肺部感染診斷難點病原學(xué)診斷的規(guī)范化和新技術(shù)

1、患者男性，44歲，咳嗽、咳痰12天，氣急5天痰少稍黃，發(fā)熱39.2C，查體兩肺濕性羅音；血WBC6500，P73；胸片示兩肺炎癥,如何進(jìn)行病原學(xué)檢查？ 痰培養(yǎng)3次 痰涂片革蘭染色鏡檢 痰找抗酸桿菌 還有其他檢查項目嗎,2021/2/23,1,臨床情景,男性，咳嗽、咳痰加重1周，痰色稍黃，發(fā)熱38.5C，查體于右下肺少許濕性羅音，胸片示右下肺炎。痰培養(yǎng)報告如下,痰培養(yǎng)報告（1） 銅綠假單胞菌,痰培養(yǎng)報告（2） 銅綠假單胞菌 少量生長,痰培養(yǎng)報告（3） 無主要致病菌,痰培養(yǎng)報告（4） 銅綠假單胞菌 草綠色鏈球菌 奈瑟菌,2021/2/23,2,臨床情景,2021/2/23,3,The epidem

2、iology of CAP among hospitalized adultsPorath A, Schlaeffer F, Lieberman D. J Infect 1997 Jan;34(1):41-8 ；Thorax 1996 Feb;51(2):179-84,病例：346。男占53% ，平均年齡 49.3 +/- 19.5（17-94）； 方法： 1年。血和胸水pleural fluid培養(yǎng)，特異血清試驗確定病原 結(jié)果：80.6%找到病原，133（38.4）為超過1種的病原體,62,148,35,101,56,20,19,21,2021/2/23,4,2021/2/23,4,如何規(guī)范

3、地選擇檢驗項目,肺部感染病原學(xué)診斷有哪些項目,顯微鏡檢查 革蘭染色 濕片檢查 分枝桿菌檢查 肺孢子菌檢查（BAL） 肺組織標(biāo)本 培養(yǎng)：細(xì)菌與真菌 普通菌，厭氧菌，結(jié)核菌，真菌 定量/半定量培養(yǎng),免疫學(xué)方法 抗原：尿可溶性抗原，GM，隱球菌 抗體：肺吸蟲。 組織病理學(xué) 結(jié)核與其他分枝桿菌 真菌（曲霉，隱球菌） 分子生物學(xué) 核酸檢測 其他,2021/2/23,5,胸腔積液能做哪些檢查,涂片檢查 對培養(yǎng)陰性者的價值尤為重要 普通培養(yǎng) 將胸水直接注入血培養(yǎng)瓶內(nèi)送檢，可提高檢出率。但可有皮膚非致病菌污染 經(jīng)胸腔留置導(dǎo)管采集的胸水標(biāo)本，分離的細(xì)菌可能只是定植，應(yīng)注意鑒別 厭氧培養(yǎng) 結(jié)核菌培養(yǎng) 陽性率？ 抗

4、原檢測 如流桿b型、肺鏈、軍團(tuán)菌或隱球菌,2021/2/23,6,2021/2/23,7,住院病人社區(qū)獲得性肺炎單病種質(zhì)量控制,判斷是否符合入院標(biāo)準(zhǔn) 氧合評估 病原學(xué)診斷 住院24小時以內(nèi)，采集血、痰培養(yǎng) 在首次抗菌藥物治療前，采集血、痰培養(yǎng) 抗菌藥物時機(jī) 入院8h/4h/6h內(nèi)接受抗菌藥物治療 起始抗菌藥物選擇 重癥與非重癥患者起始抗菌藥物選擇 目標(biāo)抗感染藥物的治療選擇 初始治療72小時后無效者，重復(fù)病原學(xué)檢查 抗菌藥物療程（平均天數(shù)） 為患者提供：戒煙咨詢/健康輔導(dǎo) 符合出院標(biāo)準(zhǔn)及時出院 平均住院日/住院費用,2021/2/23,8,上海市感染病原學(xué)診斷和耐藥性監(jiān)測評價指標(biāo),2021/2/

5、23,9,香港瑪麗醫(yī)院 微生物檢驗申請單,改革微生物檢驗申請單,2021/2/23,10,患者女性，44歲，咳嗽、咳痰12天，氣急5天痰少稍黃，發(fā)熱39.2C，外院胸片示兩肺廣泛炎癥，以上肺為多，先后用青霉素、頭孢曲松、頭孢他啶等治療無效。查體兩肺濕性羅音。血WBC6500，P73,會診要求 如何選擇抗感染藥物,病原學(xué)檢查情況 痰涂片革蘭染色鏡檢 痰找抗酸桿菌 軍團(tuán)菌抗體檢測和軍團(tuán)菌培養(yǎng),臨床情景,右上肺空洞,肺膿腫？ 痰培養(yǎng) 厭氧菌培養(yǎng) 結(jié)核空洞？ 痰找抗酸桿菌 結(jié)核菌培養(yǎng) 肺真菌感染,2021/2/23,11,兩肺彌漫性結(jié)節(jié)伴空洞,男，65歲 咳嗽數(shù)周 無咯血、發(fā)熱 胸部CT示兩肺多發(fā)結(jié)節(jié)

6、伴空洞 進(jìn)一步檢查,2021/2/23,12,2021/2/23,13,某男，46歲，心臟移植術(shù)后2月余。高熱5天伴咳嗽入院。CT示兩肺炎癥，之后應(yīng)用萬古霉素、泰能、氟康唑等多種抗菌藥物治療無效，仍高熱，并出現(xiàn)進(jìn)行性加重的呼吸困難。 痰培養(yǎng)、血培養(yǎng)等均陰性,會診要求 還要做哪些病原學(xué)檢查項目？ 如何選擇抗感染藥物,臨床情景,2021/2/23,14,143,新型隱球菌溶膠凝集試驗,2021/2/23,15,2021/2/23,15,如何規(guī)范地采集和運送標(biāo)本,2021/2/23,16,關(guān)于咳痰標(biāo)本,在抗生素應(yīng)用前采集痰標(biāo)本; 標(biāo)本采集后12h內(nèi)必須立即進(jìn)行實驗室處理； 咳痰標(biāo)本應(yīng)用最早且廣泛，但

7、也是最受爭議的標(biāo)本 ; 取標(biāo)本前應(yīng)摘去牙托，清潔口腔如刷牙和漱口; 深咳，采集標(biāo)本過程中要有專業(yè)的醫(yī)務(wù)人員指導(dǎo); 無痰可用35NaCl 5ml霧吸約5min導(dǎo)痰； 也可用物理療法、體位引流、鼻導(dǎo)管抽吸等法取痰； 對于細(xì)菌性肺炎，痰標(biāo)本送檢每天1次，連續(xù)23天。不建議24h內(nèi)多次采集，除非痰液外觀性狀出現(xiàn)改變； 懷疑分枝桿菌感染者，應(yīng)連續(xù)收集3天清晨痰液送檢,2021/2/23,17,幾種下呼吸道直接采集的標(biāo)本,經(jīng)氣管穿刺吸引transtracheal aspiration,TTA 經(jīng)胸壁針刺吸引transthoracic needle aspiration, TNA 經(jīng)支氣管鏡采樣 支氣管肺泡

8、灌洗bronchoalveolar lavage, BAL 經(jīng)支氣管鏡直接吸引 防污染樣本毛刷protective specimen brush, PSB 開胸肺活檢open-lung biopsy，OLB 經(jīng)人工氣道吸引分泌物 endotracheal aspirates，ETA,2021/2/23,18,經(jīng)支氣管鏡采樣,簡單吸引、刷檢、活檢、灌洗(PSB,TBLB,PBAL) 方法多樣、適應(yīng)不同標(biāo)本采集要求,2021/2/23,19,經(jīng)人工氣道采樣,導(dǎo)管吸痰（ETA） 防污染毛刷(PSB) 防污染灌洗(PBAL,2021/2/23,20,經(jīng)胸壁肺吸引、活檢,X線透視下、B超、CT引導(dǎo)下 有

9、一定的并發(fā)癥氣胸、出血、空氣栓塞 常用于貼近胸壁的病灶,2021/2/23,21,2021/2/23,21,如何規(guī)范地進(jìn)行微生物檢驗,呼吸道標(biāo)本的規(guī)范檢驗,培養(yǎng)前處理 痰標(biāo)本質(zhì)量評價 痰標(biāo)本的勻化 定量或半定量培養(yǎng) 培養(yǎng)條件 培養(yǎng)平皿 二氧化碳孵箱,2021/2/23,22,2021/2/23,23,細(xì)胞學(xué)篩選標(biāo)本,合格標(biāo)本 應(yīng)是從下呼吸道咳出的痰，內(nèi)含頰部鱗狀上皮細(xì)胞少，而白細(xì)胞較多 不合格標(biāo)本 指唾液或唾液嚴(yán)重污染 的痰標(biāo)本，含鱗狀上皮 細(xì)胞多，而白細(xì)胞少,2021/2/23,24,咳痰標(biāo)本質(zhì)量評估：細(xì)胞學(xué)篩選,SEC25，分別賦分0、-1和-2；WBC25，賦分0、1和2；粘稠或膿性痰液

10、賦分值,2021/2/23,25,5種篩選標(biāo)準(zhǔn)判斷14001份痰標(biāo)本合格率比較,2021/2/23,26,咳痰標(biāo)本不合格，你退檢嗎,如果低倍視野下鱗狀上皮細(xì)胞大于10個，應(yīng)不做或僅在特殊要求時做培養(yǎng)。 如做培養(yǎng)，報告中注明“鏡檢結(jié)果表明標(biāo)本口咽分泌物污染明顯”。 復(fù)旦大學(xué)中山醫(yī)院的做法 痰液外觀：膿性，粘膿，粘液，水樣. 鏡檢：WBC？，SEC？ 痰標(biāo)本質(zhì)量評價：合格，不理想（建議重送,2021/2/23,27,痰標(biāo)本的洗滌與消化,洗滌 滅菌等滲氯化鈉液系列平皿內(nèi)順次漂洗，或置于孔徑1mm的濾器上等滲氯化鈉沖洗。 洗滌可除去痰液外層水樣唾液，保留來自下呼吸道的粘稠或膿性成分。 消化 乙酰半胱氨

11、酸等消化液，以蛋白水解酶和粘液溶解劑應(yīng)用最多。 消化過程有助于痰核內(nèi)部細(xì)菌的暴露，提高痰標(biāo)本培養(yǎng)的陽性撿出率 超聲液化（,2021/2/23,28,下呼吸道標(biāo)本涂片染色鏡檢,初步病原學(xué)診斷：高質(zhì)量痰標(biāo)本涂片染色或濕片檢查 傾向性診斷：抗酸桿菌、放線菌、奴卡菌、一些真菌以及肺胞子菌、寄生蟲。 熒光顯微鏡：可用于軍團(tuán)菌、結(jié)核分枝桿菌等,2021/2/23,29,革蘭染色油鏡檢查,可較清楚觀察細(xì)菌的形態(tài)，大致判斷細(xì)菌種屬。 一定特征性的病原體如肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌和卡他莫拉菌，經(jīng)驗豐富時可作出較為可靠的判定。 在觀察視野及周圍不存在鱗狀上皮細(xì)胞但見到一些炎性細(xì)胞或柱狀上皮細(xì)胞的視野內(nèi)，如發(fā)現(xiàn)較多

12、形態(tài)單一的GNB，對肺部感染病原體的診斷有參考價值 革蘭染色鏡檢結(jié)果必須要立即向臨床報告，尤其是ICU病人的經(jīng)人工氣道的吸引（ETA）標(biāo)本 痰標(biāo)本巧克力瓊脂培養(yǎng)基的接種，僅限于每油鏡視野10個類似嗜血桿菌或類似奈瑟菌。 胸腔積液和膿胸做革蘭染色涂片可明確細(xì)菌的類型和采取相對應(yīng)的抗菌治療方案。 經(jīng)支氣管鏡的沖洗液（除BAL）和支氣管的抽吸物，口咽污染均不能避免,2021/2/23,30,CAP: 痰液革蘭染色作用不清楚,目的: CAP病人痰革蘭染色檢測肺炎鏈球菌作用 方法: 檢索Medline 1966 to 1993英文發(fā)表論文 (檢索詞: sputum,Grams stain,pneumon

13、ia) 規(guī)則: 3 名盲法評述者獨立判讀文獻(xiàn) 入選: 11 篇前瞻性研究和 1篇回顧性研究共1322 pt 證據(jù): 敏感性15%100% , 特異性11%100%. 多數(shù)研究敏感性 70% 評述: 70%系膿性痰. 缺陷:限Medline英文文獻(xiàn);樣本數(shù)、研究規(guī)模、盲法、陽性結(jié)果的定義或抗生素使用對照與試驗特征無統(tǒng)計學(xué)上的相關(guān)性,Reed WW, et al: Sputum Grams stain in community-acquired pneumococcal pneumonia: a meta-analysis. Western Journal of Medicine 1996; 16

14、5: 197-204,2021/2/23,31,濕片檢查,真菌檢查：與含有10%甘油的10%KOH混合于載玻片上，蓋上蓋玻片，濕盒中放置1530min 有經(jīng)驗的技術(shù)員可輕易識別皮炎芽生菌、粗球孢子菌和新型隱球菌； 可檢出絲狀菌； 有動力的病原體，如一種引起二重感染的糞小桿線蟲，可以在濕片中發(fā)現(xiàn)。 鞭毛蟲（,2021/2/23,32,2021/2/23,33,BAL離心沉淀物細(xì)胞學(xué)檢查推薦,2021/2/23,34,咳痰培養(yǎng)必須用半定量方法,定性鑒定的普通培養(yǎng)方法不易區(qū)分感染菌或污染菌； 標(biāo)準(zhǔn)定量培養(yǎng)方法繁瑣，建議用半定量方法； 方法：四區(qū)劃線接種標(biāo)本進(jìn)行培養(yǎng)，每劃一區(qū)后均需火燒接種環(huán)，使細(xì)菌在

15、平板上生長數(shù)逐級下降； 報告：優(yōu)勢菌生長菌落為3+或3+以上。也可分大量heavy、中等量moderate和少量scattering生長三種； 可以只鑒定和報告優(yōu)勢生長的需氧菌和兼性厭氧菌。只在原始區(qū)生長的少數(shù)菌不必作常規(guī)鑒定，除非臨床或直接革蘭染色提示可能為感染的病原菌,2021/2/23,35,劃線接種平板半定量判斷標(biāo)準(zhǔn),2021/2/23,36,痰標(biāo)本的培養(yǎng)基選擇,培養(yǎng)基包括分離和鑒別革蘭陽性菌的血平板、革蘭陰性菌鑒別的平板如麥康凱平板； 涂片顯示嗜血桿菌樣或奈瑟菌樣的優(yōu)勢菌（每油鏡視野10個細(xì)菌）時，應(yīng)增加接種富含營養(yǎng)的巧克力平板，分離流桿、腦膜炎、卡他； 痰涂片發(fā)現(xiàn)較多GNB或系醫(yī)院

16、內(nèi)肺炎的痰標(biāo)本，應(yīng)加麥康凱平板； 應(yīng)少用培養(yǎng)平板進(jìn)行細(xì)菌分離，要熟悉細(xì)菌在培養(yǎng)基上的生長模式，而不是靠選擇培養(yǎng)基,2021/2/23,37,培養(yǎng)環(huán)境：CO2,平板置于310CO2中35-37孵育。 燭缸可基本達(dá)到這一要求，但近年來的研究顯示用CO2培養(yǎng)箱分離肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌要明顯優(yōu)于燭缸。 為提高細(xì)菌培養(yǎng)和分離質(zhì)量，細(xì)菌室應(yīng)常規(guī)配備CO2培養(yǎng)箱，呼吸道標(biāo)本在初代培養(yǎng)時尤為重要,2021/2/23,38,菌落觀察與鑒定,平板孵育過夜（18-24h），觀察并記錄有幾種不同的菌落類型。 咳痰標(biāo)本：優(yōu)勢菌幾種菌落應(yīng)分離鑒定。 直接采集的下呼吸道標(biāo)本如PSB、BAL、TNA、胸腔穿刺液中生長的所

17、有菌落類型均應(yīng)鑒定。 如果病人已接受抗生素治療或革蘭染色所見細(xì)菌未分離到，48h后應(yīng)重新觀察平板。 某一菌落是否需要鑒定，應(yīng)根據(jù)其引起下呼吸道感染的可能性和病例的臨床特征來決定,2021/2/23,39,鏈球菌,溶血的鏈球菌：必須采樣客觀的方法如Optochin試驗、膽汁溶解試驗和莢膜腫脹試驗，來鑒別草綠色鏈球菌和肺炎鏈球菌。 草綠色鏈球菌：不要進(jìn)一步鑒定至種水平。 溶血性鏈球菌：至少應(yīng)根據(jù)免疫方法或桿菌肽敏感性測定，鑒定為A群和非A群鏈球菌。 非溶血性鏈球菌：如此報告即可，不必鑒定至種水平,2021/2/23,40,葡萄球菌,金葡菌：致病力較強(qiáng)，必須與其他葡萄球菌相鑒別。 其他葡萄球菌：很少

18、引起下呼吸道感染，通常報告為凝固酶陰性葡萄球菌（CoNS）便可。如果是血液或通常為無菌部位標(biāo)本如胸水分離出的細(xì)菌，或醫(yī)院感染標(biāo)本需要追蹤傳染源時，應(yīng)進(jìn)一步做有關(guān)生化試驗將凝固酶陰性葡萄球菌鑒定至種的水平,2021/2/23,41,卡他莫拉菌和腦膜炎奈瑟菌,卡他莫拉菌：肺炎的常見病原菌，要分離、鑒定痰培養(yǎng)中的疑似卡他莫拉菌。 奈瑟菌屬：咳痰標(biāo)本中分離的奈瑟菌通常不需要鑒定到種。只有在臨床醫(yī)生建議、或涂片革蘭染色有典型的特征即見大量胞內(nèi)革蘭陰性雙球菌、或培養(yǎng)見大量單一形態(tài)的奈瑟菌純培養(yǎng)，提示腦膜炎奈瑟菌是引起肺炎的病原體時，可作進(jìn)一步鑒定,2021/2/23,42,嗜血桿菌,流感嗜血桿菌：需510

19、CO2，X和V因子 副流感嗜血桿菌：臨床分離很多，大多數(shù)系非致病的上呼吸道正常菌群,2021/2/23,43,腸桿菌科,在分離平板中容易被發(fā)現(xiàn)、分離和鑒定。采用同一標(biāo)準(zhǔn)處理腸桿菌科細(xì)菌和其他可能的感染病原菌。 優(yōu)勢菌時，應(yīng)分離鑒定到種的水平。 多種GNB時，鑒定前，最好要與臨床醫(yī)生討論其可能的臨床意義（,2021/2/23,44,革蘭陽性桿菌,呼吸道最常見的需氧或兼性厭氧革蘭陽性桿菌是棒狀桿菌。 白喉棒狀桿菌：主要引起上呼吸道感染，很少累及下呼吸道。咽拭子培養(yǎng)要留意此菌鑒別。 類白喉桿菌：很少引起下呼吸道感染，不必進(jìn)行鑒定，除非分泌物涂片染色檢查系優(yōu)勢菌。類白喉桿菌可根據(jù)菌落和鏡下形態(tài)進(jìn)行報告

20、，大部分菌觸酶陽性,2021/2/23,45,痰液細(xì)菌學(xué)檢查程序,2021/2/23,46,快速報告與需要延長培養(yǎng)時間問題,使用抗菌藥物后 卡他莫拉菌 48h 曲霉菌與其他絲狀真菌,2021/2/23,47,2021/2/23,47,如何正確閱讀微生物檢驗報告,2021/2/23,48,肺部細(xì)菌性感染病原診斷：確定意義,血或胸液培養(yǎng)到病原菌 纖支鏡或人工氣道吸引標(biāo)本 細(xì)菌105cfu/ml（2+） BALF：細(xì)菌104cfu/ml（1-2+） PSB、PBALF：細(xì)菌103cfu/ml（1,2021/2/23,49,肺部細(xì)菌性感染病原診斷：有意義,合格痰標(biāo)本培養(yǎng)致病或條件致病菌3+ 少量生長，但與鏡檢結(jié)果一致 （肺球、流感、卡他莫拉菌） 入院3天內(nèi)多次培養(yǎng)到相同細(xì)菌,2021/2/23,50,肺部細(xì)菌性感染病原診斷：無意義,痰培養(yǎng)到上呼吸道正常菌 草鏈、表葡、非致病奈瑟菌、類白喉桿菌等 多種病原菌少量生長 不符上述“ 確定”和“