探討降低S100A4表達(dá)對系膜細(xì)胞增殖的調(diào)控作用

1、探討降低S100A4表達(dá)對系膜細(xì)胞增殖的調(diào)控作用持續(xù)的系膜增殖和系膜基質(zhì)增多可導(dǎo)致不可逆性腎小球硬化1,抑制系膜細(xì)胞增殖是增殖性腎小球疾病重要的治療策略。S100A4 是 S100 基因家族成員，是一種鈣結(jié)合蛋白2,參與腎組織內(nèi)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化過程3,其對腎小球系膜細(xì)胞增殖是否有影響尚未見報告。本研究通過體外培養(yǎng)大鼠系膜細(xì)胞，探討降低 S100A4 表達(dá)對系膜細(xì)胞增殖的調(diào)控作用。1 材料方法1. 1 實驗材料 1640 細(xì)胞培養(yǎng)粉劑及 Tri201 試劑（ GIBCO 公司） ; MicroBCA 蛋白濃度檢測試劑盒、MTT（ Sigma 公司） ; 小牛血清（ Fetal bovine s

2、erum,FCS,Hycolon 公司） ; 羊 S100A4 抗體、小鼠 p21 抗體、小鼠 cyclinD1 抗體、小鼠 CDK2 抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠 IgG、羊抗兔 IgG、脂質(zhì)體 TransPass R2Transfection Reagent（ Biolab 公司） ; M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶（ Invitrogenlife technologies 公司） ; PCR 試劑 （ TaKaRa Biotechnology 公司） ;ECL 顯色試劑盒（ Santa Cruz Biotechnology 公司） .1. 2 大鼠腎小球系膜細(xì)胞系 RMC 的培養(yǎng) 雄性 Wi

3、star 大鼠160 200 g 由吉林大學(xué)動物中心提供。無菌條件下取雙側(cè)腎臟，剝離腎包膜，腎皮質(zhì)剪成碎塊，放于重疊的三層不銹鋼篩網(wǎng)上。收集第二層篩網(wǎng)上的組織移入離心管，V 型膠原酶（ 0. 5 mg/ml） 消化，15%胎牛血清的 RPMI 1640 培養(yǎng)液于37、5% CO2條件下培養(yǎng)原代的系膜細(xì)胞，7 d 傳代，經(jīng) Desmin（ +） 、（ -） 鑒定后，用于以下實驗。1. 3 S100A4-15siRNA 的設(shè)計與合成 根據(jù) Genbank 中大鼠S100A4-15 mRNA 全長序列（ AB020759. 1） 設(shè)計抑制 siRNA 的靶序列： 5 -AAGCCTTCTGTTCCT

4、GCTACA-3 ,經(jīng)上海吉瑪公司合成雙鏈 siRNA（ siS100A4） ,正義鏈： 5 -GCCUUCUGUUCCUGCUACAtt-3 ,反義鏈： 3 -ttCGGAAGACAAGGACGAUGU-5 .同時合成無關(guān) siRNA 序列作為對照（ siCon） : 正義鏈： 5 -UUCUCCGAACGUGUCACGUtt-3 ,反 義 鏈： 3 -ttTTAAGAGGCUUGCACAGUGCA-5 .合成的雙鏈 siRNA 用 DEPC 處理的水溶解至100 μmol / L,-20 凍存?zhèn)溆谩?. 4 siRNA 轉(zhuǎn)染 細(xì)胞長至 50% 60% 左右（ 以 12 孔板為例） ,

5、進行如下轉(zhuǎn)染步驟（ NEB TransPass R2 試劑盒） : 25 μlA 液加入 0. 6 ml 無血清 1640 培養(yǎng)液中，混勻。再加入2. 5 μlB 液體，混勻。加入終濃度為 100 nmol / L 的 siRNA（ siCon 或siS100A4） .室溫靜置孵育 20 min.期間待轉(zhuǎn)染細(xì)胞用無血清 1640 清洗 1 遍。孵育液加到細(xì)胞培養(yǎng)皿，37培養(yǎng)4 h.細(xì)胞中加 1 ml 正常 RPMI 1640 培養(yǎng)液（ 含血清） .過夜培養(yǎng)。更換新鮮的培養(yǎng)基培養(yǎng) 24 h 備用。1. 5 細(xì)胞增殖的檢測1. 5. 1 MTT 法檢測細(xì)胞增殖能力 大鼠系膜細(xì)胞 10

6、000 個 /孔接種于 96 孔板，無血清同步 16 h 后分為以下 4 組： 無血清組； 10%FCS 正常培養(yǎng)組； 10% FCS+siCon 組； 10% FCS+siS100A4 組，37 孵育 24 48 h.在到達(dá)各時間點時棄去培養(yǎng)液，加入 MTT（ 終濃度 5 mg/ml） 20 μl,孵育 4 h,吸去上清，每孔加入二甲基亞砜（ DMSO） 200 μl,室溫溶解15 min,分光光度計490 nm 讀取 OD 值。每組設(shè) 6 個復(fù)孔，共重復(fù) 3 次。1. 5. 2 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期 系膜細(xì)胞傳代至25 cm2培養(yǎng)瓶中，無血清同步 16 h 后分組同上。培養(yǎng)

7、24 h 后收集細(xì)胞，PBS 液洗 2 次，加入 75% 乙醇固定，4 過夜，次日離心后 PBS液洗 2 次，重懸于 0. 5 ml PBS 中。樣品經(jīng) RNA 酶（ 50 μg/ml）處理后，碘化丙啶（ PI,50 μg/ml） 室溫避光染色 30 min 后上機。應(yīng)用 BD 流式細(xì)胞分析儀的 FACScan 測量 DNA 含量，細(xì)胞周期變化數(shù)據(jù)用 CellFIT Cell Cycle Analysis Version 2. 0 1. 2 軟件分析（ BD 公司） ,以細(xì)胞周期各時相細(xì)胞百分率記錄數(shù)據(jù)并分析。每組 3 瓶，重復(fù) 3 次。1. 6 Western 印跡法檢測 S10

8、0A4 對細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白 p21、cyclin D1、CDK2 表達(dá) 系膜細(xì)胞傳代至 25 cm2培養(yǎng)瓶中，轉(zhuǎn)染、無血清同步 16 h 后分組同上； 培養(yǎng)48 h 后0. 25%胰酶消化收集細(xì)胞。Western 印跡法步驟同上： 最后分別加入小鼠 cy-clinD1 抗體（ 1 100 稀釋） 、小鼠 p21 抗體（ 1 100 稀釋） 、小鼠CDK2 抗體（ 1 100 稀釋） 、兔 β-actin 抗體（ 1 1 000 稀釋） ,室溫孵育 4 h; TBST 洗膜 3 次，分別加辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠 IgG（ 1 1 000 稀釋） 、羊抗兔 IgG（ 1 2 000

9、 稀釋） ,室溫孵育45 min; TBST 洗膜 3 次； ECL 顯影。ALPHAIMAGER 2200 凝膠圖像分析系統(tǒng)半定量分析。1. 7 統(tǒng)計學(xué)處理 計量資料采用 x±s 表示，MTT 實驗采用雙因素方差分析，其余采用單因素方差分析。兩兩比較采用 q 檢驗，采用 SPSS16. 0 軟件進行數(shù)據(jù)處理。2 結(jié) 果2. 1 MTT 檢測 S100A4 對系膜細(xì)胞增殖速率的影響 轉(zhuǎn)染抑制 S100A4 的 siS100A4 后 48 h 細(xì)胞數(shù)明顯低于正常對照組和無關(guān) siRNA（ SiCon） 組（ P2. 2 S100A4 對系膜細(xì)胞周期的影響 siRNA 抑制 S100

10、A4 組S 期細(xì)胞以及 S+G2/ M 期細(xì)胞數(shù)（ 增殖指數(shù)） 明顯低于正常對照組及無關(guān) siRNA 轉(zhuǎn)染組（ P參考文獻1 Mima A,Abe H,Nagai K,et al. Activation of Src mediates PDGF-inducedSmad1 phosphorylation and contributes to the progression of glomerulo-sclerosis in glomerulonephritisJ。 PLoS One,2011; 22; 6（ 3） : e17929.2 Garrett SC,Varney KM,Weber DJ,

11、et al. S100A4,a mediator of metasta-sisJ。 J Biol Chem,2006; 281（ 2） : 677-80.3 Fernandez-Fernandez MR,Veprlntsev DB,Fersht AR. Proteins of theS100 family regulate the oligomerization of p53 tumor suppressorJ。Proc Natl Acad Sci USA,2005; 102（ 3） : 4735-40.4 Liu T,Li Y,Lin K,et al. Regulation of S100A

12、4 expression via the JAK2-STAT3 pathway in rhomboid-phenotype pulmonary arterial smooth musclecells exposure to hypoxiaJ。 Int J Biochem Cell Biol,2012; 44 （ 8 ） :1337-45.5 Sack U,Walther W,Scudiero D,et al. Novel effect of antihelminthicNiclosamide on S100A4-mediated metastatic progression in colon cancerJ。 J