生物起搏種子細(xì)胞篩選及HCN通道電藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究(課堂PPT)

1、,生物起搏種子細(xì)胞篩選及HCN通道電藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究,報(bào)告人：楊靖 導(dǎo) 師：黃從新 教授,研究背景,緩慢性心律失常為臨床常見多發(fā)病 電子起搏器植入術(shù)是治療嚴(yán)重緩慢性心律失常的首選方案,電子起搏器存在缺陷,非生理性起搏 電池壽命有限 易受外界電磁干擾等,生物起搏器構(gòu)建-當(dāng)前研究熱點(diǎn),主要內(nèi)容,生物起搏器種子細(xì)胞篩選 HCN通道電生理及藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究,第一部分,生物起搏器種子細(xì)胞篩選,研究對(duì)象,心臟干細(xì)胞（CSCs） 脂肪干細(xì)胞（ASCs） 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（ BMSCs）,CSCs的相關(guān)研究,研究?jī)?nèi)容,CSCs的分離培養(yǎng)及其鑒定 5-氮雜胞苷誘導(dǎo)CSCs向竇房結(jié)樣細(xì)胞分化,實(shí)驗(yàn)方法,小園形、亮的細(xì)

2、胞從組織移植塊中爬出（箭頭所示）（200）,流式細(xì)胞儀分選,左圖，分選前流式細(xì)胞儀檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞c-kit陽性率 右圖，用流式細(xì)胞儀分選經(jīng) c-kit 標(biāo)記的細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測(cè),流式細(xì)胞儀鑒定分選后CD34、CD45的陽性率,倒置顯微鏡觀察,分選后的單個(gè)細(xì)胞（左圖），培養(yǎng)后簇集式增殖、心球樣細(xì)胞團(tuán)形成（右圖）（200）,熒光顯微鏡觀察,在光學(xué)顯微鏡下(左圖)、熒光顯微鏡下（右圖）觀察剛分選 的同一批c-kit+細(xì)胞（400）,增殖能力比較 不同部位間比較,增殖能力比較 不同性別間比較,免疫熒光檢測(cè),分選后4周用抗cTnI, SMA and CD31抗體檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞免疫表型（A,300; B-C

3、,200）,RT-PCR檢測(cè),RT-PCR檢測(cè),RT-PCR方法分析分選細(xì)胞不同培養(yǎng)時(shí)間的GATA-4, HCN2和HCN4的mRNA表達(dá) * P 0.05, # P 0.01, 培養(yǎng)8周組 vs 培養(yǎng)4周組,免疫熒光檢測(cè)5-Aza誘導(dǎo)CSCs分化,用抗cTnI, GATA4抗體檢測(cè)經(jīng)5-Aza誘導(dǎo)后CSCs分化的免疫表型 （A,200; B,400）,免疫熒光檢測(cè),用抗HCN4抗體檢測(cè)經(jīng)5-Aza誘導(dǎo)后CSCs分化細(xì)胞表達(dá)HCN4蛋白情況 （A,400; B,200）,熒光檢測(cè)結(jié)果比較,不同濃度5-aza誘導(dǎo)后的細(xì)胞在4周時(shí)表達(dá)GATA-4, cTnI 和HCN4蛋白情況 . 10uM組與前

4、兩組比較， # P 0.05,5-Aza誘導(dǎo)濃度,RT-PCR檢測(cè),RT-PCR技術(shù)分析在不同濃度5-aza誘導(dǎo)后的細(xì)胞在不同培養(yǎng)時(shí)間的 GATA-4, HCN2和HCN4 mRNA表達(dá),RT-PCR檢測(cè),RT-PCR技術(shù)分析在不同濃度5-aza誘導(dǎo)后的培養(yǎng)細(xì)胞在不同培養(yǎng)時(shí)間的GATA-4, HCN2和HCN4 mRNA表達(dá). P 0.05, # P 0.01, 2組 vs 3組或4組,結(jié) 論,體外培養(yǎng)條件下可以獲得c-kit+ CD34- CD45- CSCs 不同部位不同性別來源CSCs的增殖 能力存在差異,c-kit+CSCs具有向心肌樣和竇房結(jié)樣 細(xì)胞分化的能力 10M 5-Aza有增

5、強(qiáng)上述分化的作用,ASCs與BMSCs相關(guān)研究,實(shí)驗(yàn)流程,形態(tài)學(xué)比較 （P5）,( 200),ASCs,BMSCs,表面標(biāo)記物檢測(cè)（P5）,抗原表達(dá)水平無顯著差異,增殖能力比較,* P 0.05 * P 0.01,ASCs體外擴(kuò)增能力強(qiáng)于BMSCs 且P15仍保持較高的增殖能力,ASCs和BMSCs向心肌細(xì)胞分化 能力比較 （P5）,(400),犬ASCs心肌樣分化能力強(qiáng)于BMSCs,a ASCs b BMSCs c 兩者對(duì)比,RT-PCR檢測(cè)加入5-AZa后ASCs與BMSCs HCN4 mRNA的表達(dá),a ASCs b BMSCs c 兩者對(duì)比,各個(gè)時(shí)間點(diǎn)ASCs中HCN4 mRNA表達(dá)量

6、均高于BMSCs,ASCs和BMSCs轉(zhuǎn)染HCN4效率比較,（400）,a ASCs b BMSCs c 兩者對(duì)比,P5代ASCs與BMSCs轉(zhuǎn)染效率無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 P 0.05,（400）,ASCs和BMSCs轉(zhuǎn)染HCN4后凋亡率比較,a ASCs b BMSCs c 兩者對(duì)比,P5代ASCs轉(zhuǎn)染HCN基因后凋亡率低于BMSCs P 0.05,結(jié) 論,來自同一個(gè)體的ASCs與BMSCs相比 具有更強(qiáng)的體外增殖能力 具有更強(qiáng)的向心肌樣細(xì)胞及竇房結(jié)樣細(xì)胞分化的能力 二者基因轉(zhuǎn)染效率相似，但轉(zhuǎn)染HCN4基因后 ASCs 凋亡水平更低,第二部分,HCN通道電生理及藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究,主要內(nèi)容,HCN通

7、道在卵母細(xì)胞中的表達(dá) HCN2/HCN4通道復(fù)合體轉(zhuǎn)染ASCs 胺碘酮對(duì)HCN通道的作用及機(jī)制,HCN通道在卵母細(xì)胞中的表達(dá),卵母細(xì)胞鉗記錄通道電流,實(shí)驗(yàn)流程,電生理學(xué)指標(biāo),電流表達(dá)幅值 通道動(dòng)力學(xué)特性,HCN通道電流,A.HCN1 電流 B.HCN2 電流 C.HCN4 電流 D.激活曲線,HCN通道動(dòng)力學(xué),A.典型電流 B.I-V曲線 C.去激活常數(shù) D.激活常數(shù),HCN1/HCN2共表達(dá)形成的電流幅值,HCN1/HCN4共表達(dá)形成的電流幅值,HCN2/HCN4共表達(dá)形成的電流幅值,HCN1/HCN2與單個(gè)亞型通道動(dòng)力學(xué)比較,A.電流圖 B.激活時(shí)間常數(shù) C.激活曲線,HCN1/HCN4與

8、單個(gè)亞型通道動(dòng)力學(xué)比較,A.電流圖 B.激活時(shí)間常數(shù) C.激活曲線,HCN2/HCN4與單個(gè)亞型通道動(dòng)力學(xué)比較,A.電流圖 B.激活時(shí)間常數(shù) C.激活曲線,結(jié) 論,HCN1、2和4共表達(dá)后均可形成復(fù)合體電流 HCN2/4以1:1比例共表達(dá)所形成的復(fù)合體電流幅度最大，激活速度最快,HCN2/HCN4通道復(fù)合體轉(zhuǎn)染ASCs,實(shí)驗(yàn)流程,共聚焦照相,共轉(zhuǎn)染HCN2/4通道,通道m(xù)RNA表達(dá)水平,通道蛋白表達(dá)水平,封接帶熒光的ASCs細(xì)胞,200,膜片鉗記錄HCN電流,通道動(dòng)力學(xué)研究,激活常數(shù),激活曲線,結(jié) 論,HCN2及HCN4通道可分布在ASCs細(xì)胞膜的共同區(qū)域 兩者共表達(dá)存在促進(jìn)作用 HCN2/HCN4通道復(fù)合體表達(dá)在ASCs上與表達(dá)在爪蟾卵母細(xì)胞上的電生理學(xué)特性一致 較單一亞型具有更快的激活動(dòng)力學(xué)特性,胺碘酮對(duì)HCN通道的作用及機(jī)制,胺碘酮對(duì)HCN