分光光度計測還原糖含量-中國農(nóng)大生化實驗實驗報告

1、.實驗報告實驗名稱： 班級：實驗人： 實驗時間：研究背景與目的：掌握還原糖含量測定的方法之一的3,5-二硝基水楊酸比色法，熟悉722分光光度計的主要用途、工作原理及使用流程。實驗原理：已知在植物體內(nèi)含有一定量的還原糖，利用還原糖的還原性，使其與3,5-二硝基水楊酸反應(yīng)，生成有吸光性的3-氨基-5硝基水楊酸。在某濃度范圍內(nèi)，該物質(zhì)在540nm下的光吸收與還原糖含量成正比，通過測定該物質(zhì)的消光值，查對標(biāo)準(zhǔn)曲線，便可得樣品中還原糖含量。儀器與試劑：722光柵分光光度計（上海精密科學(xué)儀器有限公司） 電熱恒溫水浴鍋（型號：雙列八孔 標(biāo)號：09035 天津市中環(huán)實驗電爐有限公司） 電磁爐 架盤天平 具塞刻

2、度試管 15ml*9 移液器 100ul1000ul 容量瓶 100ml*9 燒杯 研缽 漏斗2mg/ml 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液 10mg/ml 3,5-二硝基水楊酸溶液蒸餾水實驗步驟：1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取7只15ml具塞刻度試管，編號，分別加入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.0毫升，然后用移液器向各試管加蒸餾水，使最后體積為1.0毫升，搖勻，再各加入3,5-二硝基水楊酸溶液1毫升，搖勻，在沸水浴中準(zhǔn)確加熱5分鐘，取出冷卻至室溫，用蒸餾水稀釋至15毫升混勻，用分光光度計在540nm下測定消光值。以消光值為縱坐標(biāo)，葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2植物樣品中還原糖的提取將植物

3、樣品蘋果稱取1g放入研缽中，加入少量石英砂，磨成勻漿，轉(zhuǎn)移到100毫升容量瓶中，用蒸餾水少量多次地清洗研缽，再將洗液轉(zhuǎn)移到容量瓶中，至70-80ml，搖勻，置于80度恒溫水浴中浸提半小時，其間搖勻數(shù)次，是還原糖浸出。3還原糖含量的測定待上述提取液冷卻到室溫，過濾，濾液達(dá)十幾毫升即可，取濾液1毫升放入15ml具塞刻度試管中，加入1毫升3,5-二硝基水楊酸溶液，搖勻后在沸水浴中準(zhǔn)確加熱5分鐘，取出冷卻后稀釋到15毫升。使用722分光光度計測定OD540值。（作兩個重復(fù)組取平均值）。數(shù)據(jù)整理與計算：編號123456789濃度mg/ml0.0000 0.01330.04000.06670.09330.

4、12000.13330.05310.0525吸光度0.000 0.0630.2540.4560.6580.8390.9410.3540.350 從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出樣品的OD540值對應(yīng)的還原糖量A（mg/ml），然后按下列公式計算樣品中還原糖含量。 還原糖含量（%）=【A*樣品稀釋總體積（ml）/（樣品重*1000）】*100%將數(shù)據(jù)代入公式，得（1） 還原糖含量=【0.0531*15*100/(1*1000)】*100%=7.96%（2） 還原糖含量=【0.0525*15*100/(1*1000）】*100%=7.88%（3） 平均值=（7.96%+7.88%）=7.92%結(jié)果分析：所得兩組數(shù)

5、據(jù)的吸光度值不相同，以至于所得濃度也不相同，其中可能存在的原因是使用具塞刻度試管稀釋時存在終點標(biāo)定誤差。然而兩組數(shù)據(jù)取平均值，使誤差減小在允許范圍內(nèi)。思考題：1 比色測定法的原理及特點是什么？原理：光吸收定律即朗伯-比爾定律，由于物質(zhì)對光有選擇吸收的作用且在一定濃度范圍內(nèi)，物質(zhì)在某波長下的光吸收與其濃度成正比，所以利用標(biāo)準(zhǔn)溶液求得標(biāo)準(zhǔn)光吸收曲線，再根據(jù)所得吸光度值在標(biāo)準(zhǔn)曲線中尋找相對應(yīng)的點即可知道未知溶液的濃度。光吸收簡便，快速，靈敏度高，準(zhǔn)確度較高，應(yīng)用廣泛。2 比色測定法中為什么要設(shè)空白，設(shè)空白時要注意什么？消除溶液中其他因素的影響，設(shè)置空白時要注意只有葡萄糖濃度一個自變量變化，保證其他量

6、均相同。3 試分析一下樣品的稀釋倍數(shù)是如何確定的以及對測定結(jié)果的影響。實驗原理中講到，在一定濃度范圍內(nèi)，吸光度與還原糖含量呈正比，由由于吸光度要控制在0.2至0.8之間，所以所需濃度便可知，即可通過稀釋溶液實現(xiàn)。如果不在范圍內(nèi)，則超出呈正比的范圍，所得濃度就會不準(zhǔn)確。4 為什么還原糖與3,5-二硝基水楊酸溶液要先反應(yīng)后稀釋？因為稀釋前還原糖濃度較高，并且3,5-二硝基水楊酸溶液過量，這樣可以使得還原糖充分反應(yīng)，如果先稀釋則還原糖濃度較低，反應(yīng)時間加長，速率較慢。5 結(jié)合實際應(yīng)用，你認(rèn)為本實驗設(shè)計有什么不合理之處？實驗中，容量瓶的使用。參考文獻(xiàn)：揭念芹基礎(chǔ)化學(xué)2000年9月第一版 2008年7月第八次印刷 孫英分析化學(xué)實驗2009年3月第一版袁靜明 趙強 3,5二硝基水楊酸法測定葡萄糖方法的改進(jìn)（山西大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版）1986年01期 722分光光度計的使用說明實驗小結(jié)：這是第一次的生物化學(xué)實驗，與同伴的配合中仍然存在著默契程度不足的問題，相信在日后的實驗中會有所改進(jìn)，其次，由于在實驗前沒有做