現(xiàn)代科技綜述知識文庫：固相肽合成中的接肽方法

1、現(xiàn)代科技綜述系列固相肽合成中的接肽方法科技是人類區(qū)別于動物的重要文明之一，是人類對自然規(guī)律研究和利用的學科。本文提供對科技基本概念“固相肽合成中的接肽方法”的解讀，以供大家了解。固相肽合成中的接肽方法固相肽合成法(solid-phase peptide synthesis，SPPS)自1963年由梅里菲爾德(R*B*Merrifield)首次提出其設(shè)計思路至今，經(jīng)過30余年多肽化學工作者的改進和完善已成為一種十分重要和常用的多肽合成技術(shù)。其發(fā)展和推廣除了歸功于種類繁多的固相載體、肽鏈在載體上的連接和解脫方法、以及各種新型、優(yōu)異的氨基與側(cè)鏈保護基的出現(xiàn)外，還應歸功于各種接肽方法的日趨勢成熟和不斷

2、創(chuàng)新。在SPPS中得到普遍應用的接肽方法主要有4種：(1)直接縮合法(In situ法)；(2)對稱酸酐法；(3)縮合試劑添加劑法；(4)活潑酯法。直接將N，N二環(huán)已基碳二亞胺(DCC)和保護的氨基酸的二氯甲烷溶液(有時需加部分DMF助溶)加入樹脂中攪拌反應是SPPS中最早的方法(in situ DCC法)。所經(jīng)過的活化中間體為高反應活性的O?；愲搴蛯ΨQ酸酐2。In situ DCC法操作簡便，反應速度快，產(chǎn)率高，因而至今一直得到廣泛的應用。但主要缺點是：(1)在反應中生成的副產(chǎn)物二環(huán)已基脲在接肽溶劑二氯甲烷中的溶解度很小，要將其洗滌除去需要花費大量的溶劑和時間，甚至雖經(jīng)多次洗滌，仍會有少量

3、吸附在樹脂內(nèi)部的空隙中而影響后反應。因此發(fā)展了生成的脲能溶于二氯甲烷的碳二亞胺型縮合試劑，如薩拉坦可斯(DSarantaksi)等1976年發(fā)現(xiàn)的二異丙基碳二亞胺；伊澤德白斯克(JIZdebski)等1984年和1989年發(fā)現(xiàn)的特丁基乙基碳二亞胺和特丁基乙基碳二亞胺。(2)活化和縮合在一起進行，消旋副反應的產(chǎn)物不能預先除去，就存在連接到肽鏈上的危險。(3)當羧基組分為N保護的Asn和N保護的Gln時，不能用此法接肽，因為二者在用DCC活化時，可以發(fā)生脫水副反應生成腈化的3，3可以再次被DCC活化而連接到肽鏈上。鑒于上述缺點，人們又研究發(fā)展了其他類型的縮合試劑，其中在In situ法中得到應用的

4、有Bop(4)、PyBop(5)、HBTU(6)和Bop-Cl(7)。1988年阿恰納(HEchner)采用In situ Bop法合成了含28個殘基的胸腺素1，認為該法尤其適合連續(xù)流程的固相合成技術(shù)。連接N保護Glu和His(Tos)時，和DCC法相比消旋產(chǎn)物比例降低。而且連接N保護的Ser、Thr、Tyr時，這些氨基酸的側(cè)鏈羥基可不加保護。Bop法的缺點是其反應副產(chǎn)物為致癌化合物HMPA，同時也不適用于N保護Asn和Gln的接肽。用PyBop代替Bop則生成的副產(chǎn)物毒性大大降低。HBTU法比Bop法更為有效，接肽時氨基酸的側(cè)鏈羥基也無需保護，而且適用于Gln和Asn的接肽。其反應副產(chǎn)物無毒

5、且溶于水和二氯甲烷，易于除去。Bop-CE特別適用于立體位阻大的N保護氨基酸的接肽，但其缺點是有消旋副反應。添加HOBt或咪唑可以降低產(chǎn)物的消旋程度。鑒于In situ DCC法實際上主要經(jīng)過對稱酸酐2進行的事實，1971年威拉德(TWieland)等提出了對稱酸酐法。最常用的實驗步驟是將N保護的氮基酸和DCC按21的比例在二氯甲烷中0反應1520min，濾出析出的二環(huán)已基脲，所得對稱酸酐立即用于接肽反應。Bop和HBTU也可用來制備對稱酸酐。對稱酸酐法的特點為：(1)反應活性高，反應速度快；(2)縮合產(chǎn)率高(996%998%)；(3)克服了In situ DCC法的某些缺點，如DCC與肽鏈的

6、某些副反應，副產(chǎn)物二環(huán)已基脲難除去等。其主要缺點是原料浪費，而且同樣不適于N保護的Asn和Gln的接肽。對N，N雙保護的Arg也不適用，因其高活性的對稱酸酐存在下式所示的副反應，生成內(nèi)酰胺8。對稱酸酐法的另外兩個副反應為在三級胺存在下的消旋反應和下式所示的重排形成二肽9的副反應。9能被進一步活化導致微量的(03%)“夾心肽”的形成。對Gly此副反應最為嚴重。在用對稱酸酐法接肽時，卡爾斯根(RKirstgen)、勞爾森(RHLaursen)、王(SSWang)等報道一旦反應開始或接近完全，在反應液中添加某些堿性物質(zhì)如二異丙基乙基胺、N甲基嗎啉和4二甲氨基吡啶等可以促進反應速度。但4二甲基氨基吡啶

7、較少使用，因其同時也能促進消旋副反應和成二肽副反應的發(fā)生。反應液中存在DMF或添加三氟乙醇也有利于增加反應速度。1966年威敢德(FWeygand)等人發(fā)現(xiàn)用DCC作縮合試劑時添加某些輔助性的親核試劑如N羥基丁二酰亞胺(HOSu)可以抑制DCC法中的消旋副反應和ON遷移副反應。這一方法在SPPS中立即得到了應用。但對HOSu而言，由于它在SPPS中反應速度不理想，產(chǎn)率也不好，且存在下式所示的副反應，導致肽鏈的終止，故而在SPPS中較少用于逐步合成，較多用于片段合成。1970年凱耐格(RGeiger)等人報道的1羥基苯駢三唑(HOBt)是一個較好的添加劑，它不與DCC反應，因而沒有象HOSu那樣

8、的副反應，而且反應速度快(接近In situ DCC法及對稱酸酐法)，產(chǎn)率高，產(chǎn)物的消旋程度小，還避免了In situ法中的ON遷移副反應，因而已發(fā)展成為一種常用的固相成肽方法DCCHOBt法。其活化中間體主要為N保護氨基酸形成的HOBt活潑酯10。該法可按兩種方式操作：(1)In situ和(2)預先活化HOBt法。也可采用其它縮合試劑如Bop和Bop CE等來形成HOBt活潑酯。據(jù)漢得森(DHudson)報道，BopHOBt法反應速度大于In situ DCC法，而DCCHOBt法則略小于InsituDCC法?？s合試劑HOBt法可采用于N保護Asn和Gln的接肽，因為在該種反應條件下，這兩

9、種氨基酸的脫水副反應可得到抑制。但卻不適于氨基用鄰硝基苯硫基、聯(lián)苯異丙氧羰基(Bpoc)的氨基酸及咪唑基用于對甲苯磺酰保護的His的接肽，因為HOBt的酸性能引起這些對酸敏感的保護基的提前脫除。活潑酯法是一種久為人知并得到穩(wěn)定發(fā)展的成肽方法?；顫婖ヒ话悴捎迷贒CC或其他縮合試劑存在下將N保護氨基酸和相應的羥基化合物縮合制備?；顫婖シǖ膬?yōu)點是把活化中間體變成具有一定的穩(wěn)定性，可以分離，純化和貯存但仍有相當反應活性的酯類中間體，因此一系列N保護氨基酸的活潑酯曾用于SPPS中。但是，因為活潑酯的立體效應大和反應活性低等不利因素在固相合成中顯得更加突出，因而成肽反應慢，產(chǎn)率低，而且有些活潑酯在SPPS

10、所用的溶劑二氯甲烷中的溶解度差，這就限制了活潑酯法在SPPS中的應用。為了提高活潑酯的反應活性，人們從兩個方面著手努力：在活潑酯的離去部分引入強拉電性的原子或基團來提高離去部分的離去能力和活潑酯的親電能力；在用活潑酯接肽時添加某些添加劑如HOBt或二異丙基乙基胺來加速反應。已出現(xiàn)的30多種活潑酯中，在SPPS中引起人們重視的主要有鄰硝基苯酯(ONo)、對硝基苯酯(ONp)、2，4，5三氯苯酯(OTcp)、N羥基丁二酰亞胺酯(HOSu)、五氟苯酯(Pfp)、1羥基苯駢三唑(HOBt)、3羥基3，4二氫化4氧化1，2，3苯駢三嗪(ODhbt)、2，5二苯基2，3二氫化1，B三氧代4羥基噻吩酯(OT

11、DO)、3苯基1(對硝基苯基)2吡唑啉5酮(Pnp)和3甲基1對硝基苯基2吡唑啉5酮(Npp)等。用ONo和ONp活潑酯接肽，反應速度慢，但可避免Asn和Gln的脫水副反應。用OTcp或Pfp酯接肽，反應速度較慢，但添加HOBt后反應速度大大加快，可接近對稱酸酐法。HOSu活潑酯曾成功地用于短桿菌肽的合成，但因其前述封閉肽鏈的副反應，不宜推廣使用。1970年凱耐格(RGeiger)等提出的ODhbt酯是一種很有前途的活潑酯，據(jù)報道它具有和HOBt活潑酯相類似的低消旋程度和反應性質(zhì)，反應速度卻快于Pfp酯、接近對稱酸酐法，且本身又較穩(wěn)定，便于分離、純化和貯存。OTDO酯的最大優(yōu)點是產(chǎn)物的消旋程度

12、極低，且其本身也很穩(wěn)定，易于貯存。最近漢得森(DHudson)報道了Pnp和Npp酯的高反應活性，接肽反應速度居各種活潑酯之首。漢得森的實驗結(jié)果表明上述各種活潑酯的反應活性順序為：PnpNppODhbtDIClHOBtPfpOTDOOTcpHOSuONpONo。此外，在用ODhbt、OTDO、Pnp和Npp接肽時，可通過反應完成前后顏色的變化監(jiān)測反應進行的完全程度。除了上述肽鏈形成的方法外，液相合成中大多數(shù)其他成肽方法如迭氮化物法、混合酸酐法、四組分縮合法等都曾在SPPS中應用過，但由于各自的缺點而沒有得到推廣。盡管如此，其它方法在某些特定條件下的作用也不能忽視。值得指出70年代中期由麥特休德

13、(RMatsueda)等人提出的氧化還原縮合法和近年來中外學者提出的活潑酰胺法在SPPS中仍有很大的潛力。如上所述，各種接肽方法各有其優(yōu)點和局限，在實際工作中人們往往把不同的方法結(jié)合起來，取長補短，以滿足肽合成的復雜需要。同時，進一步發(fā)展和完善現(xiàn)有成肽方法、探索新型縮合試劑仍然是發(fā)展固相肽合成技術(shù)的一個重要而艱巨的任務?！緟⒖嘉墨I】： 1 Merrifield R B. J Amer ChemSoc, 1963 ,85 :21492154 2 Wolters E T M, et al. J Org Chem, 1974,39:33883392 3 Yamashiro D, et al. J Amer Chem Soc, 1978,100:5174 5179 4 Birr C. Aspects of the merrifield peptide synthesis.Springer-Verlag,BerlinHeidelberg, New York,1978 5 Merrifieldll R B. Angew Chem, 1985,97:801812 6 黃惟德，等多肽合成北京：科學出版社，1985，202205 7 Barany G, et al. IntJ