離心分離技術

1、離心分離技術,離心是利用旋轉運動的離心力以及物質的沉降系數或浮力密度的差異進行分離、濃縮和提純的一種方法。顆粒的沉降速度取決于離心機的轉速及其自身與中心軸的距離。不同大小、形狀和密度的顆粒會以不同的速度沉降。,基本原理, 離心力（centrifugal force，Fc）離心作用是根據在一定角度速度下作圓周運動的任何物體都受到一個向外的離心力進行的。離心力（Fc）的大小等于離心加速度2X與顆粒質量m的乘積，即： 其中是旋轉角速度，以弧度/秒為單位；X是顆粒離開旋轉中心的距離，以cm為單位；m是質量，以克為單位。,相對離心力（relative centrifugal force，RCF）,由于各

2、種離心機轉子的半徑或者離心管至旋轉軸中心的距離不同，離心力而受變化，因此在文獻中常用“相對離心力”或“數字g”表示離心力，只要RCF值不變，一個樣品可以在不同的離心機上獲得相同的結果。RCF就是實際離心場轉化為重力加速度的倍數。 式中X為離心轉子的半徑距離，以cm為單位；g為地球重力加速度（980cm/sec2）；n為轉子每分鐘的轉數（rpm）。,將離心機轉數換成相對離心力時，先在離心機半徑標尺上取已知的離心機半徑和在轉數標尺上取已知的離心機轉數，然后將這兩點間劃一條直線，在圖中間RCF標尺上的交叉點，即為相應的離心力數值。例已知離心機轉數為2500rpm，離心機的半徑為7.7cm，將兩點連接

3、起來交于RCF標尺，此交點500g即是RCF值。,離心技術的分類,（一）差速離心 Differential centrifugation,它利用不同的粒子在離心力場中沉降的差別，在同一離心條件下，沉降速度不同，通過不斷增加相對離心力，使一個非均勻混合液內的大小、形狀不同的粒子分部沉淀。操作過程中一般是在離心后用傾倒的辦法把上清液與沉淀分開，然后將上清液加高轉速離心，分離出第二部分沉淀，如此往復加高轉速，逐級分離出所需要的物質。 差速離心的分辨率不高，沉淀系數在同一個數量級內的各種粒子不容易分開，常用于其他分離手段之前的粗制品提取。,Low speed,High speed,Differenti

4、al centrifugation,特點： 介質密度均一； 速度由低向高，逐級離心。 用途：分離大小相差懸殊的細胞和細胞器。 沉降順序：核線粒體溶酶體與過氧化物酶體內質網與高基體核蛋白體。 可將細胞器初步分離，常需進一步通過密度梯離心再行分離純化。,（二）密度梯度離心,又稱密度梯度區(qū)帶離心, 是在有密度梯度的惰性密度梯度的介質液中進行離心沉降或沉降平衡，即在一定離心力下把顆粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同區(qū)帶的離心方法。,用介質在離心管內形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細胞混懸液或勻漿置于介質的頂部，通過離心力場的作用使細胞和細胞成分分層、分離。 類型：速度沉降、等密度沉降。 常用介質：

5、氯化銫、蔗糖、多聚蔗糖。 分離活細胞的介質要求： 1）能產生密度梯度，且密度高時，粘度不高； 2）PH中性或易調為中性； 3）濃度大時滲透壓不大； 4）對細胞無毒。,（一）速率區(qū)帶離心法 將樣品置于平緩的預先制好密度梯度介質上，進行離心，較大的顆粒將比較小的顆粒更快地沉降通過梯度介質，形成幾個明顯的區(qū)帶（條帶）。 差速區(qū)帶離心法僅用于分離有一定沉降系數差的顆粒，與密度無關。大小相同、密度不同的顆粒（如溶酶體、線粒體和過氧化物酶體）不能用本法分離。 離心時，由于離心力的作用，顆粒離開原樣品層，按不同沉降速率沿管底沉降。離心一定時間后，沉降的顆粒逐漸分開，最后形成一系列界面清楚的不連續(xù)區(qū)帶。沉降系

6、數越大，往下沉降的越快，所呈現的區(qū)帶也越低。沉降系數較小的顆粒，則在較上部分依次出現。,從顆粒的沉降情況看來，離心必須在沉降最快的顆粒（大顆粒）到達管底前或剛到達管底時結束，使顆粒處于不完全的沉降狀態(tài)，而出現在某一些特定的區(qū)帶內。 在離心過程中，區(qū)帶的位置和形狀（或帶寬）隨時間而改變，因此，區(qū)帶的寬度不僅取決于樣品組分的數量、梯度的斜率、顆粒的擴散作用和均一性，也與離心時間有關。時間越長，區(qū)帶越寬。適當增加離心力可縮短離心時間，并可減少擴散導致的區(qū)帶加寬現象，增加區(qū)帶界面的穩(wěn)定性。,速率區(qū)帶離心法 用途：分離密度相近而大小不等的細胞或細胞器。 特點：介質密度較低，介質的最大密度應小于被分離生物

7、顆粒的最小密度。 原理：介質密度梯度平緩，分離物按各自的沉降系數以不同的速度沉降而達到分離。,2.等密度沉降 isopycnic sedimentation,等密度離心, 被分離的樣品中顆粒的密度在密度梯度液密度范圍內，在離心過程中，顆粒沉或浮分別移動到與梯度液某密度相等處而成為一懸浮層，此種密度梯度離心方式稱為等密度離心。 它與密度梯度沉降離心不同，是被分離樣品中的各種顆粒的密度在整個密度梯度液的范圍內，介質的梯度密度往往是利用強大的離心力使組成梯度液的成份自形成密度梯度，當不同顆粒存在浮力密度差時，在離心力的作用下，顆?；蛳蛳鲁两祷蛳蛏细∑?，一直沿梯度移動到與它們恰好相等密度梯度的位置上（即等密度點）形成區(qū)帶層。,用途：分離密度不等的顆粒。 特點： 介質密度高，陡度大，介質最高密度大于被分離組分的最大密度。 力場比速率沉降法大10100倍，需要高速或超速離心。