù)步驟4一次,瓊脂糖凝膠回收,a,15,6.取下

5、UNIQ-10柱，倒掉收集管中的廢液，將 UNIQ-10 柱放入同一個(gè)收集管中，12000 rpm 室溫離心 2 min。 7.將 UNIQ-10 柱放入一根新的 Ep 管中，在柱子膜中央加30L Elution Buffer，60放置 5min。 8.12000 rpm 室溫離心 1 min ，離心管中的液體即為回收的DNA片段。 從溶液中回收DNA： 根據(jù)溶液的體積，加入 3 倍體積的 Binding Buffer混勻。 以下操作參照瓊脂糖凝膠中回收DNA步驟3-8,a,16,計(jì)算基因與載體片段比例,紫外下觀察基因與載體片段的亮度 基因的摩爾數(shù)基因片段亮度/堿基數(shù)（495bp） 載體的摩爾

6、數(shù)載體片段亮度/堿基數(shù)（2700bp） 基因摩爾數(shù)/載體摩爾數(shù) 最佳比例是3：1,a,17,連接反應(yīng),在滅菌的0.2mL離心管（PCR管）中進(jìn)行 20L體積反應(yīng)體系中： 10快速連接緩沖液 2L rhIL-18雙酶切產(chǎn)物 X L 質(zhì)粒pUC18雙酶切產(chǎn)物 Y L T4-DNA連接酶 1L 201h，4 過(guò)夜,a,18,感受態(tài)菌的制備,1）E.coli DH5菌株37過(guò)夜培養(yǎng)以復(fù)蘇菌種，取過(guò)夜培養(yǎng)的菌液0.3mL加入到30 mL LB培養(yǎng)基中，37，230 r/min振蕩培養(yǎng)3 h，至OD600約為0.4左右。 （2）無(wú)菌條件下，將50mL菌液轉(zhuǎn)移至離心管中，冰上放置10 min，使培養(yǎng)物冷卻至

7、0。 （3）在預(yù)冷4的離心機(jī)上以4000r/min離心10min，棄去上清，加入30mL預(yù)冷的0.1mol/L CaCl2溶液重懸沉淀，冰浴上放置10 min。 （4）以4000r/min在4離心10min，棄去上清，每30mL初始培養(yǎng)物用1.0mL預(yù)冷的0.1mol/LCaCl2溶液重懸細(xì)胞沉淀，200L/管分裝,a,19,pUC18-hIL-18重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化,1）向分裝有200LE.coli DH5菌株感受態(tài)細(xì)胞的EP管中加入10L的上步中得到的連接混合物，輕輕旋轉(zhuǎn)以混合內(nèi)容物，冰浴上放置30 min。 （2）將該EP管放入預(yù)加溫至42的水浴中，放置90s，快速轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻1

8、2 min。 （3）向EP管加入800 L LB培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移至37搖床上，150r/min，溫育45 min以復(fù)蘇菌株,a,20,4）將200L上述培養(yǎng)物加到含100g/mL氨卞青霉素的LB平板上，以玻璃涂布棒輕輕地將轉(zhuǎn)化細(xì)胞平鋪于瓊脂平板表面。 （5）將平板置于室溫下至液體被完全吸收，倒置平皿，37過(guò)夜培養(yǎng)，篩選鑒定,a,21,UNIQ-10柱式質(zhì)粒小量抽提,1 將過(guò)夜培養(yǎng)的12ml細(xì)菌12,000rpm離心1 min，徹底去除上清。 2 加入250l Solution I，用槍頭或振蕩器充分懸浮細(xì)菌。 3 加入250 l Solution II，立即溫和混勻（傾斜45度角，順一個(gè)方向，慢慢

9、旋轉(zhuǎn)離心管），使細(xì)菌裂解，室溫放置2分鐘。 4 加入350l Solution III，立即上下顛倒510次，使之充分中和，室溫放置5分鐘。 5 12,000rpm，離心10分鐘。 6 將步驟5中上清轉(zhuǎn)移到套放于2.0ml收集管內(nèi)的UNIQ-10柱中，室溫放置2 min后，8,000rpm室溫離心1 min。 7 棄收集管中的廢液，將UNIQ-10柱放入同一支收集管中，吸取500l Wash Solution到UNIQ-10柱，10,000rpm室溫離心1 min。 8 重復(fù)步驟7。 9 棄收集管中的廢液，將UNIQ-10柱放入同一支收集管中，12,000rpm室溫離心2 min以徹底去除Wa

10、sh Solution。 10 將UNIQ-10柱放入新的潔凈1.5ml離心管中，加30l Elution Buffer，60放置10 min后，10,000rpm室溫離心1分鐘。離心管中的溶液即為所抽提的質(zhì)粒DNA,a,22,PCR鑒定陽(yáng)性克隆原理,a,23,PCR鑒定,1、調(diào)整模板（ 待鑒定質(zhì)粒）濃度至 5 ng/ L 2、按下列體系配制反應(yīng)混合液，混勻， Template DNA 1.0 L 10 PCR buffer 2.0 L MgCl2（25mmol/L） 1.5 L M13 Primer M4 (10mol/L) 0.5 L M13 Primer RV(10mol/L) 0.5 L dNTPs （2mmol/L） 2.0 L Taq酶 （5U/L） 0.5L 加ddH2O至 20L,外源基因的特異引物： 引物M13 Primer M4:（5-GTTTTCCCAGTCACGAC-3） 引物M13 Primer RV: （ 5-CAGGAAACAGCTAAC-3,a