PCR常見問題分析及解決策略ppt課件

1、PCR常見問題、原因分析及其對策,PCR技術(shù)簡介,PCR常見問題、原因分析及其解決方案,提高PCR反應(yīng)特異性的策略,臨床PCR檢測的常見問題,定量PCR常見問題,PCR標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系,DNA模板 引物 反應(yīng)緩沖液 Mg 2濃度 dNTPs dH2O 耐熱聚合酶,反應(yīng)體系對PCR擴(kuò)增的影響,DNA模板,純 度 蛋白、多糖、酚類等雜質(zhì)會抑制PCR反應(yīng) 完整性 模板降解會導(dǎo)致PCR擴(kuò)增無產(chǎn)物 濃 度 加量過多導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增增加,引 物,特異性 長度適當(dāng)、避免二級結(jié)構(gòu)和二聚體 完整性 避免反復(fù)凍融 濃 度 應(yīng)適當(dāng),過高導(dǎo)致非特異性增加, 過低則擴(kuò)增產(chǎn)物 太少,反應(yīng)體系對PCR擴(kuò)增的影響,過高非特異性嚴(yán)

2、重 過低無擴(kuò)增產(chǎn)物,濃度適當(dāng) 避免反復(fù)凍融,pH值適當(dāng) 避免污染,pH值,鹽離子濃度 穩(wěn)定劑,增強(qiáng)劑,反應(yīng)緩沖液,dNTPs,dH2O,Mg 2濃度,如何選擇最合適的DNA聚合酶,PCR用耐熱DNA聚合酶,Taq酶,pfu酶,Hotstart Taq酶,混合酶,Taq plus,Long Taq,Taq platinum,特異性-基因組擴(kuò)增、RT-PCR,保真性-基因篩選、測序、克隆,長片段擴(kuò)增-構(gòu)建基因圖譜、測序等,擴(kuò)增效率-復(fù)雜模板擴(kuò)增（GC含量高、二級結(jié)構(gòu),PCR試劑盒-復(fù)雜模板擴(kuò)增、大規(guī)?；驒z測,如何選擇最合適的DNA聚合酶 -根據(jù)PCR實(shí)驗(yàn)需求,PCR常見問題之一-無擴(kuò)增產(chǎn)物,現(xiàn)象

3、：正對照有條帶，而樣品則無,M 1 2 正對照,原 因,模板含有抑制物，含量低 Buffer對樣品不合適 引物設(shè)計不當(dāng)或者發(fā)生降解 反應(yīng)條件：退火溫度太高，延伸時間太短,純化模板或者使用試劑盒提取模板DNA或加大模板的用量 更換Buffer或調(diào)整濃度 重新設(shè)計引物（避免鏈間二聚體和鏈內(nèi)二級結(jié)構(gòu)）或者換一管新引物 降低退火溫度、延長延伸時間,對策,PCR常見問題之二-非特異性擴(kuò)增,現(xiàn)象： PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計的大小不一致，或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶,原 因,對策,引物特異性差 模板或引物濃度過高 酶量過多 Mg2+濃度偏高 退火溫度偏低 循環(huán)次數(shù)過多,重新設(shè)計引物

4、或者使用巢式PCR 適當(dāng)降低模板或引物濃度 適當(dāng)減少酶量 降低鎂離子濃度 適當(dāng)提高退火溫度或使用二階段溫度法 減少循環(huán)次數(shù),PCR常見問題之三-拖尾,現(xiàn)象：產(chǎn)物在凝膠上呈Smear狀態(tài),M 1 2,原 因,對策,模板不純 Buffer不合適 退火溫度偏低 酶量過多 dNTP、Mg2+濃度偏高 循環(huán)次數(shù)過多,純化模板 更換Buffer 適當(dāng)提高退火溫度 適量用酶 適當(dāng)降低dNTP和鎂離子的濃度 減少循環(huán)次數(shù),PCR常見問題之四-假陽性,現(xiàn)象：空白對照出現(xiàn)目的擴(kuò)增產(chǎn)物,原 因,靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染,對策,操作時應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外； 除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所

5、有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及加樣槍頭等均應(yīng)一次性使用。 各種試劑最好先進(jìn)行分裝，然后低溫貯存,提高PCR反應(yīng)特異性策略,巢式PCR（Nest-PCR,遞減PCR（TouchDown PCR,熱啟動PCR（HotStart PCR,使用PCR增強(qiáng)劑,策略之一巢式PCR,PR1,PF2,PR2,巢式PCR的使用降低了擴(kuò)增多個靶位點(diǎn)的可能性，因?yàn)橥嗵滓锒蓟パa(bǔ)的靶序列很少。 巢式PCR可以增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的靈敏度，并且提高了困難PCR（如5 RACE）的特異性,策略之二遞減PCR,遞減PCR通過在PCR的前幾個循環(huán)使用嚴(yán)謹(jǐn)?shù)耐嘶饤l件提高特異性。循環(huán)設(shè)在比估算的Tm高大約

6、5的退火溫度下開始，然后每個循環(huán)降低1-2,直到退火溫度低于Tm 5。 特異性最高的目的模板會被優(yōu)先擴(kuò)增，這些產(chǎn)物在隨后的循環(huán)中繼續(xù)擴(kuò)增占據(jù)優(yōu)勢。 遞減PCR對于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更為有用，如AFLP、DNA指紋分析等,策略之三熱啟動PCR,熱啟動主要是通過抑制一種基本成分延遲DNA合成，直到PCR 儀達(dá)到變性溫度； 現(xiàn)在有很多公司都有HotStart Taq酶出售，該酶具有熱啟動的性能，使用簡單方便，適合于高通量應(yīng)用； 熱啟動PCR是除了好的引物設(shè)計之外，提高PCR特異性最重要的方法之一,策略之四使用PCR增強(qiáng)劑,甲酰胺、DMSO、甘油、甜菜堿等都可充當(dāng)PCR的增強(qiáng)劑。

7、 其可能的機(jī)理是降低熔解溫度，從而有助于引物退火并輔助DNA聚合酶延伸通過二級結(jié)構(gòu)區(qū)。 增強(qiáng)劑濃度要適當(dāng),熒光定量PCR常見問題,熒光定量PCR擴(kuò)增效率確認(rèn),相關(guān)系數(shù)（R2）：大于0.98 標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率：-3-3.5 PCR擴(kuò)增效率（E）：0.91.2 重復(fù)性好：STD 0.2 特異性好,熒光定量PCR常見問題,無Ct值（信號）出現(xiàn) 或出現(xiàn)過晚,陰性對照出現(xiàn) 明顯的擴(kuò)增,熒光PCR mix或水污染； 出現(xiàn)引物二聚體：設(shè)計特異性引物,反應(yīng)循環(huán)數(shù)不夠； 檢測熒光信號步驟有誤； 引物、探針設(shè)計不佳或降解； 模板量少或降解。 反應(yīng)條件或體系不佳：優(yōu)化； 擴(kuò)增片段過長：100200bp,熒光定量PCR常

8、見問題,溶解曲線不止一個主峰,引物設(shè)計不佳：設(shè)計特異性引物； 引物濃度不適：降低引物濃度； 退火溫度低：調(diào)整退火溫度； 鎂離子濃度過高：降低鎂離子濃度； 模板中有基因組污染：注意提取過程； 耗材儀器不匹配； 反應(yīng)體系污染等：設(shè)置陽性陰性對照,熒光定量PCR常見問題,擴(kuò)增效率低,重復(fù)性不好,反應(yīng)體系中部分成分尤其是熒光染料降解； 反應(yīng)條件不佳：延長退火、延伸時間，改為三步法， 降低退火溫度，提高引物濃度，重新設(shè)計引物； 反應(yīng)體系中有抑制物：一般為模板引入,加樣不準(zhǔn)確； 儀器溫度均一性不好； 模板濃度低,熒光定量PCR常見問題,擴(kuò)增曲線不正常,基線等設(shè)置不當(dāng)：減小基線終點(diǎn)； 模板量過多：將模板稀釋

9、,臨床PCR檢測的常見問題,假陽性問題,假陰性問題,定量問題,方法學(xué)問題：靶基因序列特異性、引物錯配、非特異性擴(kuò)增 污染問題：樣本污染、產(chǎn)物污染,試劑因素 操作因素 儀器因素 標(biāo)本因素,外標(biāo)定量與內(nèi)標(biāo)定量,臨床PCR檢測常見問題解決辦法,嚴(yán)格區(qū)分及實(shí)驗(yàn)人員培訓(xùn)； 使用UNG技術(shù),假陽性解決辦法,假陰性解決辦法,設(shè)置陽性對照監(jiān)測試劑問題； 降低操作難度，提高操作人員素質(zhì)； 陽性對照、標(biāo)準(zhǔn)曲線或使用內(nèi)對照監(jiān)控儀器故障； 使用抗干擾能力強(qiáng)的試劑提取樣本DNA,臨床PCR檢測常見問題解決辦法,外標(biāo)定量與內(nèi)標(biāo)定量,RT常見問題,RNA降解或起始量少 RNA含抑制成分 cDNA 5端不全 目的基因在組織中不 表達(dá)或表達(dá)量太低,原因,對 策,分離高質(zhì)量的RNA 使用高溫逆轉(zhuǎn)錄酶，如RT007（BioFlux） 使用隨機(jī)引物或GSP 嘗試其它組織,問題1：RT-PCR沒有產(chǎn)物,六種Taq和MasterMix： Taq、Pfu、HotStart Taq、Taq plus、Long Taq、Taq Platinum dNTP 引物 SP6,Tn7,M13,S