生物的蛋白質的分離、純化和表征全過程

1、生物的蛋白質的分離、純化和表征全 過程 蛋白質含有酸蛋白質含有酸/ /堿堿AAAA殘基具有兩性殘基具有兩性 堿堿/ /酸越大酸越大pI pI 越大越大 pI通常在通常在 6.0 左右左右 一、蛋白質的兩性電離及等電點 生物的蛋白質的分離、純化和表征全 過程 蛋白質的分子量蛋白質的分子量 一般在一萬至一百萬道爾頓之間一般在一萬至一百萬道爾頓之間 1道爾頓道爾頓1C12絕對質量絕對質量/12 1.6610-27千克千克 二、蛋白質分子的大小 生物的蛋白質的分離、純化和表征全 過程 （一）根據(jù)化學組成測定最小分子量（一）根據(jù)化學組成測定最小分子量 1 1、測定蛋白質中某一微量元素的含量、測定蛋白質中

2、某一微量元素的含量 2 2、假設蛋白質中僅含一個鐵原子、假設蛋白質中僅含一個鐵原子 最低相對分子質量最低相對分子質量= 100* 55.8/鐵的百分含量鐵的百分含量 生物的蛋白質的分離、純化和表征全 過程 （二）（二）SDSPAGEPAGE測定相對分子質量測定相對分子質量 蛋白質顆粒電泳時遷移率取決于：蛋白質顆粒電泳時遷移率取決于： w所帶電荷所帶電荷 w分子量分子量 w分子形狀分子形狀 生物的蛋白質的分離、純化和表征全 過程 生物的蛋白質的分離、純化和表征全 過程 十二烷基磺酸鈉十二烷基磺酸鈉 原態(tài)蛋白質變性 ？ 磺酸基磺酸基 極性親水極性親水 烷基烷基 親油（蛋白質疏水區(qū)）親油（蛋白質疏水

3、區(qū)） 遷移率與電荷和形狀無關，僅取決于相對分子質量遷移率與電荷和形狀無關，僅取決于相對分子質量 巰基乙醇破壞二硫鍵 生物的蛋白質的分離、純化和表征全 過程 生物的蛋白質的分離、純化和表征全 過程 生物的蛋白質的分離、純化和表征全 過程 生物的蛋白質的分離、純化和表征全 過程 （三）凝膠過濾法測定相對分子質量（三）凝膠過濾法測定相對分子質量 生物的蛋白質的分離、純化和表征全 過程 蛋白質混合樣蛋白質混合樣 w凝凝膠法只適于球狀蛋白分子測量凝凝膠法只適于球狀蛋白分子測量 生物的蛋白質的分離、純化和表征全 過程 三、蛋白質的膠體性質與蛋白質的沉淀 （一）膠體性質（一）膠體性質（colloidal s

4、ystem） 膠體溶液的特點：膠體溶液的特點： w分子直徑在分子直徑在1-100 nm1-100 nm內內 w溶于水溶于水 w不易聚集沉淀不易聚集沉淀 大多數(shù)球狀蛋白能形成穩(wěn)定的親水膠體溶液大多數(shù)球狀蛋白能形成穩(wěn)定的親水膠體溶液 生物的蛋白質的分離、純化和表征全 過程 蛋白質膠體溶液的穩(wěn)定因素：蛋白質膠體溶液的穩(wěn)定因素： 1.1.同種蛋白帶同種電荷，相互排斥同種蛋白帶同種電荷，相互排斥 2.2.水膜彈性水膜彈性 w蛋白質溶液具有丁達爾效應、布朗蛋白質溶液具有丁達爾效應、布朗 運動以及不能通過半透膜等性質運動以及不能通過半透膜等性質 生物的蛋白質的分離、純化和表征全 過程 （二）蛋白質的（二）蛋

5、白質的沉淀沉淀 Pr從膠體溶液中析出從膠體溶液中析出 可逆沉淀：可逆沉淀： 溫和條件，改變溶液溫和條件，改變溶液pH或或Pr所所帶電荷帶電荷 Pr結構和性質沒有變化結構和性質沒有變化 適當條件下可重新溶解適當條件下可重新溶解 非變性沉淀非變性沉淀 pI沉淀法、鹽析法和有機溶劑沉淀法等沉淀法、鹽析法和有機溶劑沉淀法等 生物的蛋白質的分離、純化和表征全 過程 不可逆沉淀不可逆沉淀 強烈沉淀條件強烈沉淀條件 破壞破壞Pr膠體溶液穩(wěn)定性膠體溶液穩(wěn)定性 也破壞也破壞Pr結構和性質結構和性質 沉淀不能再重新溶解沉淀不能再重新溶解 變性沉淀變性沉淀 如加熱沉淀、強酸如加熱沉淀、強酸/ /堿沉淀、重金屬鹽堿沉

6、淀、重金屬鹽 和生物堿沉淀等和生物堿沉淀等 生物的蛋白質的分離、純化和表征全 過程 1.1.鹽析法鹽析法 加入中性鹽脫去蛋白質的水化層，加入中性鹽脫去蛋白質的水化層， 鹽析一般不引起變性鹽析一般不引起變性 生物的蛋白質的分離、純化和表征全 過程 等電點沉淀的蛋白質溶液中加入等電點沉淀的蛋白質溶液中加入NaCl后沉后沉 淀溶解淀溶解鹽溶鹽溶 原因？原因？ 鹽溶鹽溶鹽析鹽析 分子在等電點時，相互吸引，聚合沉淀，分子在等電點時，相互吸引，聚合沉淀，加入少加入少 量鹽離子量鹽離子后破壞了這種吸引力，使分子分散，溶后破壞了這種吸引力，使分子分散，溶 于水中于水中 鹽溶 生物的蛋白質的分離、純化和表征全

7、過程 鹽析 向蛋白質溶液中加入大量硫酸銨后蛋白質向蛋白質溶液中加入大量硫酸銨后蛋白質 會沉淀析出會沉淀析出 原因？原因？ 蛋白質脫去水化層而聚集沉淀 鹽析（NH4）2SO4） 生物的蛋白質的分離、純化和表征全 過程 2.2.有機溶劑沉淀有機溶劑沉淀 脫去水化層以及降低介電常數(shù)而增脫去水化層以及降低介電常數(shù)而增 加帶電質點間的相互作用加帶電質點間的相互作用 3.3.等電點沉淀等電點沉淀 生物的蛋白質的分離、純化和表征全 過程 4.4.重金屬鹽沉淀重金屬鹽沉淀 與帶負電荷蛋白質結成不溶性鹽與帶負電荷蛋白質結成不溶性鹽 5.5.生物堿試劑和某些酸類沉淀生物堿試劑和某些酸類沉淀 與帶正電荷蛋白質生成不

8、溶性鹽與帶正電荷蛋白質生成不溶性鹽 6.6.加熱變性沉淀加熱變性沉淀 天然結構解體，疏水基外露，天然結構解體，疏水基外露， 破壞水化層及帶電狀態(tài)破壞水化層及帶電狀態(tài) 生物的蛋白質的分離、純化和表征全 過程 四、蛋白質分離純化的一般原則 總目標：增加制品純度或比活總目標：增加制品純度或比活 1.1.前處理：因動前處理：因動/ /植物植物/ /細菌而異細菌而異 2.2.粗分級分離：采用鹽析粗分級分離：采用鹽析/ /等電點沉淀等電點沉淀/ /有有 機溶劑分級分離等方法機溶劑分級分離等方法 3.3.細分級分離：采用凝膠過濾、離子交換細分級分離：采用凝膠過濾、離子交換 層析、吸附層析以及親和層析等層析、

9、吸附層析以及親和層析等 4.4.結晶結晶 生物的蛋白質的分離、純化和表征全 過程 五、蛋白質的分離純化方法 （一）根據(jù)分子大小不同的純化方法根據(jù)分子大小不同的純化方法 1、透析和超過濾、透析和超過濾 w利用蛋白質分子不能透過半透膜將其利用蛋白質分子不能透過半透膜將其 與小分子物質分開與小分子物質分開 w半透膜為玻璃紙或纖維素材料半透膜為玻璃紙或纖維素材料 生物的蛋白質的分離、純化和表征全 過程 血液透析血液透析 小分子溶出 小分子被帶出小分子被帶出 透析機透析機 透析液透析液 加加 壓壓 血液血液 生物的蛋白質的分離、純化和表征全 過程 2 2、密度梯度（區(qū)帶）離心、密度梯度（區(qū)帶）離心 60

10、00080000轉/分 重力60萬80萬倍 生物的蛋白質的分離、純化和表征全 過程 3、凝膠過濾、凝膠過濾 生物的蛋白質的分離、純化和表征全 過程 （二）利用溶解度差別的純化方法（二）利用溶解度差別的純化方法 1. 1.等電點沉淀等電點沉淀 調整溶液調整溶液pH 不同蛋白在各自不同蛋白在各自 pI處依次沉淀處依次沉淀 2.2.鹽溶和鹽析鹽溶和鹽析 3.3.有機溶劑分級分離法有機溶劑分級分離法 w降低介電常數(shù)降低介電常數(shù) w爭奪水化膜爭奪水化膜 生物的蛋白質的分離、純化和表征全 過程 （三（三) )根據(jù)電荷不同的分離方法根據(jù)電荷不同的分離方法電泳電泳 原理：原理： 蛋白質在非等電點時所帶總電荷不為蛋白質在非等電點時所帶總電荷不為0 0 分子大小不同，電場中移動速度也不同分子大小不同，電場中移動速度也不同 生物的蛋白質的分離、純化和表征全 過程 等電聚焦電泳等電聚焦電泳 生物的蛋白質的分離、純化和表征全 過程 雙向電泳雙向電泳 生物的蛋白質的分離、純化和表征全 過程 離子交換層析離子交換層析 生物的蛋白質的分離、純化和表征全 過程 （四）利用蛋白質選擇性吸附的性質（四）利用蛋白質選擇