WB的原理、操作及注意事項

1、WB的原理、操作及注意事項原理：通過電泳區(qū)分不同的組分，并轉(zhuǎn)移至固相支持物，通過特異性試劑（抗體）作為探針，對靶物質(zhì)進行檢測， 蛋白質(zhì)的 Western 印跡技術(shù)結(jié)合了凝膠電泳的高分辨率和固相免疫測定的特異敏感等多種特點，可檢測到低至 1 5ng（最低可到 10 100pg）中等大小的靶蛋白。一、抗原的選擇和制備A：樣品的制備1 組織：組織的處理方法： 組織洗滌后加入3 倍體積預(yù)冷的PBS，0研磨，加入 5 STOPbuffer，180W，6mins ，0超聲波破碎， 5000rpm，5mins 離心，取上清。加入 -ME(9.5ml 加入 0.5ml) ，溴酚藍（ 9.5ml 加入 0.5m

2、l ）煮沸 10min，分裝后于 -20 保存，用時取出，直接溶解上樣。2 細胞：細胞的處理方法：離心收集細胞或者直接往細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)加入5STOPbuffer，收集，180W，6mins ，0超聲波破碎， 5000rpm，5mins 離心，取上清。加入 -ME(9.5ml 加入 0.5ml) ，溴酚藍（ 9.5ml 加入 0.5ml ）煮沸 10min，分裝后于 -20 保存，用時取出，直接溶解上樣。3 分泌蛋白的提?。ㄌ乩褐苯邮占置谝海尤?ME、溴酚藍制樣。B：蛋白的定量方法及影響蛋白定量原因1. 雙縮脲法：雙縮脲法是第一個用比色法測定蛋白質(zhì)濃度的方法。在需要快速， 但不很準確的測定

3、中，常用此法。 硫銨不干擾顯色， 這對蛋白質(zhì)提純的早期階段是非常有利的。雙縮脲法的原理是Cu2+與蛋白質(zhì)的肽鍵， 以及酪氨酸殘基絡(luò)合， 形成紫藍色絡(luò)合物，此物在 540nm波長處有最大吸收。 雙縮脲法常用于0.5g/L 10g/L 含量的蛋白質(zhì)溶液測定。干擾物有硫醇， 以及具有肽性質(zhì)緩沖液，如 Tris、Good 緩沖液等?？捎贸恋矸ǔジ蓴_物，即用等體積10%冷的三氯醋酸沉淀蛋白質(zhì)，然后棄去上清液，再用已知體積的1mNaOH溶解沉淀的蛋白質(zhì)進行定量測定。2.Lowry 法：此法是雙縮脲法的進一步發(fā)展。他的第一步就是雙縮脲反應(yīng)，即Cu+與蛋白質(zhì)在堿性溶液中形成絡(luò)合物，然后這個絡(luò)合物還原磷鉬磷-

4、 磷鎢酸試劑（福林 - 酚試劑），結(jié)果得到深藍色物。 此法比雙縮脲法靈敏得多，適合于測定20mg/L 400mg/L 含量的蛋白質(zhì)溶液。 其干擾物質(zhì)與雙縮脲法相同，而且受他們的影響更大，硫醇和許多其他物質(zhì)的存在會使結(jié)果嚴重偏差。另外要注意的是，加入福林試劑時要特別小心，試劑只在酸性pH 環(huán)境中才穩(wěn)定，上述提到的還原反應(yīng)只有在pH10 時才發(fā)生，因此，福林試劑加入到堿性的Cu2+-蛋白質(zhì)溶液中時，必須立刻攪拌，以使磷鉬酸- 磷鎢酸試劑在未被破壞之前能有效地被Cu2+- 蛋白質(zhì)絡(luò)合物所還原。3. 紫外吸收法：大多數(shù)蛋白質(zhì)在 280nm波長處有特征的最大吸收， 這是由于蛋白質(zhì)中有酪氨酸， 色氨酸和苯

5、丙氨酸存在的緣故， 因此， 利用這個特異性吸收，可以計算蛋白質(zhì)的含量。如果沒有干擾物質(zhì)的存在， 在 280nm處的吸收可用于測定 0.1 0.5mg/ml 含量的蛋白質(zhì)溶液。 部分純化的蛋白質(zhì)常含有核酸， 核酸在 260nm波長處有最大吸收。 有核酸時， 所測得的蛋白質(zhì)濃度必須作適當(dāng)校正，一般按下述公式粗略計算：是蛋白質(zhì)溶液在280nm波長處（光程1 厘米）測得的光密度值。是蛋白質(zhì)溶液在260nm小波長處（光程1 厘米）處所測得的光密度值。此方程是從烯醇酶（在酵母核酸存在時）得出來的。 因此，對其他蛋白質(zhì)和其他核酸不一定適用。由于各種蛋白質(zhì)所含芳香族氨基酸的量不同，因此，濃度為0.1%的各種蛋

6、白質(zhì)在280nm 處的消光系數(shù)（）在0.5 2.5之間變化。所有的蛋白質(zhì)在230nm 以下都有強吸收。例如，牛血清白蛋白的0.1%在225nm和 215nm處分別為 5.0 和 11.7 ，而在 280nm處測為 0.58 。在 230nm以下的強吸收是由于肽鍵的存在， 因此，此值對所有的蛋白質(zhì)都是一樣的。 從 215nm和 225nm處的光密度之差可用于測定濃度為 10l/ml 100l/ml 的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)濃度可以近似地由下式得到：光密度之差求得，這一公式是減去溶液中非蛋白質(zhì)成分產(chǎn)生的誤差。但是， 蛋白質(zhì)之間的分子量差異比較大，因此，在比較幾種蛋白質(zhì)含量時，必須作適當(dāng)?shù)男Ｕ?。由于蛋白質(zhì)的

7、吸收峰常因pH 改變而變化，所以在制作標準曲線時，必須與樣品條件一致。4. Bradford比色法：Bradford比色法比Lowry 法測定蛋白濃度更簡單迅速。用脫氧膽酸 / 三氯乙酸沉淀蛋白可排除甘油、去污劑、2- 巰基乙醇、乙酸、硫酸銨、Tris和一些堿性緩沖系統(tǒng)的干擾。分別在兩組微量離心管中各加入0.5mg/ml牛血清白蛋白（5， 10， 15 和 20l ），以0.15mmol/l NaCl補足至 100l ，同時以兩管 100l的 0.15mmol/l NaCl作空白對照。每管各加入 1ml 考馬斯亮藍染料溶液，振蕩混勻， 室溫放置2 分鐘。用 1cm 光徑的微量比色杯測A595，

8、取 A595 吸光值對標準蛋白濃度作圖，畫標準曲線，并測量待測樣品的A595。從 BSA標準曲線中確定待測樣品的濃度。測定10- 100g的蛋白質(zhì)，要在較大試管中將染料溶液體積增大 5 倍進行。 樣品濃度過高， 可稀釋后進行， 或在 10- 100g另作一標準曲線進行測定。5電泳估算法（我們選擇此法）：樣品倍比稀釋，SDS-PAGE電泳，同時做定量marker 對照，可以估算樣品大概濃度。以提取癌組織總蛋白為例： 取等量胰腺癌組織、癌旁組織及正常胰腺組織，用 dH2O漂洗 5 10 次，再用預(yù)冷的1 PBS洗滌 3 次，目的是去除樣本中的血液。 每 2 克組織加入3ml 1 PBS勻漿，保持在

9、4條件進行。 加入 5 STOPBuffer緩沖液 1ml，混勻，4下超聲碎化。 再加入 0.5ml -ME，0.5ml溴酚藍，煮沸10mins ，至此，制樣過程完成； SDS-PAGE電泳，以BAS作為對照估計樣品蛋白濃度。二、 SDS-聚丙烯酸胺凝膠電泳（SDS PAGE）A：實際操作1.做膠前的準備1) 檢查是否有足夠的、干凈的spacer 、 comb 和架子。2) 檢查是否有新鮮的，足量10%APS，沒有立刻重配。3) 按將要檢測的抗體對應(yīng)的原始抗原的分子量大小，計算出膠的濃度，并算出分離膠各組分的用量。2. 制膠，電泳1）裝好架子。2) 按照下面配方配制分離膠。( 單位： ml，

10、Total： 8ml)7.51015%2 Sep. buffer44430 Gel.sol2.02.74ddH 2O1.91.20TEMED8ul8ul8ul10%APS80ul80ul80ul在膠上面加入一層蒸餾水，促進膠更好的凝集。3) 待分離膠凝集后，配制濃縮膠。( 單位： ml ， Total： 3.5ml)32 Stacking. buffer1.730 Gel.sol0.35ddH 2O1.4TEMED5ul10%APS50ul倒好后插入預(yù)先準備好的梳子。4) 待膠凝集好后，上樣，電泳。上層膠用60-80V 電壓，當(dāng)樣品至分離膠時，用100-120V電壓。一般電泳時間在1.5 小時

11、左右。B ：注意事項及常遇到的問題1）分離膠不要倒的太滿，需要有一定的濃縮膠空間，否則起不到濃縮效果。2）上樣蛋白量不應(yīng)超過30ug/mm2 ( 載荷面即：如果你的膠槽是5mm 1mm，則載荷面為：21mm 5mm=5mm) 。3 ）gel 通常在 0.5-1h內(nèi)凝集最好， 過快表示TEMED、APS用量過多， 此時膠太硬易龜裂，而且電泳時容易燒膠。太慢則說明兩種試劑用量不夠或者系統(tǒng)實際不純或?qū)嵭А? ）混合攪拌速度太快產(chǎn)生氣泡影響聚合，導(dǎo)致電泳帶畸形。太慢不均勻，特別是甘油。5 ）電泳中常出現(xiàn)的一些現(xiàn)象： 條帶呈笑臉狀，原因：凝膠不均勻冷卻，中間冷卻不好。條帶呈皺眉狀，可能是由于裝置不合適，

12、特別可能是凝膠和玻璃擋板底部有氣泡，或者兩邊聚合不完全。拖尾：樣品溶解不好。紋理（縱向條紋） ：樣品中含有不溶性顆粒。條帶偏斜：電極不平衡或者加樣位置偏斜。條帶兩邊擴散：加樣量過多。三、轉(zhuǎn)移在電流的作用下，使蛋白質(zhì)從膠轉(zhuǎn)移至固相載體（膜）上。膜的選擇： 印跡中常用的固相材料有NC膜、DBM、DDT、尼龍膜、 PVDF等。我們選用PVDF（聚偏二氟乙烯） ，其具有更好的蛋白吸附、物理強度，以及具有更好的化學(xué)兼容性。有兩種規(guī)格： Immobilon-P （ 0.45um）和 Immobilon-PSQ(0.2um for MW20kDa) 。A 半干法即將凝膠夾層組合放在吸有轉(zhuǎn)印緩沖液的濾紙之間，

13、通過濾紙上吸附的緩沖液傳導(dǎo)電流，起到轉(zhuǎn)移的效果。因為電流直接作用在膜膠上，所以其轉(zhuǎn)移條件比較嚴酷，但是其轉(zhuǎn)移時間短，效率高。1 實驗條件的選擇電流 1mA-2mA/cm2，我們通常 100mA/膜，按照目的蛋白分子大小、膠濃度選擇轉(zhuǎn)移時間，具體可以根據(jù)實際適當(dāng)調(diào)整。目的蛋白分子大小 (kDa)膠濃度轉(zhuǎn)移時間 (h)80-1408%1.5-2.025-80101.515-40120.75=膜 =膠。2）濾紙、膠、膜之間千萬不能有氣泡，氣泡會造成短路。3）因為膜的疏水性，膜必須首先在甲醇中完全浸濕。而且在以后的操作中，膜也必須隨時保持濕潤（干膜法除外） 。4）濾紙可以重復(fù)利用，上層濾紙（靠膜）內(nèi)吸

14、附有很多轉(zhuǎn)移透過的蛋白質(zhì)，所以上下濾紙一定不能弄混，在不能分辨的情況下，可以將靠膠濾紙換新的。5）轉(zhuǎn)移時間一般為1.5小時， ( 1mA-2mA/cm2， 10% gel) ，可根據(jù)分子量大小調(diào)整轉(zhuǎn)移時間和電流大小。B 濕法我們基本上不用此方法，這里暫不做介紹。C 轉(zhuǎn)移后效果的鑒定1染膠用考馬斯亮蘭染色經(jīng)destain脫色后，看膠上是否還有蛋白來反映轉(zhuǎn)移的效果。2染膜有兩類染液選擇，可逆的和不可逆的?？赡娴挠衟onceau-s red、 FastgreenFC、CPTS等，這類染料染色后，色素可以被洗掉，膜可以用做進一步的分析用。但是不可逆的染料，如考馬斯亮蘭、india ink、Amido.

15、black 10B等，染色后膜就不能用于進一步的分析。四、封閉（ block ）封閉是為了使我們的抗體僅僅只能跟特異的蛋白質(zhì)結(jié)合而不是和膜結(jié)合。常用的封閉液有bovineserum albumin(BSA) ，non-fatmilk ，casein ，gelatin，tween-20等，我們一般用non-fat milk。在轉(zhuǎn)移結(jié)束前配好5%的 Milk(TBST 溶解 ) 。轉(zhuǎn)移結(jié)束后將膜放入milk 中 block( 一定要放在干凈的容器里，避免污染而且要足以覆蓋膜) ，并清洗整理好用過的濾紙，以便下次使用。 Block 4 C O/N，或 RT 1 小時。五、孵育一抗A. 先將需要檢測的

16、抗體準備好，并決定好它們的稀釋度。B. 配好 5%的 Milk(TBST 溶解 ) ，按要求稀釋好抗體。注意，如需高比例稀釋，最好采用梯度稀釋。C.將稀釋好的抗體和膜一起孵育。一般采用 RT 1 小時，可根據(jù)抗體量和膜上抗原量適當(dāng)延長或縮短時間。注意：為了便于后面分析結(jié)果， 我們一般會選用已確定分子量大小而且純度高的抗體作為 marker 與一抗同時孵育。六、洗滌用 TBST 先快速洗三次，把 milk 盡快的 wash 掉。然后 5mins *5 。洗滌是為了洗去一抗與抗原的非特異性結(jié)合，洗滌的效果直接影響結(jié)果背景的深淺。七、孵育二抗孵育 RT1 小時。一般采用HRP標記的二抗，稀釋比例為1

17、:5000 。二抗的稀釋比例不能太低，否則容易導(dǎo)致非特異性的結(jié)合。注意二抗的選擇有多種，要根據(jù)一抗來選擇抗兔、抗鼠或者抗羊的二抗，以及根據(jù)后面的顯色條件來選擇 HRP、 AP或者 GOD（葡萄糖氧化酶）酶鏈的二抗或者標志其他探針（如核素等）的。八、洗滌用 TBST 先快速洗三次，把 milk 盡快的 wash 掉。 然后 5mins *5 。洗滌是為了洗去二抗的非特異性結(jié)合，洗滌的效果直接影響結(jié)果背景的深淺，所以洗滌一定要干凈。九、顯色（ HRP酶）1增強化學(xué)發(fā)光法(ECL)Ecl顯色原理： 氨基苯二酰肼類主要是魯米諾及異魯米諾衍生物，是最常用的一類化學(xué)發(fā)光劑。魯米諾（ luminol ， 5

18、- 氨基 -2 ， 3- 二氫 -1 ， 4- 酞嗪二酮）的分子結(jié)構(gòu)及化學(xué)反應(yīng)式如下：魯米諾在免疫測定中既可用作標記物，也可用作過氧化物酶的底物。在 Ecl 底物中， 含有 H2O2和魯米諾，在 HRP（辣根過氧化物酶）的作用下，發(fā)出熒光來。試驗步驟：1）將兩種顯色底物1： 1 等體積混合（一般各1ml/membrane）。2）將混合物覆蓋在膜表面，1-2 分鐘，搖晃使均勻。3）用保鮮膜把膜包起來，放入夾板中。4）在暗室中將X 光片，覆蓋在膜的上面，夾好夾子，曝光1min 。5）顯影、定影。6）根據(jù)結(jié)果調(diào)整曝光時間和曝光區(qū)域，得到最佳結(jié)果。注意：熒光在一段時間后會越來越弱。2.DAB 顯色DA

19、B（ 3,3 二氨基聯(lián)苯胺）和 HRP反應(yīng)產(chǎn)生棕色的不溶終產(chǎn)物。這種棕色沉淀不溶于酒精和其它有機溶劑，對于必需使用傳統(tǒng)復(fù)染和封固介質(zhì)的免疫組化染色應(yīng)用特別理想。對于 AP 標記的二抗我們選用 BCIP and NBT 顯色，它們在堿性磷酸酶（ AP）作用下反應(yīng)可生成一種不溶性黑紫色沉淀的強信號。十、分析結(jié)果及其判斷常見問題原因分析及處理方法：見附錄一、二。附錄一： Troubleshooting Blotting Problems（ P43 48）附錄二： Western Blotting Troubleshooting Logic Tree（ P390 394）附錄三：試驗中所用到的試劑和緩沖溶液1) 5x Stop Solution (Sample buffer) pH6.7:Stock:to use:20% Glycerol100mltake 9.5ml stock10% SDS50g or 250ml 20% SDS add BME 0.5ml250mM Tris15.14gbromphenol blue ortotal475.00mlpyronine 4 to taste2) Gel solution (30% w/v acrylamide mix): 0.8 bis-acrylamide 0.8g29.2% acrylamide29.2gt