發(fā)酵工程(李艷)第十六章講稿講解

1、第十六章 固定化酶與固定化細胞技術第一節(jié) 概述 溶性酶的缺點：1 大部分酶是蛋白質，穩(wěn)定性差(熱、酸堿、有機溶劑對其有影響)2 不能回收，無法自動化、連續(xù)化生產 3 專一性高1953 年， Grubhofev 和 Schleith 首先開始了酶固定化研究，并第一次實現了酶的固定化。1960 年，日本的千畑一郎開始了氨基?；腹潭ɑ芯?， 開始了將固定酶應用在工業(yè)上的 第一步。1969 年，千畑一郎成功地將氨基酰化酶反應用于 DL-AA 的光學分析，實現了酶連續(xù)反應 的工業(yè)化。這是世界上固定化酶用于工業(yè)的開端。1973 年，千畑一郎再次在工業(yè)上成功地固定化大腸桿菌細胞，成功實現了L- 天冬氨酸連

2、續(xù)生產。什么是固定化酶？ 固定化酶的優(yōu)點：(1) 極易將固定化酶與底物、產物分開；產物溶液中沒有酶的殘留，簡 化了提純工藝。(2) 可在較長時間內反復使用，有利于工藝的連續(xù)化、管道化。(3) 酶反應過程可以嚴格控制，有利于工藝自動化和微電腦化。(4) 在絕大多數情況下提高了酶的穩(wěn)定性。(5) 酶使用效率提高，產物得率提高，產品質量有保障，成本低。 固定化酶的缺點：(1) 酶固定化時酶的活力有所損失。同時也增加了固定化的成本，使工廠開始投資大。(2) 比較適應水溶性底物和小分子底物。(3) 與完整細胞比較， 不適于多酶反應， 特別是需要輔因子的反應， 同時對胞內酶需經分離 后才能固定化。第二節(jié)

3、固定化酶的制備一 、一般方法及特點 關鍵在于選擇適當固定化方法和必要的載體及穩(wěn)定性研究、改進。1、四大類方法：吸附法；包埋法；結合法；交聯法2、選擇方法依據： ( 1)酶的性質( 2)載體的性質( 3)制備方 法的選擇 在具體選擇時，一般應遵循以下幾個原則。( 1)必須注意維持酶的構象，特別是活性中心的構象。 (2)酶與載體必須有一定的結合程度。( 3 )固定化應有利于自動化、機械化操作。(4) 固定化酶應有最小的空間位阻。(5 )固定化酶應有最大的穩(wěn)定性。(6 )固定化酶的成本適中。3、固定化后酶的考察項目：(1) 測定固定化酶的活力，以確定固定化過程的活力回收率(2) 考察固定化酶穩(wěn)定性(

4、3) 考察固定化酶最適反應條件二、酶的固定化方法(一) 吸附法吸附法(adsorption)是通過載體表面和酶分子表面間的次級鍵相互作用而達到固定目的的方法。 酶與載體之間的親和力是范德華力、疏水相互作用、離子鍵和氫鍵等。吸附法又可分為物理吸附法和離子吸附法。(1) 物理吸附法物理吸附法(physical adsorption)是通過物理方法將酶直接吸附在水 不溶性載體表面上而使酶固定化的方法。是制備固定化酶最早采用的方 法，如a淀粉酶、糖化酶、葡萄糖氧化酶等都曾采用過此法進行固定化。 常用載體：無機載體：氧化鋁、活性碳、皂土、硅藻土、金屬氧化物、硅膠。一般吸附量1mg蛋白/克吸附劑有機載體：

5、淀粉、白蛋白等。一般吸附量幾十毫克蛋白/克吸附劑研究熱點：大孔型合成樹脂、陶瓷物理吸附法制備固定化酶，操作簡單、價廉、條件溫和，載體可反復使用，酶與載體結合 后，活性部位及空間構象變化不大，故所制得的固定化酶活力較高?？课锢砦阶饔?，酶和載體結合不牢固，在使用過程中容易脫落，所以使用受到限制。常 與交聯法結合使用。(2) 離子吸附法離子吸附法(ion adsorption)是將酶與含有離子交換基團的水不溶性 載體以靜電作用力相結合的固定化方法，即通過離子鍵使酶與載體相結 合的固定化方法。此法固定的酶有葡萄糖異構酶、糖化酶、3淀粉酶、纖維素酶等，在工業(yè)上用途較廣。DEAE-Sephadex固定化

6、氨基?；福簩EAE-SephadexA25充分溶脹，用 0.5mol/LNa0H 和水洗滌加入pH7.0-7.5的米曲霉3042粗酶液(水解乙酰-DL-Ala活力為25umol/ml )充分混合，于低溫下攪拌過夜后，吸去上清液（1g濕重載體加60ml酶液）固定化酶活力回收 50-60 % 用蒸餾水和0.15mol/L醋酸鈉水溶液洗滌固定化酶，置4C備用。水解乙酰-DL-Ala活力為600-800umol/g h濕固定化酶。離子吸附法所使用的載體是某些離子交換劑。陰離子交換劑有DEAE-纖維素、四乙氨基乙基（TEAE）-纖維素、DEAE-葡聚糖凝膠等； 陽離子交換劑有羧甲基纖維素、纖維素檸檬

7、酸鹽等。其吸附容量一般大于物理吸附劑。離子吸附法具有操作簡便、條件溫和、酶活力不易喪失等優(yōu)點。此外，吸附過程同時可以純 化酶。吸附力弱，不適宜的pH，高鹽濃度，高底物濃度，高溫等都能把吸附的酶解吸下來。 提高吸附容量和吸附力的途徑：1 選擇最佳條件操作（如溫度、 pH ）。2 選吸附量大的載體，控制酶和載體量。3 采用高酶量吸附。4 開發(fā)新載體。5 對酶進行修飾后再進行交換吸附。如烴基-瓊脂糖衍生物吸附酸性 pH的酶（脲酶），用親和吸附劑 ConA-葡聚糖能專一吸附糖 蛋白。對酶進行修飾以后再與載體結合，胰蛋白酶+丙烯酸與順丁烯二酸酐的水溶性共聚體共價偶聯再加DEAE-纖維素結合。結果：結合力

8、增大（吸附量也大），也相當穩(wěn)定，使用壽命長，有時可以連續(xù)使用 3個星期。 多孔物質包絡法：利用棉布、尼龍布、金屬死網、海綿、塑料等固定化放線菌、真菌組成盤狀生物 反應器，進行連續(xù)生產有機酸、糖化酶、四環(huán)素。這些材料有足夠大，但空隙又不 十分大的空隙，能夠使細胞進入空隙，通常為細胞直徑的見倍大。超過濾法：利用超過濾膜將細胞固定化。底物和產物可以自由進出超過濾膜，而膜內的細胞 卻出不來。制備成膜反應器和生物傳感器。但是需要防止細胞生長導致濃度過高而 使超過濾膜破裂。吸附方法：1、靜態(tài)吸附，自然吸附、 解吸、再吸附的固定化方法。 效率低，時間比較長，而且不完全。2、電沉積，在載體附近加電極，酶移向載

9、體表面的固定化方法。需要酶在電場中不破壞， 保持原來酶性能。3、 動力法固定化，酶與載體混合后攪拌等條件下進行固定化，注意速度，不破壞酶和載體。4、反應器固定化，載體裝入反應器，再循環(huán)加入酶溶液達到固定化。但是吸附少，不適合 的條件（pH、鹽等）容易解吸。注意操作條件。最主要，更加有效的還是開發(fā)新的吸附劑。影響酶蛋白在載體上吸附程度的因素：1. pH :影響載體和酶的電荷變化，從而影響酶吸附。2. 離子強度：多方面的影響，一般認為鹽阻止吸附。3. 蛋白質濃度：若吸附劑的量固定，隨蛋白質濃度增加，吸附量也增加，直至飽和。4. 溫度：蛋白質往往是隨溫度上升而減少吸附。5. 吸附速度：蛋白質在固體載

10、體上吸附速度比小分子慢得多。6. 載體：對于非多孔性載體，顆粒越小吸附力越強。多孔性載體，要考慮吸附對象的大 小和總吸附面積的大小。吸附法的優(yōu)點：操作簡單，可供選擇的載體類型多，吸附過程可同時達到純化和固化的目的，所得到的固 定化酶使用失活后可以重新活化和再生。吸附法的缺點：酶和載體的結合力不強，易脫落，會導致催化活力的喪失和沾污反應產物。（二）包埋法（entrapping method）將聚合物單體和酶溶液混合后，再用聚合促進劑（包括交聯劑）的作用而聚合，酶就包埋在載體中達到固定化。酶本身不參與反應，所以較安全。但在聚合過程中有自由基產生及聚合時放出熱，酶與試 劑間可能發(fā)生化學反應，這些因素

11、可能會使酶失效，或者降低酶活性。操作時注意條件的控制。（1）凝膠包埋法凝膠包埋法常用的載體有海藻酸鈉凝膠、角叉菜膠、明膠、瓊脂凝膠、卡拉膠等天然凝膠以及聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光交聯樹脂等合成凝膠或樹脂。聚丙烯酰胺包埋是最常用的包埋法：先把丙烯酰胺單體、交聯劑和懸浮在緩沖溶液中的酶混合，然后加入聚合催化系統(tǒng)使之開 始聚合，結果就在酶分子周圍形成交聯的高聚物網絡。它的機械強度高，并可以改進酶脫落的 情況，在包埋的同時使酶共價偶聯到高聚物上，可以減少酶的脫落。聚丙烯酰胺包埋法的缺點是酶容易漏失，以低分子量蛋白質為甚，如果調整交聯劑濃度與 交聯程度可以得到克服。聚丙烯酰胺凝膠包埋法：1ml溶于適當緩沖

12、液的酶溶液加750mg丙烯酰胺（單體）和40mgN，N-甲叉雙丙烯酰胺（交聯劑）的3ml溶液加0.5ml 15 %的二甲氨基丙腈（加速劑），加入1 %過硫酸鉀（引發(fā)劑）混合，于25 C保溫10min ,含酶凝膠將凝膠粉碎，制得不規(guī)則的顆粒于低溫儲存或冷凍干燥為制得珠狀固定化酶，可以在聚合反應開始時，立即轉入到疏水相（一種乳化劑，與水相有相同密度）的有機溶液中，使分散成含酶的珠狀凝膠?？ɡz包埋法卡拉膠是由角叉菜（鹿角菜）中提取的一種多糖，可以用來包埋酶。具體方法：將100g酶在37-50 C溶于水中，又將1.7g卡拉膠在40-60 C溶于34ml生理鹽水 中，二者混合后冷卻到10C，所成凝膠浸

13、在 0.3mol/L KCl溶液中硬化，作成適當大小的顆粒，即為固定化酶。（2）微膠囊包埋法微膠囊包埋即將酶包埋在各種高聚物制成的半透膜微膠囊內的方法。它使酶存在于類似細 胞內的環(huán)境中，可以防止酶的脫落，防止微囊外的環(huán)境直接接觸，從而增加了酶的穩(wěn)定性。常 用于制造微膠囊的材料有聚酰胺、火棉膠、醋酸纖維素等。用微膠囊包埋法制得的微囊型固定化酶的直徑通常為幾微米到數百微米，膠囊孔徑為幾埃至數百埃，適合于小分子為底物和產物的酶的固定化。如脲酶、天冬酰胺酶（治療白血?。?、尿酸酶、過氧化氫酶等。方法有界面聚合法、界面沉淀法等。微囊制備方法：界面沉淀法是一種簡單的物理微囊化法，它是利用某些高聚物在水相和有

14、機相的界面上溶 解度較低而形成的皮膜將酶包埋。如含有高濃度血紅蛋白的酶溶液在與水不互溶、沸點比水低的有機相中乳化，加入油溶性 表面活性劑，形成油包水的微滴，再將溶于有機溶劑的高聚物在攪拌下加入乳化液中，然后加 入一種不溶解高聚物的有機溶劑，使高聚物在油-水界面上沉淀形成膜，最后移于水相，從而制成固定化酶。作為高聚物有硝酸纖維素、聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸甲酯等。含酶的10%血紅蛋白水溶液與己甲叉二胺的水溶液混合立即在1 %Span85的氯仿-環(huán)已烷中分散乳化加入癸二酰氯（有機相;后，便在油-水界面發(fā)生聚合反應 棄除上清液，加入 Tween-20去乳化洗除有機溶劑，除去未聚合單體后轉入水相制得固定化

15、酶界面聚合法是將疏水性和親水性單體在界面進行聚合，形成半透膜，使酶包埋于半透膜微 囊中。此法曾用來制備 Asn酶、脲酶等。制備方法一般是：將酶水溶液與親水單體（如乙二醇）用一種水不溶混的有機溶劑制成乳化液，再將溶于同一有機溶劑疏水單體 （如多異氰酸）溶液在攪拌下加入到上述乳化液，便在乳化液中的水相和有機溶劑之間的界面發(fā)生聚合化，這樣水相中酶便包埋在聚合體（聚脲）膜內。尼龍膜界面聚合包埋（酶+己二胺水溶液）+庚二酰氯有機溶劑孚L化，二種單體（己二胺和庚二酰氯）在水相、有機相交界處聚合形成包埋酶的尼龍膜珠粒Tween 20破乳化，得到微囊包埋酶（三）共價鍵結合法通過載體的功能基團與酶側鏈基團上非必

16、需基團共價結合，制備成的固體酶的方法。優(yōu)點：應用最廣，固定化結合牢、穩(wěn)定而酶不丟失，可以連續(xù)使用。 共價鍵結合法可以形成共價鍵的基團：游離氨基， 游離羧基， 巰基， 咪唑基，酚基，羥基，甲硫基，吲哚基，二硫鍵常用載體：天然高分子、人工合成的高聚物、無機載體1、載體要求：親水載體優(yōu)于疏水載體（酶蛋白結合量，固定化后酶活性，穩(wěn)定性方面都比較好），而且 親水基存在可以減少疏水基的有害影響。載體特點：1結構疏松2表面積大3機械強度大4帶有在溫和條件下可與酶側鏈基團共價偶聯的功能基團5沒有或很少有非專一性吸附6載體來源容易，并能反復使用。一般與親和層析所需載體的要求、標準一致如：天然纖維素或衍生物；葡聚

17、糖凝膠；瓊脂糖親和性好，機械性能差合成的：聚丙烯酰胺；多聚氨基酸；聚苯乙烯，尼龍機械性能好，但有疏水結構2、偶聯方法：偶聯成功與否取決于：載體：功能基團，芳香氨基，羧基，羧甲基等酶分子：側鏈非必需基團（游離的a-氨基，lys-各NH2 , Arg-胍基，C-COOH , Asp- y羧基，Glu-羧基，酚羧基，巰基， 咪唑基 ）載體、酶分子上的基團不會直接反應，其功能基團要活化。 在實際中偶聯最普遍的基團是：氨基、羧基以及苯環(huán)。被偶聯的基團還應是酶活性的非必 需基團，否則將導致酶失去活性。3、載體活化的方法 重氮法；異硫氰酸反應；溴化氰-亞氨碳酸基反應；芳香烴化反應；疊氮法；酰氯?；磻凰狒?/p>

18、反應；縮合反應；巰基-二硫基交換反應；金屬偶聯反應重氮法 重氮法是將酶蛋白與水不溶性載體的重氮基團通過共價鍵相連接而固定化的方 法，是共價鍵法中使用最多的一種。常用的載體有多糖類的芳香族氨基衍生物、氨基酸的共聚體和聚丙烯酰胺衍生物等。 芳香氨基載體方法特點： 載體先用亞硝酸處理成重氮鹽衍生物，再在溫和條件下和酶分子上相應基團直 接偶聯。芳香族重氮化具疏水性，傾向于進入蛋白質分子中Tyr等集中的疏水區(qū)并偶聯化而導致失效。a 當載體為電中性或疏水性時，這種傾向性越大。b 當載體用親水極性物質時，這種疏水區(qū)的特性就大大減小了。 如胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶固定化，偶聯到重氮化的電中性載體如對氨基芐基纖維

19、素時， 產生固定化酶無活性。偶聯到重氮化的苯胺-多孔玻璃時，得到固化酶都具很高酶活性。異硫氰酸反應 含芳香氨基的載體先用硫芥子（或者光氣）處理成異硫氰酸鹽的衍生物，這種產物在溫和條件下，優(yōu)先與酶分子的氨基反應，在中性pH下優(yōu)先與a-氨基反應，可達到選擇性偶聯的目的。溴化氰 -亞氨碳酸基反應帶羥基的載體纖維素、葡聚糖、瓊脂糖等是最常用的載體。在堿性條件下，載體的OH基和溴化氰反應，生成活潑的亞氨碳酸基，在弱堿中直接和酶的氨基進行共價偶聯。芳香烴化反應含羥基的載體在堿性條件下，和三氯三嗪等反應， 引入鹵素基后直接與酶的氨基、 酚羥基 或者巰基等偶聯。疊氮法-順載體活化生成疊氮化合物，再與酶分子上的

20、相應基團偶聯成固定化酶。含有羥基、羧基、 羧甲基等基團的載體都可用此法活化。如CM-sephadex （交聯葡聚糖）、聚天冬氨酸、乙烯丁烯二酸酐共聚物等都可用此法來固定化酶，其中使用最多的是羧甲基纖維素疊氮法。 酰氯?；磻然d體（如羧酸樹脂）通過氯化亞砜處理成活潑的酰氯衍生物，再與酶偶聯。 酸酐反應乙烯等和順丁烯二酸酐的共聚物，通過其活潑酸酐基直接與酶氨基偶聯。生成 的固定化酶一般有比較高的活力?？s合反應 利用羰二亞胺的活化作用，使氨基、羧基直接偶聯，縮合為肽鍵的反應。載體成 為活潑的?；愲已苌?。帶羧基載體與環(huán)二已基二亞胺（ DCCI ）存在時，用 N- 羥基琥珀酰亞胺活化，在 溫和

21、條件下和酶的氨基反應，縮合反應控制pH6,反應限于氨基。巰基 -二硫基交換反應巰基或二硫基載體通過巰基 -二硫基交換反應和酶分子上的非必需巰基偶聯， 當功能基團為巰基，先用 2， 2-吡啶二硫化物處理，變成二硫基，生成的中間產物在 酸性條件下與酶的巰基發(fā)生交換達到偶聯。化合物在酸性條件下發(fā)生交換。在大量 巰基化合物存在條件下逆轉為載體和巰基酶。金屬偶聯反應一些過渡態(tài)金屬能使纖維素、尼龍、濾紙、酵母細胞等直接轉化成固定化的載體。 方法：將上面這些材料浸入金屬溶液中，過濾、洗滌后加酶而成。常用金屬有鈦、 錫、鋅、鐵等氯化物，其機制目前還不清楚。偶聯反應中的保護措施：1、采用適宜的固定化材料和方法。

22、如重氮化注意載體的親水性和疏水性。2、 嚴格控制反應條件，提高反應專一性。如與a氨基反應，保護其他氨基。3、用抑制劑或者底物保護酶活性中心和必需基團避免影響酶的活性構型和相應基團。 酶的偶聯量 :單位載體上偶聯酶的總量與 “相對酶活力 ”之間的平衡。 相對酶活力：指固定化酶和相等蛋白量的原酶的活力比。 由于固定化時，受到載體、方法、條件、酶反應系統(tǒng)的影響，即使以上因素一定，還會受 到酶偶聯量的影響。1、只有達到一定的偶聯量，酶活性達到最高。2、超過一定的偶聯量，酶過多集中于載體的局部，造成空間位阻效應，部分酶無法表現活 性。隨酶偶聯量上升酶活性反而下降。尋找二者平衡點關系，才能使酶活性達到最高

23、。共價偶聯法中的幾個影響因素（ 1） 載體的物化性質要求載體親水，并且有一定的機械強度和穩(wěn)定性，同時具 備在溫和條件下與酶結合的功能基團。（2）偶聯反應的反應條件必須在溫和 pH 、中等離子強度和低溫的緩沖溶液中。（3）所選擇的偶聯反應要盡量考慮到對酶的其它功能基團副反應盡可能少。（4）要考慮到酶固定化后的構型，盡量減少載體的空間位阻對酶活力的影響。 共價偶聯法的優(yōu)點、缺點（1）共價偶聯法的優(yōu)點：得到的固定化酶結合牢固、穩(wěn)定性好、利于連續(xù)使用。（2）共價偶聯法的缺點：載體活化的操作復雜，反應條件激烈，需要嚴格控制 條件才可以獲得較高活力的固定化酶。同時共價結合會影響到酶的空間構象，從而對酶的催

24、化 活性產生影響。（四）交聯法交聯法（ cross-linking ）是使用雙功能或多功能試劑使酶分子之間相互交聯呈網狀結構的固 定化方法。由于酶蛋白的功能團，如氨基、酚基、巰基和咪唑基參與此反應，所以酶的活性中心構造 可能受到影響，而使酶失活明顯。交聯法是利用雙功能或多功能試劑在酶分子間、酶分子與惰性蛋 白間或酶分子與載體間進行交聯反應，把酶蛋白分子彼此交叉連接起來，形成網絡結構的固定 化酶。能起交聯作用的試劑很多，但目前常用的交聯試劑是戊二醛和雙 耦聯苯胺 -2,2 -二磺酸。交聯法常與吸附法結合使用，或者與包埋法配合，目的是使酶緊緊地結 合于載體上。戊二醛屬于同型，還有異型：甲苯 -2-

25、異氰 -4-異硫氰；交聯可以在分子內，也可 以在酶分子之間。這是與酶量有關的一個問題。酶濃度低時，交聯發(fā)生在分子內，酶濃度高時， 交聯發(fā)生在分子間，固定化后，酶與載體成為不溶態(tài)的顆粒。缺點： 固定化后，往往顆粒小，機械性能差。酶直接交聯法在酶液中加入適量多功能試劑，使其形成不溶性衍生物。固定化依賴酶與試劑 的濃度、溶液 pH 和離子強度、溫度和反應時間之間的平衡。 酶輔助蛋白交聯當可得到的酶量有限，可以使用第二個 “載體 ”蛋白來增加蛋白質濃度，從而使酶與惰性蛋 白共交聯的方法。這種“載體 ”蛋白即輔助蛋白，可以是白蛋白、明膠、血紅蛋白等。吸附交聯法先將酶吸附在硅膠、皂土、氧化鋁、球狀酚醛樹脂

26、或其他大孔型離子交換樹脂上，再用戊二醛等雙功能試劑交聯。用此法所得固定化酶也可稱為殼狀固定化酶。交聯包埋法把酶液和雙功能試劑(戊二醛)凝結成顆粒很細的集合體，然后用高分子或多糖一類物質 進行包埋成顆粒。這樣避免顆粒太細的缺點，同時制得的固定化酶穩(wěn)定性好。實驗方法上的要點：1) 交聯條件激烈，需要保護性措施。2) 交聯劑的鏈長和功能基團的選擇問題。只要選擇適當，有利于建立某些分子內交聯，亞基固定和四級結構維持，增加酶的穩(wěn)定性。 但鏈過長，疏水性上升，疏水性升高，對固定化酶有害。各類固定化方法的特點比較：比較項目結合法吸附法交聯法包埋法共價鍵結合物理吸附離子吸附制備難易難易易較難較難固定化程度強弱

27、中等強強活力回收率低較咼高中等高載體再生不可能可能可能不可能不可能費用高低低中等低底物專一性可變不變不變可變不變適用性較廣酶源多廣泛較廣小分子底物、藥用酶第三節(jié)固定化酶的性質及其影響因素一、影響固定化酶性質的因素1、酶本身的變化，主要是由于活性中心的氨基酸殘基、高級結構和電荷狀態(tài)等發(fā)生了變化。2、載體的影響3、固定化方法的影響固定化對酶活性和酶反應體系的影響是十分復雜的，常因酶的種類、反應系統(tǒng)的組成，特 別是固定的方法及載體而顯著不同。為了簡化，通常作兩個假設：(1) 酶在載體表面或多孔介質內的分布是完全均勻的。(2) 整個系統(tǒng)各方同性。在上述條件下，固定化對反應體系的影響，可以概括為三種類型

28、。構象改變和屏蔽效應構象改變是指：酶在固定化的過程中，出于酶與載體相互作用使酶的活性中心或變構中心 的構象發(fā)生變化從而導致酶活性下降。這種效應難以定量描寫也難以預測。通常出現在吸附法 和共價鍵結合法。立體屏蔽效應是：由于載體對酶的活性中心或變構中心造成空間障礙，因而底物或效應物 與酶無法接觸，從而影酶的活性。若在酶和載體間加入臂，可以得到改善。微環(huán)境的影響微環(huán)境是緊鄰固定化酶的環(huán)境區(qū)域。微環(huán)境的影響是由于載體的親水與疏水性質和介質的 介電常數等直接影響酶的催化效應，或者是酶對效應物作出反應的能力的一種效應，通?？梢?通過改變載體和介質的性質作出判斷和調節(jié)。分配效應與擴散效應分配效應是由于載體的

29、親水和疏水性質使酶的底物、產物或其他效應物在微觀環(huán)境和宏觀 體系間發(fā)生不等分配，改變了酶反應系統(tǒng)的組成平衡，從而影響了反應速度。 作為一般規(guī)律是：(1) 如果載體與底物帶有相同電荷，則酶的Km 值將因固定化而增大；如果帶有相反電荷則相反。(2) 當載體帶正電荷時，固定化之后，酶活性-pH 曲線向酸性方向偏移；相反，陰離子載體將導致該曲線向堿性方向偏移。(3) 以上效應可通過提高介質離子強度而削弱或消除。(4) 采用疏水載體時，如底物為極性物質，或電荷物質，則酶的Km 值將因固定化而降低，其他效應物亦然。擴散限制效應是指： 底物或其他效應物的遷移和運轉受到限制的一種效應。 它分內擴散效 應和外擴

30、散效應兩種。外擴散限制， 是指上述物質從宏觀體系穿過包圍在固定化酶周圍近乎停滯的液膜層到固定 化酶表面所受到的限制?？梢猿浞謹嚢杌蚧旌隙鴾p小或消除。內擴散限制，是指上述物質從固定化顆粒表面來到顆粒內部酶活性位點受到的一種限制。 一般規(guī)律：1)其效應對反應速度的影響取決于這個效應本身的大小，也取決于它與酶固有速度的相 對大?。幻阜磻俣仍瓉硇?，擴散限制影響也??；酶反應速度原來大，擴散限制影響也大。2)外擴散可以通過攪拌與混合，減輕或者消除。二、固定化后酶性質的變化1、固定化對酶活性的影響：多數情況下酶活性下降，反應速度下降 酶活性中心的重要氨基酸殘基與水不溶性載體相結合； 當酶與載體結合時，它的

31、高級結構發(fā)生了變化，其構象的改變導致了酶與底物結合能力或 催化底物轉化能力的改變； 酶被固定化后雖不失活，但酶與底物間的相互作用受到空間位阻的影響。也有在個別情況下，酶經固定化后其活力升高，可能是由于固定化后酶的抗抑能力提高使得它反而比游離酶活力高。2、固定化對酶穩(wěn)定性的影響（1）操作穩(wěn)定性提高（2）貯存穩(wěn)定性比游離酶大多數提高（3）對熱穩(wěn)定性，大多數升高，有些反而降低（4） 對分解酶的穩(wěn)定性提高（5）對變性劑的耐受力升高（6）對酸堿穩(wěn)定性，多數高于游離酶，少數降低3、pH的變化pH對酶活性的影響：（1）改變酶的空間構象（2）影響酶的催化基團的解離（3 ）影響酶的 結合基團的解離（4）改變底物

32、的解離狀態(tài)，酶與底物不能結合或結合后不能生成產物。固定化酶pH的變化1）載體帶負電荷，pH向堿性方向移動載體帶正電荷，pH向酸性方向移動。2）產物性質對pH的影響催化反應的產物為酸性時，固定化酶的pH值比游離酶的pH值高；反之則低。4、最適溫度變化一般與游離酶差不多，但有些會有較明顯的變化。5、底物特異性變化作用于低分子底物的酶一沒有明顯變化既可作用于低分子底物又可作用于大分子低物的酶特異性往往會變化6、米氏常數Km的變化，Km值隨載體性質變化由于分配效應：p =Si微環(huán)境/S宏觀環(huán)境 Km=Km/p （表觀米氏常數）（1） 載體與底物帶相同電荷，SiS , p Km固定化酶降低了酶的親和力。

33、（2） 載體與底物電荷相反，靜電作用，SiS，則p 1 Km的反應液進行酶活力測定2. 酶柱測定法：將一定量的固定化酶裝進具有恒溫裝置的反應柱中”讓底物溶液以一定的流速流過酶柱 出的反應液k測定其中產物的生成量或底物的消耗量3. 連續(xù)測定法利用連續(xù)分光光度法等測定方法可以對固定化酶反應液進行連續(xù)測定，從而測定固定化酶的酶活力。第四節(jié)微生物、植物和動物細胞固定化利用胞內酶制作固定化酶時，先要把細胞破碎，才能將里面的酶提取出來，這就增加了工序和成本，且提取的酶往往不夠穩(wěn)定。因此人們設想直接固定那些含有 所需胞內酶的細胞，并且就用這樣的細胞來催化化學反應。固定化細胞的優(yōu)點如下：(1) 省去了酶的分離

34、手續(xù)。為多酶系統(tǒng)，無須輔因子再生。(2) 細胞生長快、而且多、反應快。(3) 可以連續(xù)發(fā)酵，節(jié)約了成本，而且在蒸餾和提取前不用分離去細胞，能一邊排出發(fā)酵液,邊進行培養(yǎng)，排除了產物抑制和消耗。(4) 保持酶在細胞內的原始狀況，增加了酶的穩(wěn)定、特別是對污染因子的抵抗力增加。 固定化細胞缺點：(1) 必須保持菌體的完整，防止菌體自溶，否則，將影響產品純度。(2) 必須防止細胞內蛋白酶對所需酶的分解，同時，需抑制胞內其他酶的活性副產物的形成。(3) 細胞膜、壁會阻礙底物滲透和擴散。固定在載體上并在一定的空間范圍內進行生命活動的細胞稱為固定化細胞。該細胞能進行正常的生長、繁殖和新陳代謝，又稱固定化活細胞

35、或固定化增殖細胞。固定化細胞的制備應該具有以下特點：1. 需要控制固定化細胞的空隙度和大小。2. 選擇的固定化材料容易和便宜。3. 方法簡單容易，操作溫和，少損傷細胞。4. 有一定的網狀結構，在操作溫度和pH下不破壞。5. 有良好的機械穩(wěn)定性和化學穩(wěn)定性，對細胞不反應。6. 底物、產物可以自由擴散。7. 固定化材料應該是惰性的。8. 單位體積內盡可能固定化更多細胞，如是固定活性細胞，更加是如此。在大生產中，尤其需要考慮1、5、6點固定化細胞的分類按細胞類型分為三類：微生物；動物；植物按生理狀態(tài)分為兩大類：死細胞：完整細胞、細胞碎片、細胞器適用于一種酶催化的反應活細胞：增殖細胞、靜止細胞、饑餓細

36、胞適用于多酶反應，特別是需要輔酶的反應細胞固定化方法：吸附法主要通過載體與細胞間的靜電引力，即細胞表面與載體之間范德華作用力，離子鍵和氫鍵作用力，才使細胞固定在載體上的。常見載體的材料：硅藻土、木屑、多孔玻璃、活性炭、多孔陶瓷、離子交換樹脂、塑料包埋法包埋法是細胞固定化最常用的方法，可以分為：微膠囊法：利用半透性聚合物薄膜將細胞包裹起來，形成微型膠囊；凝膠包埋法：是在無菌條件下，將生物細胞和膠溶液混合在一起，然后再經過相應的造粒處理,形成直徑為1-4mm的膠粒。常用的包埋劑為：聚丙烯酰胺、瓊脂、海藻酸、卡拉膠、醋酸纖維、明膠等。2.4%左右的卡拉膠 70 C溶解， 再冷卻到42C ,I +10

37、%左右的細菌菌體（預熱到42C）迅速混合均勻4 C冰箱放置大約 30min取出后切成3 X3mm的小顆粒共價結合法利用細胞表面的反應基團（如氨基、羧基、羥基、巰基、咪唑基）與活化的無機或有機載體反應，形成共價鍵將細胞固定。用該法制備的 固定化細胞一般為死細胞。交聯法禾U用雙功能或多功能試劑與細胞表面的反應基團（如氨基、羧基、羥基、巰基、咪唑基）反 應，從而使細胞固定。常用的交聯劑包括：戊二醛、甲苯二異氰酸酯、雙重氮聯苯胺。 由于交聯試劑的毒性，這一方法具有一定的局限性。作用10min包埋與交聯法多乙烯多胺濃戊二醛濃度0.75%作用30min戊二醛濃度0.75%作用30min包埋與滲透交聯固定化

38、包埋與交聯固定化直接固定化利用熱、冰凍等手段固定化（如加檸檬酸、凝劑等）1、使細菌菌體內proteinase變性，保護所需酶2、使菌體內酶固定住，防止損失3、顆粒增大防止酶損失女口：葡萄糖異構酶（白色鏈霉菌），是個胞內酶50-80 C, 10分鐘有直接用霉菌孢子固定化，或者用雙功能試劑將同源和異源的酶固定于菌體的細胞壁上。如把淀粉葡萄糖苷酶偶聯于含葡萄糖異構酶的鏈霉菌上去。這樣的菌體可以直接聯合”加工淀粉成為果糖。固定化方法的比較吸附法：條件溫和、方法簡便、載體可再生。但操作穩(wěn)定性差。共價法：操作穩(wěn)定性高。但由于試劑的毒性，易引起細胞的破壞。交聯法：可得到高細胞濃度。但機械強度低，無法再生，不

39、適于實際應用。包埋法：細胞和載體間沒有束縛，固定化后，細胞仍保持較高活力。 但這類方法只適用于小分子底物。第五節(jié)固定化原生質體和輔酶一、原生質體固定化的方法制備原生質體一一將原生質體重新懸浮在含有滲透壓穩(wěn)定劑的緩沖液中配成原生質體懸浮液 一一包埋法固定化原生質體關鍵：原生質體如何制備？二、原生質體的制備將對數生長期的細胞收集一一懸浮在含有滲透壓穩(wěn)定劑的高滲緩沖液中去細胞壁分離純化得到原生質體三、酶解注意要點1、酶解前要預處理：主要是為了使酶滲透到細胞器中去。 采取的策略：先加入物質抑制或阻止某種細胞壁的成分合成，可以 使酶插入。一般加入：巰基乙醇，Triton-100 ，甘氨酸，青霉素2、酶系

40、選擇：溶菌酶、蝸牛酶、備聚糖酶纖維素、半纖維素、和果膠酶3、酶濃度選擇（ 0.5%-1% ）4、酶解溫度和 pH5、酶解作用時間四、穩(wěn)定劑（高滲溶液）要求1 加入的化合物對細胞和原生質體無毒性2 不會影響水解酶的活性3 對代謝產物無不良影響穩(wěn)定劑加入操作注意點1 一定 pH （酶和菌體活性最高）2 一定的濃度（過高濃度原生質體易脫水皺縮）3 種類：無機鹽 -對細菌有機物糖和糖醇 -酵母4 易于滲入質膜、易于被原生質體和菌體分解的物質不宜作為穩(wěn)定劑五、原生質體的固定包埋法 一般采用凝膠包埋：瓊脂、海藻酸鈣、角叉菜膠、光交聯樹脂 輔酶固定化有機輔因子中具有某些特殊的化學基團，參與酶的催化反應（遞氫

41、、遞電子或遞某些化學基團的作用）有機輔因子在使用過程中要流失，并且不能自行再生 有機輔因子價格昂貴 工業(yè)上應用全酶的關鍵是有機輔因子的保留和再生 輔酶固定化的特點：1、與酶蛋白有親和性2、酶蛋白需要輔酶才具有最大活性3、輔酶本身有弱的酶活性，一旦與酶結合，活性大增 輔酶固定化的方法：一般采用溴化氰法，碳二亞胺法以及重氮偶聯法等共價偶聯，或將其進行適當 的化學修飾后固定在超濾器中。輔酶固定化必須解決輔酶在多個酶之間傳遞的障礙。 策略：先在輔酶的一定部位進行修飾-引入功能團和間隔臂（形成輔酶衍生物）- 再與水溶性高分子結合 輔酶與酶蛋白的親和性進行固定Trpase （色氨酸酶）有四個亞基，四個活性

42、中心，需要磷酸吡哆醛，但是結合弱，容易解 離，用K離子促進結合。磷酸吡哆醛偶聯于瓊脂糖上 一利用吡哆醛四位甲基與酶蛋白的&NH2結合，形成Schiff而固定化。由于輔酶與酶蛋白的結合后，很弱，固定化后經常需要加些輔酶，以補充不足。第六節(jié)固定化酶（細胞）的應用1、固定化酶（細胞）在工農業(yè)生產上的應用葡萄糖異構酶一一世界上生產規(guī)模最大的一種固定化酶 用吸附法、結合法、凝膠包埋法等進行固定化葡萄糖異構酶葡萄糖 糖一果葡糖漿固定化酶在工業(yè)生產中的應用聚丙烯酰胺凝膠包埋含有延胡索酸酶的產氨短桿菌菌體，制得固定化延胡索酸酶；工業(yè)化生產L-蘋果酸利用固定化乳糖酶可以連續(xù)生產低乳糖奶固定化酵母細胞等微生物可用于生產各種酒類固定化原生質體的應用固定后化枯草桿菌原生質體生產堿性磷酸酶，使原來存在于細胞中的堿性磷酸酶，全部分泌到發(fā)酵液中，提高產率36%，可連續(xù)使用37天。固定化酶（細胞）應用實例固定化酶和固定化細胞應用生產時間氨基酰基轉移酶DL-氨基酸的旋光度解析1969葡萄糖異構酶將葡萄糖異構變?yōu)楣?973青霉素酰胺酶生產6-APA1973天