自由基清除劑

1、第五章 自由基清除劑本章要點1. 自由基理論的產(chǎn)生機(jī)理及來源2. 自由基對機(jī)體活動的影響3. 自由基清除劑的基本概念隨著生命科學(xué)的飛速發(fā)展，英國人Harman于1956年提出了自由基學(xué)說。該學(xué)說認(rèn)為，自由基攻擊生命大分子造成組織細(xì)胞損傷，是引起機(jī)體衰老的根本原因，也是誘發(fā)腫瘤等惡性疾病的重要起因，其中的觀點被越來越多的實驗所證明。自由基（Free radical）是人體生命活動中各種生化反應(yīng)的中間代謝產(chǎn)物，具有高度的化學(xué)活性，是機(jī)體有效的防御系統(tǒng)，若不能維持一定水平則會影響機(jī)體的生命活動。但自由基產(chǎn)生過多而不能及時地清除，它就會攻擊機(jī)體內(nèi)的生命大分子物質(zhì)及各種細(xì)胞器，造成機(jī)體在分子水平、細(xì)胞水

2、平及組織器官水平的各種損傷，加速機(jī)體的衰老進(jìn)程并誘發(fā)各種疾病。近年來，國內(nèi)外對自由基及自由基清除劑的研究十分活躍，在各類食品科學(xué)、生命科學(xué)及醫(yī)學(xué)書籍上都有許多關(guān)于自由基及其清除劑的研究報道，自由基清除劑作為功能性食品的重要原料成分之一，通過人們?nèi)粘ＯM的食品來調(diào)節(jié)人體內(nèi)自由基的平衡，已受到食品營養(yǎng)學(xué)家的廣泛重視。第一節(jié) 自由基理論一、自由基的產(chǎn)生機(jī)理及來源自由基又叫游離基，它是由單質(zhì)或化合物的均裂（Homdytic Fission）而產(chǎn)生的帶有未成對電子的原子或基團(tuán)。它的單電子有強(qiáng)烈的配對傾向，傾向于以各種方式與其他原子基團(tuán)結(jié)合，形成更穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，因而自由基非?；顫姡蔀樵S多反應(yīng)的活性中間體。

3、人體內(nèi)的自由基分為氧自由基和非氧自由基。氧自由基占主導(dǎo)地位，大約占自由基總量的95%。氧自由基包括超氧陰離子（O2）、過氧化氫分子（H2O2）、羥自由基（OH）、氫過氧基（HO2）、烷過氧基（ROO）、烷氧基（RO）、氮氧自由基（NO）、過氧亞硝酸鹽（ONOO）、氫過氧化物（ROOH）和單線態(tài)氧（1O2）等，它們又統(tǒng)稱為活性氧（reactive oxygen species，ROS），都是人體內(nèi)最為重要的自由基。非氧自由基主要有氫自由基（H）和有機(jī)自由基（R）等。（一）自由基的產(chǎn)生人體細(xì)胞在正常的代謝過程中，或者受到外界條件的刺激（如高壓氧、高能輻射、抗癌劑、抗菌劑、殺蟲劑、麻醉劑等藥物，香煙

4、煙霧和光化學(xué)空氣污染物等作用），都會刺激機(jī)體產(chǎn)生活性氧自由基。人體內(nèi)酶催化反應(yīng)是活性氧自由基產(chǎn)生的重要途徑。人體細(xì)胞內(nèi)的黃嘌呤氧化酶、髓過氧化物酶和NADPH氧化酶等在進(jìn)行酶促催化反應(yīng)時，會誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的自由基中間產(chǎn)物。除酶促反應(yīng)外，生物體內(nèi)的非酶氧化還原反應(yīng)，如核黃素、氫醌、亞鐵血紅素和鐵硫蛋白等單電子氧化反應(yīng)也會產(chǎn)生自由基。外界環(huán)境，如電離輻射和光分解等也能刺激機(jī)體產(chǎn)生自由基反應(yīng)，如分子中的共價鍵均裂后即形成自由基。自由基反應(yīng)包含3個階段，即引發(fā)、增長和終止階段。反應(yīng)之初，引發(fā)階段占主導(dǎo)地位，反應(yīng)體系中的新生自由基形成許多鏈的開端，反應(yīng)物濃度高。引發(fā)后的擴(kuò)展階段為反應(yīng)的主體，若起始有幾個引

5、發(fā)自由基在擴(kuò)展階段沒有消失或增加，那么反應(yīng)中就有幾條鏈。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，體系中的反應(yīng)物濃度越來越低，自由基相互碰頭的機(jī)會越來越多，反應(yīng)速度就越來越慢，自由基越來越少，最后反應(yīng)停止。由此可見，自由基反應(yīng)動力學(xué)有別于普通的分子反應(yīng)，自由基可以連續(xù)傳遞而出現(xiàn)連鎖反應(yīng)。過氧化物作為引發(fā)劑可以使反應(yīng)在較低溫度下進(jìn)行，如果反應(yīng)體系中有自由基清除劑存在，它就能很快地捕捉自由基使擴(kuò)散不能形成?；钚詮?qiáng)的自由基清除劑能阻止連鎖反應(yīng)的開始。因為氧分子與許多有機(jī)物反應(yīng)時產(chǎn)生自由基，而自由基清除劑能捕捉過氧自由基而中斷連鎖反應(yīng)，阻止有機(jī)物的氧化，所以自由基清除劑又稱為抗氧化劑。（二）自由基的來源人體內(nèi)特定的自由基有不同

6、的來源。超氧陰離子自由基（O2）在其中扮演著非常重要的角色，因為在反應(yīng)順序上其他許多活性中間產(chǎn)物的形成都始于與 O2起作用。它是從黃嘌呤氧化酶、NADPH氧化酶通過酶的一電子還原作用釋放的氧產(chǎn)生的或由呼吸鏈裂解生成的。人體利用的氧氣中約有1%3%轉(zhuǎn)化為O2。過氧化氫分子（H2O2）也是一種重要的非自由基活性物，容易在活細(xì)胞中擴(kuò)散。過氧化氫酶能有效地將其轉(zhuǎn)變成水，生成氧自由基。羥自由基（OH）的活性最強(qiáng)，其半衰期估計為10-9秒，其產(chǎn)生后能迅速起反應(yīng)。在射線等高能輻射下，通過體內(nèi)水的均裂作用或經(jīng)金屬催化過程由內(nèi)源的過氧化氫分子形成。紫外線能將過氧化氫分子分裂成兩個羥自由基分子。過氧基自由基的半衰

7、期比較長，可達(dá)數(shù)秒，在生物系統(tǒng)中擴(kuò)散的途徑相當(dāng)長。在脂質(zhì)過氧化過程中，從多不飽和脂肪酸去掉一個氫原子開始，能形成過氧基自由基。羥自由基能啟動這一反應(yīng)過程。脂質(zhì)過氧化作用進(jìn)一步產(chǎn)生烷氧自由基（RO）和有機(jī)的氫過氧化物（ROOH），后者可能重排成為內(nèi)過氧化物中間產(chǎn)物，然后分裂產(chǎn)生乙醛。單線態(tài)分子氧（1O2）是另一種非自由基的活性物，可能是體內(nèi)的組織暴露于光中形成的。其半衰期估計為10-6秒，具體時間取決于周圍基質(zhì)的性質(zhì)。它能通過轉(zhuǎn)移其激發(fā)態(tài)能量或通過化學(xué)結(jié)合與其它分子相互作用。單線態(tài)分子氧優(yōu)先發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的靶為雙鍵部位。氧化氮自由基（NO）也是一種很重要的自由基，它是精氨酸在酶作用下形成的一種信號

8、化合物，能松弛血小管平滑肌，防止血小板的凝集，從而降低血壓。也可通過激活參與初級免疫的巨嗜細(xì)胞而產(chǎn)生。它的半衰期為650秒，很容易與氧發(fā)生反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物NO2也是自由基。它還能與生物分子直接反應(yīng)或與O2結(jié)合形成過氧亞硝酸鹽（ONOO）。NO過多會產(chǎn)生細(xì)胞毒性。二、自由基對機(jī)體生命活動的影響自由基是體內(nèi)各種生化反應(yīng)的中間代謝產(chǎn)物，在人體的生命活動過程中，各種生化反應(yīng)，不管是酶促反應(yīng)還是非酶促反應(yīng)，都會產(chǎn)生各種自由基。從自由基的化學(xué)結(jié)構(gòu)可以看出，它含有未配對的電子，是一類具有高度化學(xué)活性的物質(zhì)。在正常的情況下，體內(nèi)自由基處于不斷產(chǎn)生與清除的動態(tài)平衡之中，并在代謝中發(fā)揮著重要作用，參與一些酶和前列腺

9、素的合成，增強(qiáng)白細(xì)胞吞噬活性，提高殺菌效果等。但是，如果自由基過多或清除過慢，則會對人體造成嚴(yán)重危害。（一）自由基積極的生物學(xué)功能自由基作為人體正常的代謝產(chǎn)物，對維持機(jī)體的正常代謝有特定的促進(jìn)作用。這種促進(jìn)作用主要表現(xiàn)在對機(jī)體危害物的防御作用。1增強(qiáng)白細(xì)胞的吞噬功能，提高殺菌效果白細(xì)胞在吞噬細(xì)菌的過程中，對氧的消耗量激增，會產(chǎn)生大量的O2和H2O2 ，兩者通過Haber-Weiss 反應(yīng)還會進(jìn)一步產(chǎn)生OH，這些活性氧對病原菌都有很強(qiáng)的殺滅效果。OH還可引發(fā)被吞噬細(xì)菌的不飽和脂肪酸降解，降解終產(chǎn)物丙二醛也是一種強(qiáng)力殺菌劑，足以致細(xì)菌死亡。2促進(jìn)前列腺素的合成前列腺素是人體內(nèi)的一種重要的激素，它以

10、花生四烯酸為前驅(qū)物質(zhì)，經(jīng)膜上多酶系統(tǒng)催化氧化生成，其生物合成途徑中必須有氧自由基（OH或O2）的參與。3參與脂肪加氧酶的生成血小板脂肪加氧酶作用于花生四烯酸生成1，2-氫過氧化-5，8，11，14-碳四烯酸（12-HPETE）及其他相關(guān)的化合物，該類化合物是一系列具有強(qiáng)生物學(xué)活性化合物（如白三烯）的前體。在HPETE形成過程中有活性氧自由基參與。4參與膠原蛋白的合成膠原蛋白的前體稱原膠原蛋白。原膠原蛋白中的脯氨酸和賴氨酸經(jīng)羥化酶的羥化作用是原膠原蛋白合成的關(guān)鍵步驟。在此酶促羥化過程中，需要O2、H2O2 、OH或 1O2等活性氧自由基的參與。5參與肝臟的解毒作用機(jī)體對外來毒物的解毒作用主要在肝

11、臟進(jìn)行，解毒作用實質(zhì)是在肝微粒體細(xì)胞色素 P450催化下對各類毒物的羥化作用。一定劑量范圍內(nèi)的外來毒物可被羥化并排出體外而完成解毒作用，當(dāng)劑量大時，機(jī)體受不住就會出現(xiàn)中毒。在肝解毒過程中，連接于細(xì)胞色素上的O2自由基是真正起羥化作用的物質(zhì)。6參加凝血酶原的合成凝血酶原是凝血酶的前體。在凝血酶原合成過程中，其前體蛋白質(zhì)氨基端的10個谷氨酸殘基經(jīng)過酶促羧化作用轉(zhuǎn)變?yōu)?0個-羧基谷氨酸殘基，形成凝血酶原。該羧化過程與氧自由基密切相關(guān)，沒有氧自由基的參加，就不能形成凝血酶原。7參與血管壁松弛而降血壓NO是精氨酸在酶作用下形成的一種信號化合物，還作為細(xì)胞松弛因子而松弛血管壁，降低血壓。血管擴(kuò)張劑（如乙酰

12、膽堿等）啟動一個鈣調(diào)節(jié)受體，在NO合成酶催化和NADPH參與下，氧化L-精氨酸的胍基生成NO并釋放到細(xì)胞外。接著活化可溶性鳥苷酸環(huán)化酶，使血管平滑肌與血小板中的cGMP水平增加，從而促進(jìn)血管平滑肌松弛，抑制血小板凝聚和粘附到內(nèi)皮細(xì)胞上。8殺傷外來微生物和腫瘤細(xì)胞NO和O2結(jié)合以后生成ONOO陰離子，在略高于生理pH的堿性條件下相當(dāng)穩(wěn)定，從而允許其由生成位置擴(kuò)散轉(zhuǎn)移到較遠(yuǎn)的位置。一旦在低于生理pH的酸性條件下（病理條件下往往如此），ONOO立即分解生成NO和O2，這兩種自由基的氧化性非常強(qiáng)，具有很大的細(xì)胞毒性，對于殺傷外來微生物和腫瘤細(xì)胞非常有意義。然而，在生命活動中，由于經(jīng)常受到各種外界不良因

13、素的刺激，導(dǎo)致機(jī)體組織中的自由基數(shù)量往往過多，甚至對機(jī)體組織產(chǎn)生危害。（二）自由基對生命大分子的損害自由基具有高度的活潑性和極強(qiáng)的氧化反應(yīng)能力，能通過氧化作用攻擊體內(nèi)的生命大分子，如核酸、蛋白質(zhì)、糖類和脂質(zhì)等，使這些物質(zhì)發(fā)生過氧化變性、交聯(lián)和斷裂，從而引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞，導(dǎo)致機(jī)體的組織破壞和退行性變化。OH 是最活潑的自由基，也是毒性最大的自由基。它可和活細(xì)胞中的任何分子發(fā)生反應(yīng)而造成損傷，而且反應(yīng)速度極快，被破壞的分子遍及糖類、氨基酸、磷脂、核苷和有機(jī)酸等。O2的毒性是機(jī)體發(fā)生氧中毒的主要原因，由它引起的損傷表現(xiàn)在使核酸鏈斷裂、多糖解聚及不飽和脂肪酸過氧化作用，進(jìn)而造成膜損傷、線粒體氧

14、化磷酸化作用的改變及其他一系列的變化。所有能產(chǎn)生 O2的生物系統(tǒng)都能通過歧化反應(yīng)生成 H2O2，能使少數(shù)酶的-SH（巰基）氧化失活。因為H2O2能迅速穿過細(xì)胞膜，而O2不能，在細(xì)胞內(nèi)的H2O2能與Fe2+ 或Cu2+ 離子反應(yīng)生成OH，另外紫外線也能使H2O2均裂生成OH，這是H2O2毒性的真正原因。1自由基對核酸的損害自由基作用于核酸類物質(zhì)會引起一系列的化學(xué)變化。例如，氨基或羥基的脫除、堿基與核糖連接鏈的斷裂、核糖的氧化和磷酸質(zhì)鍵的斷裂等。反應(yīng)還會形成新的自由基，發(fā)生連鎖反應(yīng)，導(dǎo)致核酸堿基破壞，產(chǎn)生遺傳突變，嚴(yán)重受損的不能修復(fù)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。2自由基對蛋白質(zhì)的損害自由基可直接作用于蛋白質(zhì)，也

15、可通過脂類過氧化產(chǎn)物間接作用于蛋白質(zhì)而產(chǎn)生破壞作用。如過氧自由基（ROO）可使蛋白質(zhì)分子發(fā)生交聯(lián)，生成變性的高聚物，其他自由基則可使蛋白質(zhì)的多肽鏈斷裂，并使個別氨基酸發(fā)生化學(xué)變化。更嚴(yán)重的是，自由基可改變酶蛋白的化學(xué)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致酶生物活性的喪失。3自由基對糖類的損害自由基通過氧化性降解使多糖斷裂，如影響腦脊液中的多糖，從而影響大腦的正常功能。自由基使核糖、脫氧核糖形成脫氫自由基，導(dǎo)致DNA主鏈斷裂或堿基破壞，還可使細(xì)胞膜寡糖鏈中糖分子羥基氧化，生成不飽和的羰基或聚合成雙聚物，從而破壞細(xì)胞膜上的多糖結(jié)構(gòu)，影響細(xì)胞免疫功能的發(fā)揮。4自由基對脂質(zhì)的損害脂質(zhì)中的多不飽和脂肪酸由于含有多個雙鍵而化學(xué)性質(zhì)活

16、潑，最易受自由基的破壞，發(fā)生過氧化反應(yīng)。磷脂是構(gòu)成生物膜的重要部分，因富含多不飽和脂肪酸故極易受自由基破壞。膜中磷脂發(fā)生過氧化作用，會引起膜中蛋白質(zhì)及酶的交聯(lián)或失活，導(dǎo)致膜通透性的變化，嚴(yán)重影響膜的各種生理功能。亞細(xì)胞器膜磷脂所含的不飽和脂肪酸比質(zhì)膜的還多，所以對過氧化反應(yīng)更為敏感。如果細(xì)胞內(nèi)線粒體膜被氧化受損，則會使能量生成系統(tǒng)受到影響。溶酶體膜若受到破壞則會釋放出其中的水解酶系，會使細(xì)胞內(nèi)多種物質(zhì)水解，嚴(yán)重時甚至?xí)斐杉?xì)胞自溶，組織壞死。由此可見，若自由基對生物膜的破壞很嚴(yán)重，就會引起細(xì)胞功能的極大紊亂。（三）自由基學(xué)說人們根據(jù)對衰老機(jī)理的不同理解，提出了許多種衰老學(xué)說，主要有自由基學(xué)說、

17、免疫功能下降學(xué)說、腦中心學(xué)說、代謝失調(diào)學(xué)說、生物膜衰老學(xué)說、脂褐素與衰老學(xué)說、衰老過程中基因淋巴因子及其基因表達(dá)改變的學(xué)說等。自由基學(xué)說能比較清楚地解釋機(jī)體衰老過程中的種種癥狀，如老年斑、皺紋及免疫力下降等，是目前最有說服力的學(xué)說。自由基學(xué)說認(rèn)為，自由基的強(qiáng)氧化作用，損傷了機(jī)體的生命大分子，引起人體細(xì)胞免疫和體液免疫的功能減弱，最終導(dǎo)致免疫疾病的出現(xiàn)。其作用機(jī)理可概括為以下幾個方面。1生命大分子的交聯(lián)聚合和脂褐素的累積自由基作用于脂質(zhì)能發(fā)生過氧化反應(yīng)，其氧化的終產(chǎn)物丙二醛等會引起蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合，形成脂褐素。由于脂褐素不溶于水，所以不能隨著機(jī)體的代謝排出體外，在細(xì)胞內(nèi)逐漸堆積

18、。其顆粒呈圓形或橢圓形，直徑約為15微米，顆粒大小會隨年齡的增大而增大。老年斑就是由脂褐素在皮膚的堆積而形成的，老年斑的出現(xiàn)是人體衰老的一個明顯的外表象征。另外，隨著膠原蛋白的交聯(lián)聚合，會使膠原蛋白溶解性下降、彈性降低及水合能力減弱，會導(dǎo)致皮膚失去張力，皺紋增多，老年骨質(zhì)再生能力減弱等。脂褐素在腦細(xì)胞中的堆積，會出現(xiàn)記憶力的減退或使智力發(fā)生障礙，甚至出現(xiàn)老年性癡呆癥。眼球晶狀體長期暴露于光和氧中，極易發(fā)生脂質(zhì)氧化損傷，導(dǎo)致視網(wǎng)膜模糊，引起白內(nèi)障和老年黃斑變性。2器官組織細(xì)胞的破壞與減少器官組織細(xì)胞的破壞與減少是機(jī)體衰老的癥狀之一。器官組織細(xì)胞破壞或減少主要是由于自由基引起的脂質(zhì)過氧化而造成對細(xì)

19、胞膜與細(xì)胞器膜的損害，改變了生物膜的結(jié)構(gòu)與功能，影響了膜的通透性與流動性，從而導(dǎo)致了膜功能的紊亂，加快機(jī)體的衰老。另外，自由基作用于核酸引起的基因突變改變了遺傳信息的傳遞，導(dǎo)致蛋白質(zhì)與酶的合成錯誤及酶活性的降低。自由基還可與膜上的酶發(fā)生作用，影響細(xì)胞正常生理功能的發(fā)揮。自由基通過對脂質(zhì)的侵襲加速了細(xì)胞的衰老進(jìn)程。這些結(jié)果的積累，造成了器官組織細(xì)胞的老化與死亡。 3免疫功能的降低免疫功能是指機(jī)體抵抗外來有害物質(zhì)入侵的能力。人體內(nèi)的免疫系統(tǒng)包括細(xì)胞免疫和體液免疫。自由基作用于免疫系統(tǒng)，會引起人體細(xì)胞免疫與體液免疫功能減弱，并使免疫識別力下降，免疫系統(tǒng)在攻擊病原體和異常的細(xì)胞時，也侵犯了自身正常的細(xì)

20、胞和健康組織而出現(xiàn)自身免疫性疾病。有研究表明，彌散性硬皮病、系統(tǒng)性硬結(jié)、潰瘍性結(jié)腸炎和成膠質(zhì)病變等自身免疫性疾病往往伴有較多的染色體斷裂現(xiàn)象，這類病人血液中有一種血清因子能夠促進(jìn)正常的淋巴細(xì)胞染色體發(fā)生斷裂。自身免疫疾病的病變過程與自由基關(guān)系密切，其致病機(jī)理可能是由于特殊血清斷裂因子的作用或細(xì)胞的氧化代謝而產(chǎn)生了大量的OH和O2所致。（四）自由基與疾病的關(guān)系越來越多的臨床和干預(yù)實驗，以及來自基礎(chǔ)研究的證據(jù)表明，自由基參與許多疾病的病理過程，從而誘發(fā)如心血管疾病、某些癌癥、老年白內(nèi)障和黃斑變性、某些炎癥及多種神經(jīng)元疾病。1自由基與心血管疾病大多數(shù)心血管疾病的主要原因是動脈粥樣硬化，是動脈壁的一種

21、多因素疾病。自由基攻擊動脈血管壁和血清中的不飽和脂肪酸使之發(fā)生過氧化反應(yīng)而生成過氧化脂質(zhì)，后者能刺激動脈壁，增加粥樣硬化的趨勢。動脈硬化的程度與硬化斑中脂質(zhì)過氧化程度呈正相關(guān)，血管內(nèi)壁的蠟樣物質(zhì)就是脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)的直接證明。動脈粥樣硬化的早期，在內(nèi)皮下層間隙形成脂質(zhì)沉淀，即所謂的脂肪條紋。隨著年齡的增加，粥樣硬化癥呈增多的趨勢，這與老年人動脈壁不飽和脂肪酸含量高，血清中Fe2+和Cu2+含量高，F(xiàn)e2+或Cu2+通過Haber-Weiss反應(yīng)促使OH產(chǎn)生，OH的存在加劇了脂質(zhì)過氧化進(jìn)程。過氧化產(chǎn)物丙二醛促使彈性蛋白發(fā)生交聯(lián)，破壞了其正常的結(jié)構(gòu)和功能，其應(yīng)有的彈性與水結(jié)合能力喪失，最終產(chǎn)生了

22、動脈硬化癥，從而引起冠心病等其他心血管疾病。2自由基與癌癥致癌過程是一個復(fù)雜的多階段的過程，包括誘發(fā)和促進(jìn)兩步。一個正常的細(xì)胞發(fā)生癌變必須經(jīng)歷誘發(fā)和促進(jìn)這兩個階段，這就是兩步致癌學(xué)說。大量研究證明，誘發(fā)階段與自由基關(guān)系密切，促癌階段也與自由基有關(guān)，促癌能力與其產(chǎn)生自由基的能力相平行。致癌物必須在體內(nèi)經(jīng)過代謝活化形成自由基并攻擊DNA才能致癌，抗癌劑也必須通過自由基形式去殺死癌癥。3自由基與肺氣腫自由基作用于肺部的巨嗜細(xì)胞，使其釋放了蛋白水解酶類而導(dǎo)致了對肺組織的損傷破壞，從而引起細(xì)支氣管和肺泡管的破裂，肺泡間隔面積縮小，周圍血液與肺之間氣體交換量減少，導(dǎo)致肺氣腫。正常情況下，肺組織細(xì)胞間的蛋白

23、酶與抗蛋白酶能夠保持平衡，蛋白酶抑制劑控制著水解蛋白酶類的釋放與活性。如果缺乏這種抑制劑，就有可能導(dǎo)致肺氣腫。長期吸入香煙及其他大氣中的污染物，會使肺中氧自由基增多，使水解蛋白酶增多和使水解蛋白酶的天然抑制劑失活，最終導(dǎo)致肺氣腫的出現(xiàn)。4自由基與缺血后重灌流損傷缺血所引起的組織損傷是致死性疾病的主要原因。有許多證據(jù)說明，在完全性缺血、缺氧時，組織損傷程度較輕，而在缺血后再灌注時，由于自由基的急劇增多而使組織損傷更加嚴(yán)重。在缺血后重灌流狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)的氧自由基主要來自黃嘌呤氧化酶，它是由前體黃嘌呤脫氫酶轉(zhuǎn)變而來的。該脫氫酶廣泛存在于各種組織細(xì)胞中，它是以NAD+為電子接受體，所以不產(chǎn)生自由基。當(dāng)

24、組織細(xì)胞缺血時，ATP生成量減少，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)能量不足，不能維持正常的離子濃度。于是，Ca+重新分布使得細(xì)胞內(nèi)Ca+濃度增大，激活了一種蛋白酶而將脫氫酶不可逆地轉(zhuǎn)化成氧化酶。另外，缺血使得細(xì)胞內(nèi)ATP減少，AMP增多，AMP又可逐步分解成次黃嘌呤，而次黃嘌呤是氧化酶的適宜作用底物。當(dāng)重灌流時，氧分子重新進(jìn)入組織，與組織中積累的次黃嘌呤和氧化酶發(fā)生反應(yīng)，生成大量的活性氧自由基。這些活潑且有強(qiáng)氧化性的自由基使細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，使透明質(zhì)酸和膠原蛋白降解，從而改變了細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能，造成組織的不可逆損傷。另外，在缺血組織中具有清除自由基的抗氧化酶類合成能力發(fā)生障礙，從而加劇了自由基對缺血后重灌流組織的損

25、傷。5自由基與眼病由自由基氧化損傷引起的視力損害，最常見的當(dāng)數(shù)白內(nèi)障和老年黃斑變性。老年人由于全身機(jī)體的衰老使得眼球晶狀體中自由基清除劑的含量與活性降低，導(dǎo)致對自由基侵害的抵御能力降低。許多事實表明，白內(nèi)障的起因和發(fā)展與自由基對視網(wǎng)膜的損傷導(dǎo)致晶狀體組織的破壞有關(guān)。又由于眼晶狀體長期暴露于光和氧中，所形成的活性氧類物質(zhì)可能與晶體蛋白質(zhì)起反應(yīng)。受損的蛋白質(zhì)可能聚合和沉淀，從而喪失原來的功能。視覺活性最高的視網(wǎng)膜組織易受損害，從而引起老年黃斑變性。6自由基與炎癥當(dāng)局部氧量過少或外來病原菌侵襲時，大量多形嗜中性白細(xì)胞積聚在病變處。這些白細(xì)胞由特殊作用的代謝物激活，結(jié)合在膜上的NADPH2氧化酶被激活

26、，氧化NADPH2成為NADP+，同時產(chǎn)生大量的O2。氧自由基一方面破壞病原菌和病變細(xì)胞，另一方面進(jìn)攻白細(xì)胞本身而造成白細(xì)胞大量死亡，引起溶酶體酶的大量釋放，進(jìn)而殺傷組織細(xì)胞，造成骨、軟骨的破壞，導(dǎo)致炎癥和關(guān)節(jié)炎。7自由基與貧血 貧血的出現(xiàn)也與自由基有關(guān)。據(jù)研究表明，地中海貧血的病理變化包含紅細(xì)胞膜的過氧化，膜上多不飽和脂肪酸含量減少，-SH轉(zhuǎn)變成-S-S基團(tuán)和維生素E含量減少。缺鐵性貧血的病變過程也有自由基參與，因為此時紅細(xì)胞的維生素E和過氧化酶含量減少，易被自由基破壞而縮短壽命。8自由基與癲癇有關(guān)研究證明，癲癇活動伴有活躍的自由基反應(yīng)。清除自由基，阻斷自由基反應(yīng)對癲癇的預(yù)防和治療有一定作用

27、。自由基反應(yīng)在癲癇發(fā)生中的作用日益受到重視。目前認(rèn)為，老年性聾與自由基受損關(guān)系密切；自由基與糖尿病也有比較復(fù)雜的關(guān)系；大骨節(jié)病與克山病也有密切的關(guān)系。隨著自由基理論的研究發(fā)展，許多人類重大疾病與自由基反應(yīng)的關(guān)系正在逐步被揭示。自由基對人類健康的影響作用正在被更多的人所接受，越來越多的專家正在運用自由基理論，在確保人體健康方面的研究中取得較大的成果。第二節(jié) 自由基清除劑一、自由基清除劑簡介自由基是人體正常的代謝產(chǎn)物，正常情況下人體內(nèi)自由基是處于不斷產(chǎn)生與清除的動態(tài)平衡中，人體內(nèi)存在少量的氧自由基，不但對人體不構(gòu)成威脅，而且可以促進(jìn)細(xì)胞增殖，刺激白細(xì)胞和吞噬細(xì)胞殺滅細(xì)菌，消除炎癥，分解毒物。但如果

28、人體內(nèi)自由基的數(shù)量過多，就會對生物膜和其他組織造成損傷，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，干擾人體的正常代謝活動，引起疾病，加速人體衰老進(jìn)程。在長期的進(jìn)化過程中，生命有機(jī)體內(nèi)必然會產(chǎn)生一些物質(zhì)能清除這些自由基，將它們統(tǒng)稱為自由基清除劑（Scavenger）。自由基清除劑是指能清除自由基或能阻斷自由基參與的氧化反應(yīng)的物質(zhì)。自由基清除劑的種類繁多，可分為酶類清除劑和非酶類清除劑兩大類。酶類清除劑一般為抗氧化酶， 主要有超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）等幾種。非酶類自由基清除劑一般包括黃酮類、多糖類、維生素C 、維生素E、-胡蘿卜素和還原型谷胱甘肽（GSH）等活性肽類。自由基

29、清除劑大多為抗氧化劑，通過清除作用降低活潑自由基中間體濃度，降低自由基連鎖反應(yīng)中擴(kuò)展階段的效率來控制自由基的生成。但有些抗氧化劑是通過抑制自由基引發(fā)劑（如某些金屬元素）的產(chǎn)生而起作用的。自由基清除劑也不都是抗氧化劑，有些系統(tǒng)并未進(jìn)行氧化作用。自由基清除劑發(fā)揮作用必須滿足三個條件：第一，自由基清除劑要有一定的濃度；第二，因為自由基活潑性極強(qiáng)，一旦產(chǎn)生馬上就會與附近的生命大分子起作用，所以自由基清除劑必須在自由基附近，并且能以極快的速度搶先與自由基結(jié)合，否則就起不到應(yīng)有的效果；第三，在大多數(shù)情況下，清除劑與自由基反應(yīng)后會變成新的自由基，這個新的自由基的毒性應(yīng)小于原來自由基的毒性才有防御作用。這些自

30、由基清除劑對維持機(jī)體的正常生命活動，保持健康起著重要的作用。但是，隨著年齡的增長，機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生自由基清除劑的能力逐漸下降，從而減弱了對自由基損害的防御能力，使機(jī)體組織器官容易受損，加速了機(jī)體的衰老，引發(fā)一系列的疾病。為了防止此類現(xiàn)象的發(fā)生，可以人為地由膳食補(bǔ)充自由基清除劑，從而達(dá)到防御疾病、延緩衰老的目的。二、酶類自由基清除劑（一）超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）超氧化物歧化酶（SOD）是目前研究得最深入、應(yīng)用得最廣泛的一種酶類自由基清除劑。1種類、結(jié)構(gòu)及分布1968年，美國人McCord在 Fridovich指導(dǎo)下，從牛紅細(xì)胞中提取CuZn的酶蛋白質(zhì)，并發(fā)現(xiàn)它

31、能催化O2歧化，所以把這種酶蛋白命名為超氧化物歧化酶，英文簡稱為SOD。SOD存在于幾乎所有靠氧呼吸的生物體內(nèi)，包括細(xì)菌、真菌、高等植物、高等動物和人體中。SOD是一類含金屬的酶，按其所含金屬輔基不同可分為含銅鋅SOD（CuZn-SOD）、含錳SOD（Mn-SOD）和含鐵SOD（Fe-SOD）3種。含銅鋅金屬輔基的CuZn-SOD是最為常見的一種酶，主要存在于真核細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中或高等植物的葉綠體基質(zhì)、類囊體內(nèi)以及線粒體膜間隙中。在動物血液、牛肝、豬肝、牛心、豌豆、麥葉等動植物組織中均有存在，是目前應(yīng)用最廣泛的一類酶。該酶由兩條肽鏈組成，每條肽鏈含有銅、鋅原子各一個，活性中心的核心是銅。Fe-S

32、OD主要存在于原核細(xì)胞中，一些真核藻類甚至高等植物如銀杏、檸檬、番茄等組織內(nèi)也有存在。此酶也由兩條肽鏈組成，一般每個二聚體含有一個鐵原子。Mn-SOD主要存在于原核細(xì)胞和真核細(xì)胞的線粒體中，在植物的葉綠體基質(zhì)、類囊體內(nèi)也會存在，在人體肝臟中含量較高。此酶的純品呈粉紅色，由兩條或四條肽鏈組成。2理化及生物學(xué)特性SOD屬酸性蛋白酶，對pH、熱和蛋白酶水解等反應(yīng)比一般酶穩(wěn)定。又由于SOD屬于金屬酶，其性質(zhì)不僅取決于蛋白質(zhì)，還取決于結(jié)合到活性部位的金屬離子。三類SOD的活性中心都含有金屬離子。如采用物理或化學(xué)方法除去金屬離子，則酶活喪失；如重新加上金屬離子，則酶活又恢復(fù)。不同來源的CuZn-SOD具有

33、較高的同源性，它們的物化特性也很相似，據(jù)推測它們可能由同一原始酶進(jìn)化而來。不同來源的Mn-SOD和Fe-SOD也具有相似的物理性質(zhì)和較高的同源性，它們可能由另一原始酶進(jìn)化而成。SOD是生物體內(nèi)防御氧化損傷的一種十分重要的金屬酶，對氧自由基有強(qiáng)烈清除作用，特別對于超氧陰離子（O2）， SOD可將其催化歧化而生成H2O2和O2，故SOD又稱為清除超氧陰離子自由基的特異酶。3SOD的生理功能及應(yīng)用SOD作為功能性食品基料的生理功能主要有以下幾方面。（1）清除體內(nèi)產(chǎn)生的過量的超氧陰離子自由基，保護(hù)DNA、蛋白質(zhì)和細(xì)胞膜免遭O2的破壞作用， 減輕或延緩甚至治愈某些疾病，延緩因自由基損害生命大分子而引起的

34、衰老現(xiàn)象，如延緩皮膚衰老和老年斑的形成等；（2）提高人體對自由基外界誘發(fā)因子的抵抗力，增強(qiáng)機(jī)體對煙霧、輻射、有毒化學(xué)品及醫(yī)藥品的適應(yīng)性；（3）增強(qiáng)人體自身的免疫力，提高人體對自由基受損引發(fā)的一系列疾病的抵抗力，如炎癥、腫瘤、白內(nèi)障、肺氣腫等，治療由于免疫功能下降而引發(fā)的疾病；（4）清除放療所誘發(fā)的大量自由基，從而減少放射對人體其他正常組織的損傷，減輕癌癥等腫瘤患者放化療時的痛苦及副作用；（5）消除疲勞，增強(qiáng)對劇烈運動的適應(yīng)力。因此，具有清除自由基功能的SOD就成為醫(yī)學(xué)、食品和生命科學(xué)等領(lǐng)域研究的熱點。目前，SOD已廣泛地應(yīng)用于人們生活的各個方面。如深受女性消費者喜愛的化妝品中有大寶SOD、康妮

35、SOD 、SOD 康舒達(dá)霜劑等。SOD添加于化妝品有明顯的防曬效果和抗炎作用，可有效防止皮膚受電離輻射（如紫外線）的損傷。SOD在醫(yī)療上的應(yīng)用更是不勝枚舉，它尤其對治療關(guān)節(jié)炎和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎療效顯著。此外，SOD對治療癌癥、缺血后重灌流損傷、肺氣腫、白內(nèi)障、糖尿病、貧血等疾病均有療效。SOD在食品方面的應(yīng)用也極為廣泛，可作為功能性食品的功能因子或食品營養(yǎng)強(qiáng)化劑，有良好的抗衰老、抗炎、抗輻射、抗疲勞等保健強(qiáng)身的效果。國外把SOD作為食品添加劑應(yīng)用到口香糖和飲料中。國內(nèi)也開發(fā)出了多種強(qiáng)化SOD的食品，如SOD雪糕、SOD豆奶、SOD啤酒、SOD果汁飲料、SOD的酸奶和SOD口服液等。還可用富含SO

36、D的原料加工制成功能性食品，如大蒜飲料、刺梨SOD汁等。在人們越來越注重健康飲食的今天，SOD將成為功能食品中的活躍分子。然而，SOD作為一類高分子抗氧化酶，分子量在32000道爾頓以上，又都帶有金屬輔基，且其來源大多從動物血（豬血、牛血）和動物臟器以及某些微生物中制備而來，多為生物種屬差異很大的異源性蛋白。因此，在應(yīng)用上，它除了具有嚴(yán)格的針對性和有效性外，必然也有很大的局限性。SOD應(yīng)用的局限性歸納起來主要有8個方面：（1）半衰期短。SOD的體內(nèi)半衰期為68分鐘，體外半衰期（25時）為910天。因此，體內(nèi)注射表現(xiàn)為多次數(shù)、少濃度，體外涂抹則表現(xiàn)為高劑量、低效應(yīng)；（2）代謝速率快。SOD在體內(nèi)

37、代謝速率極快，注射6小時后，90%以上的大分子SOD經(jīng)降解為小分子而隨泌尿系統(tǒng)排泄；（3）酶分子量大，均在32000以上。其中，原核細(xì)胞Mn-SOD分子量為40000；真核細(xì)胞線粒體Mn-SOD都由9個相等亞基組成，其分子量為80000。因此，透皮或透膜吸收困難，體內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)作用弱；（4）酶制劑不宜口服，口服易被胃酸變性、胃蛋白酶和胰蛋白酶水解破壞，且SOD分子原形不易透過腸粘膜，因而難以發(fā)揮全身性藥效作用；（5）大分子異性蛋白，不宜大劑量、長時間使用，否則會不可避免地出現(xiàn)某些過敏性變態(tài)反應(yīng)，呈現(xiàn)明顯的不良反應(yīng)性變化；（6）對靶細(xì)胞或靶部位的親和力低，藥用趨向性不明顯。因此，對疾病的療效缺乏特

38、異性作用；（7）酶的穩(wěn)定性不高，對理化因素較為敏感，過高溫度、過大劑量輻射、過長時間超聲波、過強(qiáng)酸堿度、過多化學(xué)物質(zhì)及變性劑、還原劑等均易導(dǎo)致SOD分子結(jié)構(gòu)改變，酶活性喪失，形成不可逆性變化；（8）藥物作用單一性大、常規(guī)劑量單獨使用療效欠佳。 針對SOD應(yīng)用過程中客觀存在的局限性，國內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了大量卓有成效的研究工作，并已逐步探索或?qū)ふ页鼋鉀Q上述局限的一些有效方法和對策。4 SOD的制備SOD廣泛存在于動、植物和微生物體內(nèi)，但目前我國主要是從動物血液中提取。受到血源和得率的限制，影響了SOD的生產(chǎn)成本和推廣應(yīng)用。由于利用微生物（深紅酵母）生產(chǎn)SOD具有易培養(yǎng)、易大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)、不受季節(jié)與自

39、然條件限制等優(yōu)越性，因此，微生物SOD的生成具有更廣闊的發(fā)展前景。其工藝流程如下： 菌體培養(yǎng)破壁菌體破片 Rnase酶解、離心30分鐘 清液 上DE32柱 0.2mol/L NaCl洗脫 洗脫液 加45%（NH4）2SO4、離心 上清液 上DE32柱 洗脫 洗脫液 濃縮 冷凍干燥 SOD成品。破菌的方法可采用超聲波處理法、酶裂解法、細(xì)胞自溶法、氯仿-乙醇法和甲苯法等。根據(jù)有關(guān)的研究表明，用甲苯法破壁對提取酵母SOD具有一定的優(yōu)越性。另外，為了提高SOD純度，在洗脫時可采用梯度洗脫法。5SOD的純度檢查SOD產(chǎn)品一般為淺綠色凍干粉，其純度的檢查主要根據(jù)以下三個指標(biāo)。（1）均一性通常用聚丙烯酰胺凝

40、膠電泳檢查其均一性。也可用瓊脂糖凝膠電泳，其操作簡單，試劑單一且色帶的間隔比前者大，更易觀察與分析。還可進(jìn)行超離心分析來檢查其均一性。（2）酶的比活要求達(dá)到一定的標(biāo)準(zhǔn)。如：化妝品用SOD比活3000u/mg蛋白質(zhì)；口服用SOD比活3500u/mg蛋白質(zhì)；標(biāo)準(zhǔn)（活性測定用）及藥用SOD比活5000u/mg蛋白質(zhì)；試劑用SOD（電泳純）比活8000u/mg蛋白質(zhì)。（3）酶的重要理化性質(zhì)最重要的是金屬離子含量（常采用原子吸收分光光度法測定）、氨基酸含量和吸收光譜。如CuZn SOD中1分子的酶必須含有相當(dāng)于兩原子Cu和兩原子Zn；雖然不同來源的酶所含的氨基酸不完全一致，但仍然顯示一定的規(guī)律；三種SO

41、D都有特定的吸收光譜，觀察純酶的吸收光譜有助于判斷SOD的純度。6SOD的（活性測定）分析方法一般分為直接法和間接法兩大類。直接法往往需要操作復(fù)雜、價格昂貴的儀器，在一般試驗室無法使用。間接法需借助超氧自由基產(chǎn)生劑和超氧自由基清除指示劑兩種物質(zhì)。其中常用的產(chǎn)生劑包括最早使用的黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶、鄰苯三酚及近年發(fā)展起來的非酶體系的NADH-PMS、核黃素-TEMED、堿性二甲基亞砜、HXT-01050；清除指示劑則有最早發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞色素C、NBT，到近年來的魯米諾和MTT等。間接法中比色法最為常用，如黃嘌呤氧化酶-細(xì)胞色素C法和鄰苯三酚自氧化法。這兩種最為普及的方法多年來不斷得到改進(jìn)，其靈敏度也

42、不斷得到提高。另外，近年來新建立了多種方法，如化學(xué)發(fā)光法、光化學(xué)法、極譜氧電極法、免疫法等。其中化學(xué)發(fā)光法與極譜氧電極法由于方法簡便、靈敏度高，受到人們的青睞。（1）黃嘌呤氧化酶（XO）- 細(xì)胞色素C法國外多以該法測定SOD活性。在SOD被發(fā)現(xiàn)之初就是利用此法進(jìn)行測定的，又稱之為McCord法，被認(rèn)為是間接法中的經(jīng)典方法。酶活性單位定義為：在一定條件下，3ml反應(yīng)液中，每分鐘抑制氧化型細(xì)胞色素C還原率達(dá)50%的酶量定為一個活力單位。McCord法靈敏度較低，但采取以下措施可得到提高: 用乙?；?xì)胞色素C替代細(xì)胞色素C，可將靈敏度提高一倍，而且使測定結(jié)果不受樣品中細(xì)胞色素C氧化酶的影響；將pH7

43、.8，0.05mo1/L磷酸緩沖液換成pH10.2的碳酸緩沖液，并將黃嘌呤濃度從0.05 mmo1/L 增至0.10 mmo1/L ，靈敏度可提高10倍；預(yù)先將黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶溶液在25下保溫10分鐘，使O2產(chǎn)量達(dá)到穩(wěn)定程度，即O2產(chǎn)生率與其自動歧化率達(dá)到平衡，靈敏度增加可高達(dá)710倍；利用FP9平行分析儀可進(jìn)行半自動分析，快速、簡便，可以同時測定多個樣品。（2）鄰苯三酚自氧化法國外多使用經(jīng)典的鄰苯三酚自氧化法（簡稱Marklund法），Marklund法是采用420nm處光吸收測定。酶活力定義為：在一定條件下1ml的反應(yīng)液中，每分鐘控制鄰苯三酚在420nm波長的自氧化速率達(dá)50%的酶量定

44、為一個活力單位。該方法經(jīng)過不斷改進(jìn)，操作更為簡便、靈敏度更高。如將吸收波長由420nm改用325nm，測試靈敏度提高了6.4倍，稱為微量鄰苯三酚自氧化法，同時將鄰苯三酚耗量減少一半；Marklund法的另一缺陷是呈色反應(yīng)與光吸收值的測定必須同步進(jìn)行，因此樣品池必須保持恒溫，且不能同時處理多個樣品。通過使用二硫蘇糖醇（DTT）或L-抗壞血酸（VC ）作為終止劑，使反應(yīng)暫時停止，使A420在一定時間內(nèi)保持恒定，可同時測多個樣品，有較高的重復(fù)性和回收率。同時，終止劑既不參與，也不影響鄰苯三酚的呈色反應(yīng)，自氧化曲線與經(jīng)典法的相吻合，最大抑制百分比和靈敏度也基本一致。另外，為消除HCl對SOD的抑制作用

45、，改用K2HPO4- KH2PO4緩沖液替代Tris - HCl緩沖液，靈敏度可提高50%。（3）化學(xué)發(fā)光法化學(xué)發(fā)光法依據(jù)的原理是：O2可與化學(xué)發(fā)光劑魯米諾（luminol）反應(yīng)，產(chǎn)生激發(fā)態(tài)產(chǎn)物，當(dāng)其迅速返回基態(tài)時，即發(fā)出光。SOD可消除O2，從而使發(fā)光強(qiáng)度降低，SOD濃度與發(fā)光百分率在一定時間內(nèi)呈線性關(guān)系。活力單位定義為：在一定條件下，使每毫升反應(yīng)液于1分鐘末發(fā)光率被抑制50%的酶量作為一個酶活力。同傳統(tǒng)的比色法相比較，化學(xué)發(fā)光法專一性較強(qiáng)，其他干擾因素少，靈敏度高，最適用作粗提取液中SOD活性的檢測。（4）極譜氧電極法比色法測定的呈色反應(yīng)往往不穩(wěn)定，因此測定結(jié)果波動很大。極譜氧電極法利用了

46、系統(tǒng)產(chǎn)生O2過程中消耗O2，一定量的SOD又會使O2歧化產(chǎn)生O2，從而使耗氧量減少的特性，使用極譜氧電極儀精確測出耗氧量而推算出酶活。SOD活力單位定義為：25， pH8.4，使每分鐘產(chǎn)生1l O2的SOD量定為1個酶活力單位。該方法利用了O2張力的變化，與所用試樣的物理狀態(tài)如澄清度、是否膠體或懸濁液、有無顏色等無關(guān)，尤其適用于各種組織勻漿。而且由于直接測定O2量，方便、快速、微量化、靈敏度高、重復(fù)性好，且可自動連續(xù)記錄酶作用過程的變化。 除了以上幾種方法，其他方法如光化學(xué)法（正染法）等方法也都得到不斷的改進(jìn)；而靈敏度、特異性均高于一般化學(xué)法的免疫法在醫(yī)學(xué)上也得到應(yīng)用，并取得了很好效果。同時計

47、算機(jī)也開始用于SOD的活性分析，并有用于SOD酶活力線性分析的專用軟件，可適用于各種產(chǎn)O2系統(tǒng)、各種清除劑系統(tǒng)及不同的酶提取液的活力測定。（二）過氧化氫酶（catalase，CAT）過氧化氫酶是另一種酶類清除劑，又稱為觸酶，是以鐵卟啉為輔基的結(jié)合酶。它可促使H2O2分解為分子氧和水，清除體內(nèi)的過氧化氫，從而使細(xì)胞免于遭受H2O2的毒害，是生物防御體系的關(guān)鍵酶之一。CAT作用于過氧化氫的機(jī)理實質(zhì)上是H2O2的歧化，必須有兩個H2O2先后與CAT相遇且碰撞在活性中心上，才能發(fā)生反應(yīng)。H2O2濃度越高，分解速度越快。幾乎所有的生物機(jī)體都存在過氧化氫酶。其普遍存在于能呼吸的生物體內(nèi)，主要存在于植物的葉

48、綠體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、動物的肝和紅細(xì)胞中，其酶促活性為機(jī)體提供了抗氧化防御機(jī)理。CAT是紅血素酶，不同的來源有不同的結(jié)構(gòu)。在不同的組織中其活性水平高低不同。過氧化氫在肝臟中分解速度比在腦或心臟等器官快，就是因為肝中的CAT含量水平高。自1937年首次推出作為細(xì)胞內(nèi)結(jié)晶化酶之一的牛肝過氧化氫酶之后，已利用不同方法（選擇性沉淀法和層析法）從牛、馬或人的紅細(xì)胞、肝和腎中提純過氧化氫酶。從不同機(jī)體分離出的大多數(shù)過氧化氫酶的分子量為240kDa，并具有4個相同的亞單位，在其活性部位各含一血紅素基團(tuán)。來自哺乳動物以及某些真菌和細(xì)菌的過氧化氫酶還含有4個緊密結(jié)舍的NADPH分子，但其功能尚有爭議。常用的CA

49、T酶活性測定方法有以下幾類：（1）分光光度法 包括鉬酸銨比色法、紫外速率直接法和改良比色法等。其中改良比色法簡便，快速，顯色穩(wěn)定，重復(fù)性好，不需特殊試劑及儀器設(shè)備，適合一般實驗室采用，但生物樣品常會造成干擾；（2）化學(xué)發(fā)光法 魯米諾（luminol）在一定條件下與H2O2及Co2+等金屬離子共存時發(fā)出強(qiáng)烈的藍(lán)光，當(dāng)樣品中有CAT存在時，基質(zhì)的H2O2將被分解，由H2O2所引起的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度減弱，由此計算總CAT酶活性?；瘜W(xué)發(fā)光法易受試劑配制、操作技術(shù)和條件及測定時間等多種因素影響，但經(jīng)過方法改進(jìn)，可排除各種不良因素對測定的影響，是一種簡單靈敏、重復(fù)性好、特異性也較高的化學(xué)發(fā)光技術(shù)測定方法；（3

50、）極譜法 溶液中兩個電極間加以一定的電壓（極化電壓）后產(chǎn)生可測電流，極譜法是應(yīng)用氧電極，通過測量這種電解電流量以測定溶質(zhì)的方法。當(dāng)反應(yīng)體系中含有一定濃度的過氧化氫時，加入一定量的含有過氧化氫酶的樣品，過氧化氫就被分解而產(chǎn)生氧氣，記錄儀上可顯示出反應(yīng)室中氧量增加，增加的程度與加入液體中酶的活性成正比。該方法廣泛用于生化方面的研究工作；（4）滴定法 包括:過硼酸鹽底物法：在中性水溶液中，CAT催化過硼酸鹽還原成硼酸鹽，同時釋出氧。經(jīng)過一定時間后，加入硫酸使酶失活，以中止反應(yīng)，用高錳酸鉀溶液滴定殘存的過硼酸鹽，結(jié)果反映CAT活性；過氧化氫滴定法；一定量的細(xì)菌同一定量的H2O2發(fā)生反應(yīng)，經(jīng)過一定時間后

51、加酸中止反應(yīng)，然后用高錳酸鉀滴定剩余的H2O2量，從而測定細(xì)菌過氧化氫酶的活性。（5）檢壓測定法 在一定pH的緩沖液中，過氧化氫酶作用于過氧化氫釋出氧氣。此反應(yīng)非常迅速、劇烈，在不斷攪拌、震蕩及減壓的條件下，所產(chǎn)生的氧氣得以迅速逸出溶液，在一定容量的容器內(nèi)產(chǎn)生壓力變化，壓力變化數(shù)值可換算成產(chǎn)氧量，用來表示樣品過氧化氫酶的活性。（三）谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）是在哺乳動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的第一個含硒酶，它于1957年被Mills首先發(fā)現(xiàn)，但直到1973年才由Flohe和Rotruck兩個研究小組確立了GPX與硒之間的聯(lián)系。研究表明，硒是谷胱甘肽過氧化酶（Se-GPX）的活性

52、成分，是GPX催化反應(yīng)的必要組分，它以硒代半胱氨酸（Sec）的形式發(fā)揮作用，攝入硒不足時使Se-GPX酶活力下降。在體內(nèi)處于低硒水平時，活力與硒的攝入量呈正相關(guān)，但到一定水平時，酶活力不再隨硒水平上升而上升。Se-GPX存在于胞漿和線粒體基質(zhì)中，它以谷胱甘肽（GSH）為還原劑分解體內(nèi)的氫過氧化物，能使有毒的過氧化物還原成無毒的羥基化合物，并使過氧化氫分解成醇和水，因而可防止細(xì)胞膜和其它生物組織免受過氧化損傷。它同體內(nèi)的超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）一起構(gòu)成了抗氧化防御體系，因而在機(jī)體抗氧化中發(fā)揮著重要作用。機(jī)體在正常條件下，大部分活性氧被機(jī)體防御系統(tǒng)所清除，但當(dāng)機(jī)體產(chǎn)生某些病變

53、時，超量的活性氧就會對細(xì)胞膜產(chǎn)生破壞。機(jī)體消除活性氧O2的第一道防線是超氧化物歧化酶（SOD），它將O2轉(zhuǎn)化為過氧化氫和水，而第二道防線是過氧化氫酶（CAT）和GPX。CAT可清除H2O2，而GPX分布在細(xì)胞的胞液和線粒體中，消除H2O2和氫過氧化物。因此，GPX、SOD和CAT協(xié)同作用，共同消除機(jī)體活性氧，減輕和阻止脂質(zhì)過氧化作用。GPX廣泛存在于哺乳動物的組織中，不同種類的GPX其分子量和比活性也有所不同。谷胱甘肽是此酶的特異性專一底物，而氫過氧化物則是非專一性底物。GPX的活力測定常采用5，5-二硫代對二硝基苯甲酸（DTNB）法，用單位時間內(nèi)催化GSH氧化的減少量表示。GSH可和二硫代對

54、二硝基苯甲酸（DTNB）反應(yīng)生成黃色的5-硫-2,2-硝基苯甲酸陰離子，在412nm處有最大光吸收，測定該離子的濃度，即可計算出GSH減少的量。由于上述反應(yīng)在非酶條件下仍能進(jìn)行，故計算酶活力時，必須扣除非酶反應(yīng)所引起的GSH減少量。 三、非酶類自由基清除劑（一）維生素類 維生素不僅是人類維持生命和健康所必需的重要營養(yǎng)素，還是重要的自由基清除劑。對氧自由基具有清除作用的維生素主要有維生素、維生素及維生素的前體-胡蘿卜素。維生素又稱為生育酚，是強(qiáng)有效的自由基清除劑。它經(jīng)過一個自由基的中間體氧化生成生育醌，從而將ROO轉(zhuǎn)化為化學(xué)性質(zhì)不活潑的ROOH，中斷了脂類過氧化的連鎖反應(yīng)，有效地抑制了脂類的過氧

55、化作用。維生素可清除自由基，防止油脂氧化和阻斷亞硝胺的生成，故在提高免疫能力，預(yù)防癌癥等方面有重要作用，同時在預(yù)防和治療缺血再灌注損傷等疾病有一定功效。維生素又稱為抗壞血酸，在自然界中存在還原型抗壞血酸和氧化型脫氫抗壞血酸兩種形式。抗壞血酸通過逐級供給電子而轉(zhuǎn)變成半脫氫抗壞血酸和脫氫抗壞血酸，在轉(zhuǎn)化的過程中達(dá)到清除O2-、OH、ROO等自由基的作用。維生素具有強(qiáng)抗氧活性，能增強(qiáng)免疫功能、阻斷亞硝胺生成、增強(qiáng)肝臟中細(xì)胞色素酶體系的解毒功能。人體血液中的維生素含量水平與肺炎、心肌梗塞等疾病密切相關(guān)。-胡蘿卜素廣泛存在于水果和蔬菜中，經(jīng)機(jī)體代謝可轉(zhuǎn)化為維生素。-胡蘿卜素具有較強(qiáng)的抗氧化作用，能通過提

56、供電子，抑制活性氧的生成，從而達(dá)到防止自由基產(chǎn)生的目的。許多試驗表明，-胡蘿卜素能增強(qiáng)人體的免疫功能，防止吞噬細(xì)胞發(fā)生自動氧化，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞、細(xì)胞毒性細(xì)胞、天然殺傷細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺滅能力。在多種食品中，-胡蘿卜素與不飽和脂肪酸的穩(wěn)定性密切相關(guān)。有實驗證明老年人攝入維生素C以及維生素E可以增進(jìn)多項免疫功能，維生素C-E聯(lián)合物還可清除血液中的自由基等有害物質(zhì)和循環(huán)應(yīng)激激素。除此之外，維生素C、維生素E以及 胡蘿卜素等抗氧化性維生素可以延緩老齡化進(jìn)程，還可以預(yù)防和治療許多老年疾病，如動脈粥樣硬化、高血壓、心臟病和腦卒中等，這些疾病都與低密度脂蛋白膽固醇的氧化有關(guān)。維生素C還能有效保護(hù)維生素E和-胡

57、蘿卜素不被過早消耗。每天攝入500毫克維生素C可以幫助高血壓患者降低血壓。攝入維生素E不但可增強(qiáng)老年人的記憶力、預(yù)防老年癡呆癥及治療受自由基所累的遲緩型運動障礙，還可預(yù)防前列腺癌的發(fā)病、抑制消化道腫瘤（尤其是腸癌），并降低其死亡率。短期、大劑量地腸內(nèi)補(bǔ)充維生素E 還可調(diào)整單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞對內(nèi)毒素的反應(yīng)，提高維生素E對于敗血癥、缺血再灌注損傷均能起到保護(hù)性的治療作用。健康人可以通過日常均衡的膳食攝取充足的維生素，但在機(jī)體受到感染、體力活動增加、服用特殊藥物、體液大量丟失及婦女懷孕和哺乳等情況下，機(jī)體對維生素的需求大大增加，不額外補(bǔ)充，則易導(dǎo)致維生素缺乏，自由基損傷機(jī)體，誘發(fā)或加速其他疾病。（二）黃酮類化合物黃酮類化合物泛指兩個苯環(huán)通過中央三碳鏈相互聯(lián)結(jié)而成的一系列C6-C3-C6化合物，主要是指以2-苯基色原酮為母核的一類化合物，在植物界廣泛分布。黃酮是具有酚羥基的一類還原性化合物。在復(fù)雜反應(yīng)體系中，由于其自身被氧化而具有清除自由基和抗氧化作用。其作用機(jī)理是與2-反應(yīng)阻止自由基的引發(fā)，與金屬離子螯合阻止OH的生成，與脂質(zhì)過氧化基ROO反應(yīng)阻斷脂質(zhì)過氧化。黃酮及其某些衍生物具有廣泛的藥理學(xué)特性，包括抗炎、抗誘變、抗腫瘤形成與生長等活性。黃酮在生物體外和體內(nèi)都具有較強(qiáng)的抗氧化性，具有許多藥理作用，對人的毒副作用很小，是理想的自由基清除劑。目前已發(fā)現(xiàn)有4000多種黃酮類化合物，可分