厭氧氨氧化污泥馴化過程中微生物的rapd分析

1、厭氧氨氧化污泥馴化過程中微生物的rapd分析 中山大學(xué) 碩士學(xué)位論文 厭氧氨氧化污泥馴化過程中微生物的RAPD分析 姓名：陳杰娥 申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士 專業(yè)：環(huán)境工程 指導(dǎo)教師：賈曉珊 20060605 厭氧氨氧化污泥馴化過程中微生物的RAPD分析 專業(yè)：環(huán)境工程 碩士研究生：陳杰娥 指導(dǎo)教師：賈曉珊教授 摘要 厭氧氨氧化是一種以亞硝酸鹽為電子受體，以氨為電子供體的生物反應(yīng)，反 應(yīng)產(chǎn)物為氮?dú)狻Ｓ捎趨捬醢毖趸哂胁恍柰饧犹荚?，污泥產(chǎn)率低，耗氧量少等優(yōu) 點(diǎn)，在廢水脫氮處理方面有廣泛的應(yīng)用前景。水處理系統(tǒng)中的微生物種類繁多、 易變異，且厭氧氨氧化細(xì)菌本身是一種難以用傳統(tǒng)方法分離純化的菌種，基于以 上兩

2、點(diǎn)，本文采用了RAPD方法研究厭氧氨氧化污泥馴化過程中微生物遺傳多 樣性的變化，并對(duì)不同反應(yīng)器的微生物作了聚類分析。主要開展了兩方面的工作： 1以硝化污泥 R1 、反硝化污泥 I己2 、厭氧產(chǎn)甲烷污泥 R3 為接種物，在完 全混合連續(xù)流反應(yīng)器中分別馴化培養(yǎng)厭氧氨氧化污泥，研究了馴化過程中各個(gè)反 應(yīng)器的厭氧氨氧化活性變化； 2以三個(gè)反應(yīng)器馴化各階段的污泥中的微生物為研究對(duì)象，采用隨機(jī)擴(kuò)增 多態(tài)性DNA RAPD 研究各階段微生物的遺傳多樣性、遺傳一致度和遺傳距離。 在上述研究的基礎(chǔ)上，得出主要研究結(jié)論如下： 1硝化污泥、反硝化污泥、厭氧產(chǎn)甲烷污泥均可作為接種物馴化培養(yǎng)出具 有一定活性的厭氧氨氧化

3、污泥，厭氧氨氧化活性的高低為：Rl反應(yīng)器 R3反應(yīng) 器 112反應(yīng)器。以硝化污泥為接種物的Rl反應(yīng)器，活性達(dá)到1664 mggVS$?d N 14+N。 2RAPD方法分析表明，在污泥馴化培養(yǎng)過程中，三個(gè)反應(yīng)器內(nèi)的微生物 發(fā)生了較明顯的種類變化。三個(gè)反應(yīng)器的多態(tài)位點(diǎn)百分率為：R2反應(yīng)器 R1反 中山大學(xué)碩士學(xué)位論文 應(yīng)器 R3反應(yīng)器。以Nei基因多樣性指數(shù)和Shannon信息指數(shù)計(jì)算的馴化過程微 生物遺傳多樣性在三個(gè)反應(yīng)器內(nèi)的規(guī)律為：R2反應(yīng)器 RI反應(yīng)器 R3反應(yīng)器， 與多態(tài)位點(diǎn)的規(guī)律一致。 聚類分析表明，以硝化污泥為接種物的Rl反應(yīng)器，以及以厭氧產(chǎn)甲烷污泥 為接種物的R3反應(yīng)器內(nèi)，最終馴化

4、所得的厭氧氨氧化富集培養(yǎng)物與最初的接種 污泥中的微生物間的遺傳一致度較高，遺傳距離小，親緣關(guān)系近；以反硝化污泥 為接種物的R2反應(yīng)器內(nèi)，最終馴化的厭氧氨氧化富集培養(yǎng)物與最初的接種污泥 中的微生物間的遺傳一致度較低，遺傳距離明顯比Rl、R3大，親緣關(guān)系遠(yuǎn)。 3活性實(shí)驗(yàn)和RAPD方法分析的結(jié)果表明：在厭氧氨氧化污泥馴化過程中， 微生物的遺傳多樣性和種類發(fā)生了變化；硝化污泥中存在與厭氧氨氧化細(xì)菌親緣 關(guān)系較近的菌種，更適宜作為接種物馴化培養(yǎng)厭氧氨氧化細(xì)菌。 關(guān)鍵詞：厭氧氨氧化，馴化，活性，RAPD II of Domesticationof RAPD Microorganismsduring Ana

5、lysis Bacteria AnaerobicAmmonium0xidation Environmental Engineering ChenJiee PmJiaXiaoshan Abstract Anaerobicammonium usesammoniumaselectron oxidation Anammox ，which donorandnitriteaselectron a biologicalprocessgeneratingdinitrogengas accepteris ofthe innovative intheremovalof The isone applicable t

6、echnologies process carbon ammoniumfromwastewaterforitsneedlessof organic source，low treatment andlow of wastewater of sludge consumptionoxygenIn production thesame of mutation continuallyAttime， systems，avarietymicroorganismsundergo andcannotbecultivated Anammoxbacterium growsextremelyslowly by tom

7、easurethe conventional order microorganism microbiologicaltechnologiesIn were thedomesticationofAnammox bacteria，molecular technologies varietyduring applied in3 continuous Anammoxdomesticationwereconducted sludge experiments stirredreactorsnitrification using sludge reactor1 ，denitrificationsludge

8、reactor2 inoculums andanaerobic respectivelyAnammox methanogenicsludge reactor3 as and distance wasdeterminedGenetic diversity,geneticidentitygenetic activity random ofdomesticationwerecalculated among process using microorganisms amplifiedpolymorphinDNA RAPD analysis Canbedomesticated Anammoxstudie

9、sshowedthatAnammox by activity sludge andanaerobic nitrification sludge，denitrificationsludge methanogenicsludge using III 中山大學(xué)碩士學(xué)位論文 asinoculums wasdifferentin activity reactorl， respectivelyHowever,Anammox reactor2andreactor inreactorlwasthe 1664 hi【ghest，about 3Activity mg幢?VSSd reactor3 NH4+N，fo

10、llowed by RAPD demonstratedthat inthe3reactorshave analysis microorganismspecies thedomestication of lociinthe3 changedduring polymorphic processPercentage reactorswere ofNeiS and reactor2 reactorl reactor3The sequencesgenediversity ShnnonSinformationindexarethesameas loci percentageofpolymorphie Th

11、e betweenAnammoxenrichmentculturesandnitrification geneticidentity thatbetweenAnammoxenrichmentculturesandanaerobic sludge reactorl ，and are thanthe methanogenicsludge reactor3 aresimilarTheyhigher geneticidentity betweenAnammoxenrichmentculturesanddenitriflcation sludge reactor2 to researchandRAPD

12、and Accordingactivity analysis，microorganismspecies inthe3 reactors inthe domestication geneticdiversity changedobviously process Anammox seriesaremore toexistinnitrification homologous likely sludge，and nitrification isthe inoculumforthedomesticationofAnammox sludge optimal bacteria words：anaembiea

13、rrmaonium Key RAPD 第一章緒論 第一章緒論 11研究目的和意義 厭氧氨氧化是以氨為電子供體，以亞硝酸鹽為電子受體的生化反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn) 物為氮?dú)狻７磻?yīng)式如下： NO；+NH： N1+2H20 最初的厭氧氨氧化是在生物脫氮流化床反應(yīng)器中發(fā)現(xiàn)并得到證實(shí)的。1994 deGraafet a1，1994 ，詳述了 年，AMulder等人發(fā)表論文 AMulder,AAvan 在生物脫氮流化床反應(yīng)器中發(fā)現(xiàn)氨和硝酸鹽同時(shí)消失的現(xiàn)象。隨后所做的實(shí)驗(yàn)， 包括15N標(biāo)記實(shí)驗(yàn)，分批培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)和連續(xù)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，證明了這種現(xiàn)象是一種新的 de et 生化反應(yīng)過程 AAvanGraaf,AMulderal，19

14、95 ，在此反應(yīng)中氨以亞硝 de 酸鹽作為電子受體，兩者生成氮?dú)狻AvanGraat等人提出了如圖I1所示 的厭氧氨氧化化學(xué)反應(yīng)模型。 AMMonium 這種生化過程被命名為厭氧氨氧化 ANaerobic 氮循環(huán)，尤其是海洋的氮循環(huán)中起著重要作用，有科學(xué)家認(rèn)為，海洋中有三分之 一到二分之一的反硝化發(fā)生在厭氧區(qū)，而在這些區(qū)域的由厭氧氨氧化所產(chǎn)生的 幾位科學(xué)家對(duì)發(fā)生在海洋底泥的厭氧氨氧化反應(yīng)進(jìn)行研究，在所研究的2個(gè)大陸 架區(qū)域，有2467的氨氣是由厭氧氨氧化反應(yīng)產(chǎn)生的 Bo Thamdrup，Tage Dalsgaard，2002 。在對(duì)海洋系統(tǒng)所作的厭氧氨氧化研究中，幾乎都發(fā)現(xiàn)了厭氧 氨氧化菌

15、種或其親緣菌種的存在。 厭氧氨氧化菌種屬于planctomycete 浮游霉菌門 ，其胞內(nèi)存在“分室” AVan A Niftrik,John anammoxosome，厭氧氨氧化反應(yīng)就在分室中進(jìn)行 Laura 中山大學(xué)碩士學(xué)位論文 Fuerstet a1，2004 。分室是以單層的梯形脂膜與細(xì)胞質(zhì)隔開的，這種獨(dú)特的梯 Damste， 形脂目前被用來追蹤自然生境中的厭氧氨氧化活動(dòng) JaapSSinninghe MStrousetal，2002 。 NH20H 復(fù)l 垂l 一 ， ， 刪 ，、 ， 硒 L_+差： ， ：NH4+被NH20H氧化成N2H4； ：N2地產(chǎn)生N2和還原當(dāng)量，還原當(dāng)量被

16、用于還原N02產(chǎn)生更多的NH20H ：N02。被氧化成N03一，產(chǎn)生還原當(dāng)量用于細(xì)胞生長。 圖ll厭氧氨氧化化學(xué)反應(yīng)模型 1-1ChemicalreactionmodelofAnammox Figure 厭氧氨氧化具有不需外加碳源，污泥產(chǎn)率低，耗氧量少等優(yōu)點(diǎn)。有學(xué)者在用 流化床反應(yīng)器處理污泥消化出水的實(shí)驗(yàn)中提出，將厭氧氨氧化用于廢水脫氮處理 el 可減少高達(dá)90的運(yùn)行成本 MikesMJetten，MWagnera1，2001 。將厭氧 氨氧化與其他工藝相結(jié)合，在廢水脫氮處理方面有廣泛的應(yīng)用前景。目前已經(jīng)開 et a1，2001；郭勇等，2004：趙宗 氨氧化處理垃圾滲濾液 KEgli，UFa

17、nger 面的應(yīng)用研究。 在厭氧氨氧化研究中，越來越多的研究者利用分子生物學(xué)技術(shù)探尋菌種進(jìn) 第一章緒論 化、群落演變和進(jìn)行菌種鑒定、原位觀察等，突破了傳統(tǒng)的微生物研究方法的局 限性，大大推動(dòng)了厭氧氨氧化的研究進(jìn)展。本論文應(yīng)用分子生態(tài)學(xué)技術(shù)中的隨機(jī) 擴(kuò)增多態(tài)性DNA RAPD 手段對(duì)分別以硝化污泥、反硝化污泥、厭氧產(chǎn)甲烷污 泥接種馴化的厭氧氨氧化反應(yīng)器的微生物群落進(jìn)行研究，以探尋在厭氧氨氧化污 泥馴化過程中微生物遺傳多態(tài)性的變化以及馴化各階段微生物群落問的遺傳關(guān) 系，為馴化過程微生物的厭氧氨氧化活性變化、菌種變化提供分子生物學(xué)上的分 析，以篩選最適合于馴化厭氧氨氧化微生物的接種物。 12分子生態(tài)

18、學(xué)技術(shù)及其在環(huán)境微生物研究中的應(yīng)用 I21傳統(tǒng)微生物生態(tài)學(xué)研究方法在微生物研究中的局限性 微生物具有一些和動(dòng)物、植物不同的特征：個(gè)體小，種類多，繁殖快，雜居 混生，適應(yīng)性強(qiáng)，易變異，分布廣，代謝類型多樣等。微生物間頻繁的遺傳物質(zhì) 交換，使得微生物群落表現(xiàn)出一定的遺傳可塑性和靈活性，在不同的選擇壓力條 件下新功能基因在微生物群落內(nèi)迅速擴(kuò)散，整個(gè)群落遺傳穩(wěn)定性相對(duì)較差。 傳統(tǒng)的以細(xì)胞學(xué)為基礎(chǔ)的微生物生態(tài)學(xué)理論及方法首先要從自然生境中將 微生物富集培養(yǎng)，采用不同的計(jì)數(shù)方法 如直接計(jì)數(shù)法、平板計(jì)數(shù)法、MPN法 計(jì)算各類群的數(shù)量及比例；然后根據(jù)研究的目的，選擇不同的富集培養(yǎng)基，有時(shí) 還需將微生物分離純化

19、，然后再對(duì)純培養(yǎng)物進(jìn)行一系列生理生化及遺傳性狀的研 究，最后鑒定其種類。傳統(tǒng)的分類鑒定方法是通過測定微生物的一些形態(tài)、生理、 生化、生態(tài)、生活史和血清學(xué)反應(yīng)等指標(biāo)，這種傳統(tǒng)研究手段不僅工作繁復(fù)、耗 時(shí)長，而且存在一些無法突破的局限。通過富集培養(yǎng)或純培養(yǎng)所取得的實(shí)驗(yàn)室研 究結(jié)果在反映微生物種群在自然群體中的數(shù)量比例、分布位置、活性、功能上都 有很大的片面性。而且，在富集培養(yǎng)的過程中，有些微生物世代時(shí)間長且很難進(jìn) 行分離，還有大量微生物由于無法取得其在自然生境中的生長繁殖條件而被淘 汰，這些微生物的不可培養(yǎng)性是傳統(tǒng)微生物生態(tài)學(xué)在揭示自然界微生物群落結(jié)構(gòu) 組成、生態(tài)功能及其相互關(guān)系研究中的最大障礙。

20、據(jù)認(rèn)為，由于自然環(huán)境尤其是 極端環(huán)境中存在大量不可培養(yǎng)的微生物 unculturablemicroorganisms ，已經(jīng)被 中山大學(xué)碩士學(xué)位論文 分離并鑒定的微生物僅占估計(jì)數(shù)量的極少一部分 張惠文等，2003 。 122分子生態(tài)學(xué)技術(shù)的發(fā)展 分子生態(tài)學(xué)是伴隨著分子生物學(xué)理論及其技術(shù)的不斷發(fā)展，向生態(tài)學(xué)研究領(lǐng) 域的不斷滲透，而逐步發(fā)展起來的一個(gè)新的交叉研究領(lǐng)域。1992年，Burke等在 分子生態(tài)學(xué) Molecular Ecology 的發(fā)刊詞中提出，分子生態(tài)學(xué)是應(yīng)用分子 生物學(xué)方法為生態(tài)學(xué)和種群生物學(xué)各領(lǐng)域提供革新見解的新興學(xué)科，確立了分子 生物學(xué)技術(shù)在分子生態(tài)學(xué)研究中的地位 鐘鳴，周啟星

21、，2002 。分子生態(tài)學(xué)包 括了許多分子生物學(xué)方法，較常用的研究手段有以下幾種。 一、核酸探針雜交技術(shù) 1988年，Giovannoni將原位雜交技術(shù)引入了細(xì)菌學(xué)的研究中 孫寓姣等， 2004 。他首先用放射性標(biāo)記rRNA寡聚核苷酸探針探測細(xì)菌。隨著安全性較強(qiáng) 的熒光技術(shù)的發(fā)展，1989年，DeLong首先用熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針來探測獨(dú) insitu 立的微生物細(xì)胞，此項(xiàng)技術(shù)即熒光原位雜交 fluorescent hybridization， FISH 技術(shù)。熒光原位雜交技術(shù)根據(jù)已知微生物不同分類級(jí)別上種群特異的DNA 序列，以利用熒光標(biāo)記的特異寡聚核苷酸片段作為探針，與環(huán)境中的基因組DNA

22、 分子雜交，檢測該特異微生物種群的存在與豐度。該方法的特點(diǎn)是可以進(jìn)行樣品 的原位雜交，應(yīng)用于環(huán)境中特定微生物種群鑒定、種群數(shù)量分析及其特異微生物 跟蹤檢測，是目前在分子微生物生態(tài)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用比較廣泛的一種方法。 除了原位雜交，還有Southern印跡雜交、Northern印跡雜交、斑點(diǎn)印跡和狹 線印跡雜交等不同方法 鐘鳴，周啟星，2002 ，都可以直接用來探測溶液中、 細(xì)胞組織內(nèi)或固定在膜上的同源核酸序列。核酸探針雜交技術(shù)都具有特異性高、 檢測靈敏度高等特點(diǎn)，使其廣泛地應(yīng)用于環(huán)境微生物的檢測中 孫寓姣等，2004； 張于光等，2005：彭永臻，高守有，2005 ，為定性、定量地分析目標(biāo)微生物的

23、存在、分布、豐度等提供了可靠有效的信息。 二、基于PCR技術(shù)的研究方法 chain reaction，PCR 、分子克隆和DNA序列 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) polymerase 第一章緒論 分析這三位一體的實(shí)驗(yàn)方法幾乎構(gòu)成了整個(gè)現(xiàn)代分子生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)工作的基礎(chǔ)。 PCR是用一對(duì)寡核苷酸引物，通過變性一退火一延伸這一周期的多次循環(huán)，使目的 DNA片段得到指數(shù)級(jí)的擴(kuò)增。PCR技術(shù)具有如此強(qiáng)大的擴(kuò)增能力并且能與其它 分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合應(yīng)用，使其敏感性、特異性大大增強(qiáng)，被廣泛地應(yīng)用于生 物、醫(yī)學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。由于PCR對(duì)生物醫(yī)學(xué)研究的巨大貢獻(xiàn)，其發(fā)明者KBMullis 榮獲1993年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。 1986年

24、，PCR的發(fā)明人KBMullis等最早報(bào)道了用大腸桿菌DNA聚合酶I Klenow片段體外擴(kuò)增哺乳動(dòng)物的單拷貝基因 薩姆布魯克，魯塞爾，2002 。 但直到1988年，熱穩(wěn)定DNA聚合酶的應(yīng)用才使PCR成為一種完善的、自動(dòng)化 的實(shí)驗(yàn)方法。PCR方法高效快速，且靈活、易于操作，到現(xiàn)今已經(jīng)衍生出許多 新的方法。在此僅對(duì)分子生態(tài)學(xué)中常用的PCR方法作概述。 1 核糖體DNA擴(kuò)增片段的限制性內(nèi)切酶分析 ARDRA DNArestriction ribosomal analysis 擴(kuò)增性rDNA限制性 ARDRA amplified 酶切片段多態(tài)性分析方法是由16SrDNAPCR技術(shù)與RFLP技術(shù)相結(jié)

25、合而發(fā)展起 rRNA基因 來的分子生態(tài)學(xué)研究技術(shù) 張惠文等，2003 。該方法是用來對(duì)16S 克隆文庫中的克隆進(jìn)行分型的一種方法，在構(gòu)建了16SrRNA基因克隆文庫后， 用ARDRA的方法對(duì)文庫中的克隆進(jìn)行分型，然后再對(duì)每個(gè)ARDRA類型中的代 表序列進(jìn)行測序，這樣就可以大大地縮減測序成本。該方法的分析樣品不受是否 可培養(yǎng)的影響，在植物共生微生物、寄生微生物多樣性及其系統(tǒng)學(xué)研究方面具有 獨(dú)特的優(yōu)越性，得到廣泛的應(yīng)用。 2 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA RAPD 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA randomamplifiedpolymorphicDNA，RAPD 技術(shù)是 一種DNA分子標(biāo)記技術(shù)，具有快速、通用性好

26、、對(duì)DNA需求量低、質(zhì)量要求 低等優(yōu)點(diǎn)。所謂隨機(jī)引物 random primer ，是指使用非特異序列的寡聚核苷酸 作為DNA合成過程中的引物，是與特異引物 specificprimer 相對(duì)應(yīng)的概念。 它與一般常用引物的區(qū)別在于其隨機(jī)性，隨機(jī)性在此有兩方面的含義：1，核苷 酸的排列順序是隨機(jī)的；2，所用引物的序列與模板鏈DNA的序列無直接相關(guān) 性 劉春宇等，1996 。RAPD技術(shù)可方便地檢測同源和異源等位基因的存在， 中山大學(xué)碩士學(xué)位論文 通過DNA指紋圖譜所反映的多態(tài)性及多態(tài)性間的相關(guān)性，來分析生物間的遺傳 關(guān)系和進(jìn)化關(guān)系等，被廣泛應(yīng)用于生物分類、基因鑒別、系統(tǒng)發(fā)育等方面 李亮 等，20

27、04；劉杰等，2001 。 3 變性，溫度梯度凝膠電泳 DGGETGG日 變性梯度凝膠電泳 denaturinggradientgelelectrophoresis，DGGE 是一種 可將長度相同但序列不同的DNA片段分離開的電泳方法。其原理是：DNA分子 中堿基的組成和排列差異，使不同序列的雙鏈DNA分子具有不同的解鏈溫度。 當(dāng)雙鏈DNA分子在含有變性劑 尿素和甲酰胺 的聚丙烯酰胺凝膠中電泳時(shí)， 因解鏈行為不同，使不同序列的DNA片段滯留于凝膠的不同位置形成相互分開 的譜帶 高蕙文等，2005 。溫度梯度膠電泳技術(shù) temperaturegradientgel electrophoresis

28、，TGGE 利用溫度梯度變性的原理，使不同核苷酸片段進(jìn)行分離 張惠文等，2003 。DGGE和TGGE技術(shù)在微生物多樣性檢測、微生物鑒定、 微生物分子變異以及種群異化等方面得到廣泛的應(yīng)用。 三、DNA序列分析 16SrDNA rDNA PCRj；-增片段核苷酸序列分析 16S PCR-Sequencing 技術(shù) 是對(duì)微生物細(xì)胞中16SrRNA基因進(jìn)行特異擴(kuò)增后對(duì)核苷酸序列進(jìn)行測定，然后 和已知菌種的16SrRNA進(jìn)行比對(duì)，以此進(jìn)行微生物鑒定和微生物系統(tǒng)學(xué)研究 張惠文等，2003 。由于該方法能夠準(zhǔn)確地進(jìn)行菌種鑒定，可用于確認(rèn)新種和 研究物種問的系統(tǒng)進(jìn)化，因此在微生物生態(tài)學(xué)研究中占有重要的地位。

29、 13分子生態(tài)學(xué)技術(shù)在厭氧氨氧化研究中的應(yīng)用 131菌種鑒定 由于厭氧氨氧化是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的生物反應(yīng)，而厭氧氨氧化細(xì)菌是一種厭氧自 養(yǎng)、生長緩慢的新型微生物，傳統(tǒng)的微生物分離技術(shù)無法將厭氧氨氧化細(xì)菌從其 生長環(huán)境中單獨(dú)分離出來以驗(yàn)證厭氧氨氧化反應(yīng)，因此利用16SrDNA序列分析 技術(shù)，對(duì)能夠進(jìn)行這一反應(yīng)的微生物作新種的確認(rèn)和系統(tǒng)進(jìn)化分析，在厭氧氨氧 第一章緒論 化研究中占有非常重要的地位。 最初MikesMJetten等人用細(xì)菌的通用引物對(duì)他們富集得到的厭氧氨氧化 微生物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，無法判斷進(jìn)行了厭氧氨氧化反應(yīng)的微生物究竟屬于哪一 類群 MikesMJetten，MStrousetal，19

30、99 。1999年，通過超聲波破碎、Percoll Strous 密度梯度離心等分離純化手段取得了厭氧氨氧化菌的純化細(xì)胞后，Marc 等人對(duì)其16SrRNA進(jìn)行了序列測定。將測得的序列與數(shù)據(jù)庫中其他細(xì)菌的16S rRNA序列進(jìn)行對(duì)比并作了系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果表明厭氧氨氧化菌種屬于分支很 rRNA序列的同源 深的planctomycete 浮游霉菌 ，與其他planctomycete的16S et 性為7477 MStrousJAFuersta1，1999 。在廢水處理系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的這兩 種厭氧氨氧化細(xì)菌分別被命名為Brocadia rDNA eta1，2001 。 作了更詳細(xì)的分析 MSchmid

31、，SSchmitzEsscr 國內(nèi)的學(xué)者從具有厭氧氨氧化活性的污泥中提取細(xì)菌總DNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增、 克隆、測序后，得到厭氧氨氧化菌部分16SrDNA序列，對(duì)其的進(jìn)化分析表明， 培養(yǎng)獲得的細(xì)菌與三種己知的厭氧氨氧化細(xì)菌在進(jìn)化上關(guān)系較近，但序列相似度 不高，認(rèn)為在自然環(huán)境中還存在一種以前未被發(fā)現(xiàn)的可進(jìn)行厭氧氨氧化的細(xì)菌 雒懷慶，胡勇有，2005a 。 人工系統(tǒng)中的厭氧氨氧化已經(jīng)得到確證并在持續(xù)研究當(dāng)中。然而，在自然環(huán) 境的氨循環(huán)中，厭氧氨氧化究竟扮演什么角色，除了人工系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的菌種外， 有無其他種類，又有科學(xué)家開展了這一方面的研究。2003年，MarcelMMKuypers 等人將其在黑海所作

32、的厭氧氨氧化研究結(jié)果發(fā)表在NatIlre上，這是首次確證 了自然環(huán)境中存在的厭氧氨氧化菌，并且其與環(huán)境中固定無機(jī)氮的去除有直接聯(lián) Sliekerset 系 Marcel a1，2003 。在黑海所作的這個(gè)研究 MMKuypersAOlav 的結(jié)果推斷，厭氧氨氧化可能消耗了黑海厭氧水體中約40的氮，所以厭氧氨氧 化在海洋氮循環(huán)中的作用是不可忽視的。研究者從黑海不同深度的厭氧水體中收 集了有機(jī)顆粒物，用厭氧氨氧化菌特有的階梯烷脂來追蹤厭氧氨氧化菌在這些顆 粒物中是否存在。結(jié)果從不同深度的提取物中發(fā)現(xiàn)了三種不同的階梯烷脂，然后 分析了提取的細(xì)胞中的16SrRNA序列。分析表明，從黑海中提取的這種屬于

33、 中山大學(xué)碩士學(xué)位論文 sorokinii 與Kuenenia Planctomycetes門的細(xì)菌 命名為Scalinduastuttgartiensis 的序列有879同源，與Brocadiaanammoxidans的有876同源。 132原位檢測 在復(fù)雜的自然生境中生長著各種各樣的微生物，以特異的寡聚核苷酸探針來 探測環(huán)境中厭氧氨氧化細(xì)菌的存在不失為一個(gè)絕佳的辦法。在黑海所作的厭氧氨 氧化研究中，研究者用提取獲得的DNA序列設(shè)計(jì)了以Cy3熒光染料染色的寡聚 核苷酸探針ArmxBS820，對(duì)研究的海域的微生物作熒光原位雜交 FISH 。研 zone ， 究發(fā)現(xiàn)厭氧氨氧化細(xì)菌不僅存在于層積的

34、中央盆地的缺氧區(qū)域 suboxic 而且存在于水流更強(qiáng)烈的外圍潮流區(qū)。這些結(jié)果表明了黑海中厭氧氨氧化細(xì)菌含 量豐富且活躍，對(duì)黑海的氮素循環(huán)起到不可忽視的作用 Marcel MMKuypersA OlavSliekerset a1，2003 。 另外一些研究者在對(duì)厭氧氨氧化細(xì)菌氧化丙酸鹽的實(shí)驗(yàn)中，也利用了熒光原 et a1，2005 。研究者每7到14天用FISH檢 位雜交技術(shù) DGuven，ADapena 測添加了丙酸鹽的反應(yīng)器內(nèi)微生物種群的變化，發(fā)現(xiàn)厭氧氨氧化富集培養(yǎng)物在觀 測的200天內(nèi)沒有發(fā)生顯著變異，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中厭氧氨氧化細(xì)菌以7080 的比例占據(jù)了整個(gè)微生物群落。針對(duì)其他反硝化細(xì)菌設(shè)計(jì)的探針在培養(yǎng)物內(nèi)沒有 檢測到目標(biāo)菌種。綜合其他實(shí)驗(yàn)結(jié)果，研究者認(rèn)為只有當(dāng)丙酸鹽的供給大于氨的 供給時(shí)，異養(yǎng)的反硝化細(xì)菌對(duì)丙酸鹽的利用才有可能超過厭氧氨氧化細(xì)菌。 研究處理高氨氮垃圾滲瀝液的生物接觸轉(zhuǎn)盤中的厭氧氨氧化現(xiàn)象時(shí)，KEgli 等人用Brocadiaanammoxidans的特異寡聚核苷酸探針確證了在他們的富集培養(yǎng) 物中存在厭氧氨氧化菌種，并估測富集培養(yǎng)物中約有90的厭氧