實驗四 過碘酸-雪夫反應(yīng)ppt課件

1、,細胞化學染色是細胞學和化學相結(jié)合的一門科學。它是以細胞形態(tài)學為基礎(chǔ)，根據(jù)化學反應(yīng)的原理、應(yīng)用涂片染色的方法觀察細胞的化學成分及其變化的重要方法。 細胞化學染色研究的對象：細胞和組織中的化學物質(zhì) 細胞化學染色的要求： 1. 保持細胞的生前結(jié)構(gòu)。 2. 保存細胞生前的化學成分和酶的活性。 3. 所用方法是已知的化學反應(yīng)或物理變化。 4. 反應(yīng)產(chǎn)物必須是一種有色物質(zhì)，可以進行顯微鏡觀察。 5. 反應(yīng)產(chǎn)物不能移位，必須有一定的穩(wěn)定性。,1,;.,細胞化學染色的步驟： 1. 固定：將細胞的生前結(jié)構(gòu)和化學物質(zhì)保存下來。 2. 顯示：通過一系列化學反應(yīng)形成穩(wěn)定的有色沉淀。 3. 復染：使各種細胞都顯示出來

2、以便于觀察。 細胞化學染色的實用價值 一、協(xié)助白血病的診斷 1.急性白血病細胞類型的鑒別。 檢查順序：POX PAS NAE+NaF NCE 2.協(xié)助慢性白血病的診斷。NAP PAS 二、協(xié)助貧血的診斷 1.缺鐵性貧血：鐵染色 2.再障：NAP 3.鐵粒幼細胞性貧血：鐵染色 三、鑒別某些容易混淆的細胞以協(xié)助診斷 四、協(xié)助鑒別良性與惡性的淋巴細胞疾病 五、協(xié)助兩種感染的鑒別,2,;.,實驗四 過碘酸-雪夫反應(yīng) (糖原染色),目的要求 1掌握本實驗的原理和臨床意義。 2熟悉本實驗的操作方法及注意事項。 實驗原理 糖原中的1，2-乙二醇基經(jīng)高碘酸氧化后產(chǎn)生醛基，此醛基進而與雪夫 (Schiff) 液

3、作用，使無色品紅變?yōu)榧t色的化合物，定位于胞漿中。 實驗器材和試劑 110gL高碘酸液 2雪夫 (Schiff) 染液 3亞硫酸液 420gL甲綠 5染色架、洗耳球、接水盤及吸水紙。 6光學顯微鏡、香柏油、乙醚和擦鏡紙。,3,;.,4,;.,5,;.,6,;.,實驗步驟,1新鮮血片或骨髓片用95乙醇固定10min，蒸餾水沖洗，待干。 210gL高碘酸氧化1520min，蒸餾水沖洗，待干。 3置雪夫試液室溫染色3060min。 4用亞硫酸溶液沖洗3次后，以自來水沖洗23min，待干。 520gL甲綠復染1020min。 6水洗，待干，鏡檢。 7結(jié)果 (1) 陽性反應(yīng)：在細胞漿內(nèi)染紅色，呈彌漫狀、顆

4、?；驂K狀。胞核染成綠色。陰性反應(yīng)，胞漿無色。 (2) 反應(yīng)強度判斷標準： 中性粒細胞的分級標準： () 胞漿無紅色顆粒。 (+) 胞漿內(nèi)呈淡紅色有極少顆粒。 (+) 胞漿呈紅色，厚而不透明，或有較少顆粒。 (+) 胞漿呈深紅色，顆粒緊密，但尚有空隙。 (+) 胞漿呈深紫紅色，顆粒緊密，無空隙。,7,;., 淋巴細胞分級標準： () 胞漿內(nèi)無顆粒。 (+) 胞漿內(nèi)呈彌散淡紅或有少數(shù)細顆粒 (10個)。 (+) 胞漿內(nèi)有較粗顆?；蛏贁?shù)小塊狀。 (+) 胞漿內(nèi)呈多數(shù)粗顆粒并有大塊紅色物質(zhì)。 幼紅細胞的分級標準： () 胞漿內(nèi)無顆粒。 (+) 胞漿內(nèi)有少數(shù)分散細小顆粒或淺紅色彌漫物質(zhì)。 (+) 胞漿內(nèi)

5、有110個中等顆?；驈浡募t色。 (+) 胞漿內(nèi)有1120個較粗顆?；虺噬罴t色。 (+) 胞漿顆粒較多，20個以上，并且粗，致密且呈紫紅色。,8,;., 巨核細胞的分級標準： () 細胞內(nèi)沒有糖原，但細胞漿內(nèi)有彌散性著色，此系其它多糖類物質(zhì)。 (+) 含少量糖原，即含數(shù)小塊或一大塊糖原，糖原常定位于近核膜處。 (+) 胞漿內(nèi)含有中等糖原，即含許多小塊或少數(shù)大塊糖原，約占胞質(zhì)的1/3。 (+) 胞漿內(nèi)含有大量糖原，呈大塊狀，其總面積約占胞漿面積的1/2以上。 （）胞漿內(nèi)充滿糖原。 (3) 陽性率和陽性積分：根據(jù)不同情況的需要，觀察同一類細胞100個，求出陽性率的百分比，將百分率與分級數(shù)的積相加，

6、其總和即為積分。,9,;.,10,;.,11,;.,12,;.,13,;.,14,;.,15,;.,實驗五 過氧化物酶 (POX) 染色,目的要求 1 掌握本實驗的原理和臨床意義。 2 熟悉本實驗的操作方法及注意事項。 實驗原理 細胞內(nèi)的過氧化物酶能將底物的過氧化氫分解，產(chǎn)生新生態(tài)氧。后者將試劑中的聯(lián)苯胺氧化為聯(lián)苯胺藍，它是一種不穩(wěn)定的中間產(chǎn)物，再與亞硝基鐵氰化鈉結(jié)合進而生成藍黑色化合物沉淀于酶的所在部位。,16,;.,實驗器材和試劑 1. 0.3 聯(lián)苯胺乙醇溶液 聯(lián)苯胺 0.3 g 88 乙醇 加至100 ml 2. 360gL亞硝基鐵氰化鈉飽和液 3. 稀過氧化氫液（新鮮配制） 3 過氧化

7、氫 0.3 ml 蒸餾水 25 ml 4. 瑞氏染液、PH 6.46.8磷酸鹽緩沖液。 5. 光學顯微鏡、香柏油、乙醚和擦鏡紙。 6. 染色架、洗耳球、接水盤及吸水紙。,17,;.,實驗步驟 1.取0.3 聯(lián)苯胺乙醇溶液 1ml，360gL亞硝基鐵氰化鈉飽和液10l，混勻。 2. 于新鮮干燥血涂片或骨髓片上滴加上述混合液0.5ml，使蓋滿整個血膜，作用12min。 3. 滴加等量的稀過氧化氫液，混勻，染48min。 4. 勿傾去染液，直接用水沖洗。 5.干燥后再用瑞氏染液復染。 6.結(jié)果 在細胞的胞漿中出現(xiàn)藍色或藍黑色顆粒為陽性反應(yīng)。 陽性反應(yīng)強度的判斷： 陰性：無顆粒。 弱陽性：顆粒小，分布

8、稀疏。 陽性：顆粒略粗，分布較密集。 強陽性：顆粒粗大。,18,;.,19,;.,實驗六 堿性磷酸酶 （NAP） 染色,目的要求 1 掌握本實驗的原理和臨床意義。 2 熟悉本實驗的操作方法及注意事項。 實驗原理 中性粒細胞胞質(zhì)內(nèi)的堿性磷酸酶在PH 9.6的堿性條件下能水解磷酸萘酚，生成萘酚，后者與重氮鹽偶聯(lián)形成不溶性的有色沉淀定位于胞漿中的酶活性處。,20,;.,實驗步驟,1取新鮮血片自然干燥后放入95乙醇液固定10min，用流水沖洗，待干。 2取基質(zhì)液，預溫至37，將血片置入，繼續(xù)溫育46h。 3滴加20gL硝酸鈷，作用5 min，蒸餾水沖洗。 4滴加20gL硫化銨，作用5 min，蒸餾水沖

9、洗。 5用20gL甲綠水溶液復染23 min或用10gL伊紅復染35 min。 6水洗，待干，鏡檢。 7結(jié)果 (1)正常人的血細胞堿性磷酸酶除中性成熟粒細胞(桿狀核及分葉核)可見陽性外，其它細胞均呈陰性。 (2)判斷標準及分級： (-) 0分：胞漿呈淡紅色，無任何棕黑色顆粒。 (+) 1分：胞漿呈均勻淺色，無顆?；蛴猩倭孔睾谏w粒，但不超過胞漿總面積的14。 (+) 2分：全部胞漿呈均勻棕黑色或出現(xiàn)較粗的黑色顆粒，不超過胞漿12。 (+) 3分：胞漿中已基本充滿棕黑色顆粒，但密度較低。 (+) 4分：全部胞漿充滿粗大棕黑色顆粒而呈深黑色甚至掩蓋其胞核。 (3)計算積分值：油鏡下計數(shù)100個中性

10、桿狀核、分葉核粒細胞，分別記錄其分級情況，全部陽性反應(yīng)細胞之和即陽性率。將得出各種積分的百分率乘以該積分數(shù)，然后相加即為總積分。,21,;.,實驗七 鐵染色,目的要求 1掌握本實驗的原理和臨床意義。 2熟悉本實驗的操作方法及注意事項。 實驗原理 骨髓小粒中的含鐵血黃素稱細胞外鐵，其中的三價鐵與分子中的蛋白質(zhì)結(jié)合不牢，經(jīng)稀鹽酸處理后而游離，并能在酸性亞鐵氰化鉀溶液中產(chǎn)生普魯士藍反應(yīng)。細胞內(nèi)鐵也可用此法顯示。根據(jù)反應(yīng)的強弱了解骨髓中鐵的含量。 實驗器材和試劑 1. 甲醇 2200g/L亞鐵氰化鉀溶液 3濃鹽酸 4. 2g/L核固紅-硫酸鋁溶液,22,;.,實驗步驟,1選髓粒豐富的骨髓片，用甲醇固定

11、10min。 配制酸性亞鐵氰化鉀溶液： 200g/L亞鐵氰化鉀溶液 5份 濃鹽酸 1份 3玻片上滴滿酸性亞鐵氰化鉀溶液，染色30min。 4用蒸餾水沖洗后用2g/L核固紅-硫酸鋁溶液復染1015min。 5流水沖洗、待干、鏡檢。 6結(jié)果 (1)在紅色背景下鐵粒呈藍綠色。 (2)細胞外鐵：用低倍鏡觀察涂片，特別是涂片尾部和髓粒附近，注意翠藍色顆粒的存在，可分五級標準。 (-)：無顆粒所見。 (+)：有少數(shù)鐵顆?；蚺家婅F小珠。 (+)：有較多的鐵顆粒和小珠。 (+)：有很多的鐵顆粒、小珠和少數(shù)小塊狀。 (+)：有極多鐵顆粒、小珠，有很多的小塊，密集成堆。,23,;.,24,;.,25,;.,26,;.,27,;.,28,;.,(3)細胞內(nèi)鐵：用油鏡計數(shù)100個中、晚幼紅細胞，記錄胞漿中含有藍色鐵粒的細胞(鐵粒幼紅細胞)的百分