離心分離技術(shù)

1、離心分離技術(shù),離心是利用旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)的離心力以及物質(zhì)的沉降系數(shù)或浮力密度的差異進(jìn)行分離、濃縮和提純的一種方法。顆粒的沉降速度取決于離心機(jī)的轉(zhuǎn)速及其自身與中心軸的距離。不同大小、形狀和密度的顆粒會(huì)以不同的速度沉降。,基本原理, 離心力（centrifugal force，F(xiàn)c）離心作用是根據(jù)在一定角度速度下作圓周運(yùn)動(dòng)的任何物體都受到一個(gè)向外的離心力進(jìn)行的。離心力（Fc）的大小等于離心加速度2X與顆粒質(zhì)量m的乘積，即： 其中是旋轉(zhuǎn)角速度，以弧度/秒為單位；X是顆粒離開旋轉(zhuǎn)中心的距離，以cm為單位；m是質(zhì)量，以克為單位。,相對(duì)離心力（relative centrifugal force，RCF）,由于各

2、種離心機(jī)轉(zhuǎn)子的半徑或者離心管至旋轉(zhuǎn)軸中心的距離不同，離心力而受變化，因此在文獻(xiàn)中常用“相對(duì)離心力”或“數(shù)字g”表示離心力，只要RCF值不變，一個(gè)樣品可以在不同的離心機(jī)上獲得相同的結(jié)果。RCF就是實(shí)際離心場轉(zhuǎn)化為重力加速度的倍數(shù)。 式中X為離心轉(zhuǎn)子的半徑距離，以cm為單位；g為地球重力加速度（980cm/sec2）；n為轉(zhuǎn)子每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)（rpm）。,將離心機(jī)轉(zhuǎn)數(shù)換成相對(duì)離心力時(shí)，先在離心機(jī)半徑標(biāo)尺上取已知的離心機(jī)半徑和在轉(zhuǎn)數(shù)標(biāo)尺上取已知的離心機(jī)轉(zhuǎn)數(shù)，然后將這兩點(diǎn)間劃一條直線，在圖中間RCF標(biāo)尺上的交叉點(diǎn)，即為相應(yīng)的離心力數(shù)值。例已知離心機(jī)轉(zhuǎn)數(shù)為2500rpm，離心機(jī)的半徑為7.7cm，將兩點(diǎn)連接

3、起來交于RCF標(biāo)尺，此交點(diǎn)500g即是RCF值。,離心技術(shù)的分類,（一）差速離心 Differential centrifugation,它利用不同的粒子在離心力場中沉降的差別，在同一離心條件下，沉降速度不同，通過不斷增加相對(duì)離心力，使一個(gè)非均勻混合液內(nèi)的大小、形狀不同的粒子分部沉淀。操作過程中一般是在離心后用傾倒的辦法把上清液與沉淀分開，然后將上清液加高轉(zhuǎn)速離心，分離出第二部分沉淀，如此往復(fù)加高轉(zhuǎn)速，逐級(jí)分離出所需要的物質(zhì)。 差速離心的分辨率不高，沉淀系數(shù)在同一個(gè)數(shù)量級(jí)內(nèi)的各種粒子不容易分開，常用于其他分離手段之前的粗制品提取。,Low speed,High speed,Differenti

4、al centrifugation,特點(diǎn)： 介質(zhì)密度均一； 速度由低向高，逐級(jí)離心。 用途：分離大小相差懸殊的細(xì)胞和細(xì)胞器。 沉降順序：核線粒體溶酶體與過氧化物酶體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高基體核蛋白體。 可將細(xì)胞器初步分離，常需進(jìn)一步通過密度梯離心再行分離純化。,（二）密度梯度離心,又稱密度梯度區(qū)帶離心, 是在有密度梯度的惰性密度梯度的介質(zhì)液中進(jìn)行離心沉降或沉降平衡，即在一定離心力下把顆粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同區(qū)帶的離心方法。,用介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細(xì)胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過離心力場的作用使細(xì)胞和細(xì)胞成分分層、分離。 類型：速度沉降、等密度沉降。 常用介質(zhì)：

5、氯化銫、蔗糖、多聚蔗糖。 分離活細(xì)胞的介質(zhì)要求： 1）能產(chǎn)生密度梯度，且密度高時(shí)，粘度不高； 2）PH中性或易調(diào)為中性； 3）濃度大時(shí)滲透壓不大； 4）對(duì)細(xì)胞無毒。,（一）速率區(qū)帶離心法 將樣品置于平緩的預(yù)先制好密度梯度介質(zhì)上，進(jìn)行離心，較大的顆粒將比較小的顆粒更快地沉降通過梯度介質(zhì)，形成幾個(gè)明顯的區(qū)帶（條帶）。 差速區(qū)帶離心法僅用于分離有一定沉降系數(shù)差的顆粒，與密度無關(guān)。大小相同、密度不同的顆粒（如溶酶體、線粒體和過氧化物酶體）不能用本法分離。 離心時(shí)，由于離心力的作用，顆粒離開原樣品層，按不同沉降速率沿管底沉降。離心一定時(shí)間后，沉降的顆粒逐漸分開，最后形成一系列界面清楚的不連續(xù)區(qū)帶。沉降系

6、數(shù)越大，往下沉降的越快，所呈現(xiàn)的區(qū)帶也越低。沉降系數(shù)較小的顆粒，則在較上部分依次出現(xiàn)。,從顆粒的沉降情況看來，離心必須在沉降最快的顆粒（大顆粒）到達(dá)管底前或剛到達(dá)管底時(shí)結(jié)束，使顆粒處于不完全的沉降狀態(tài)，而出現(xiàn)在某一些特定的區(qū)帶內(nèi)。 在離心過程中，區(qū)帶的位置和形狀（或帶寬）隨時(shí)間而改變，因此，區(qū)帶的寬度不僅取決于樣品組分的數(shù)量、梯度的斜率、顆粒的擴(kuò)散作用和均一性，也與離心時(shí)間有關(guān)。時(shí)間越長，區(qū)帶越寬。適當(dāng)增加離心力可縮短離心時(shí)間，并可減少擴(kuò)散導(dǎo)致的區(qū)帶加寬現(xiàn)象，增加區(qū)帶界面的穩(wěn)定性。,速率區(qū)帶離心法 用途：分離密度相近而大小不等的細(xì)胞或細(xì)胞器。 特點(diǎn)：介質(zhì)密度較低，介質(zhì)的最大密度應(yīng)小于被分離生物

7、顆粒的最小密度。 原理：介質(zhì)密度梯度平緩，分離物按各自的沉降系數(shù)以不同的速度沉降而達(dá)到分離。,2.等密度沉降 isopycnic sedimentation,等密度離心, 被分離的樣品中顆粒的密度在密度梯度液密度范圍內(nèi)，在離心過程中，顆粒沉或浮分別移動(dòng)到與梯度液某密度相等處而成為一懸浮層，此種密度梯度離心方式稱為等密度離心。 它與密度梯度沉降離心不同，是被分離樣品中的各種顆粒的密度在整個(gè)密度梯度液的范圍內(nèi)，介質(zhì)的梯度密度往往是利用強(qiáng)大的離心力使組成梯度液的成份自形成密度梯度，當(dāng)不同顆粒存在浮力密度差時(shí)，在離心力的作用下，顆?；蛳蛳鲁两祷蛳蛏细∑穑恢毖靥荻纫苿?dòng)到與它們恰好相等密度梯度的位置上（即等密度點(diǎn)）形成區(qū)帶層。,用途：分離密度不等的顆粒。 特點(diǎn)： 介質(zhì)密度高，陡度大，介質(zhì)最高密度大于被分離組分的最大密度。 力場比速率沉降法大10100倍，需要高速或超速離心。