基因工程實驗_biochemlab[優(yōu)制材料]

1、基因工程實驗基因工程實驗 1行業(yè)材料 實驗?zāi)夸?實驗一 實驗計劃表 實驗二 染色體DNA的提取 實驗三 PCR擴增 實驗四 凝膠電泳法回收目的DNA及其體外連接 實驗五 感受態(tài)細胞的制備 實驗六 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化 實驗七 質(zhì)粒的提取 實驗八 重組質(zhì)粒的酶切鑒定 2行業(yè)材料 實驗一 實驗計劃表 、了解本學(xué)期整體的實驗流程及安排。、了解本學(xué)期整體的實驗流程及安排。 、熟練使用微量移液器。、熟練使用微量移液器。 、學(xué)習制備瓊脂糖凝膠。、學(xué)習制備瓊脂糖凝膠。 3行業(yè)材料 v 基因工程（Gene Engineering）又稱重組技術(shù)，把不 同生物的與載體相連，并導(dǎo)入到受體細胞中去增殖、表 達。 v 基因工

2、程包括切、接、轉(zhuǎn)、增、檢五大要素。 4行業(yè)材料 凝膠電泳系統(tǒng)、微量移液器、三角瓶、微波爐、鏟子、 手套 瓊脂糖、1TBE、加樣緩沖液 5行業(yè)材料 目的基因的獲取 基因組總提取凝膠電泳檢測 擴增目的基因 產(chǎn)物的電泳檢測 產(chǎn)物純化獲得目的基因 1.本學(xué)期實驗計劃 6行業(yè)材料 重組、轉(zhuǎn)化 與pMD18-T連接DH5a感受態(tài)細胞制備 轉(zhuǎn)化、平板涂布、培養(yǎng) 篩選與鑒定 抗生素抗性篩選挑單菌落培養(yǎng)提取質(zhì)粒質(zhì) 粒酶切、電泳檢測 7行業(yè)材料 2.微量移液器的使用 將微量移液器按鈕輕輕壓在第一擋 垂直握持微量移液器，使吸頭浸入頁面下幾毫米，千萬別將吸頭 直接插到液體底部 緩慢、平穩(wěn)地松開控制按鈕，吸上樣品液。否

3、則液體進入吸頭太 快，導(dǎo)致液體倒吸入移液槍內(nèi)部，或吸入體積減少。 等1s后將吸頭提高液面，并使吸頭在容器壁擦過 平穩(wěn)把按鈕壓到第一停點，在把按鈕壓到第二停點以排出剩余液 體、 提起微量移液器，使吸頭在容器壁擦過 然后按吸頭彈射器除去吸頭 使用操作 8行業(yè)材料 使用注意事項 未裝吸頭的微量移液器絕對不可用來吸取任何液體。 一定要再允許范圍內(nèi)設(shè)定容量，千萬不要將讀數(shù)的調(diào) 節(jié)超出其適用的刻度范圍，否則會造成損壞。 不要橫放帶有殘留液體吸頭的移液器 不要用大量程的移液器移取小體積樣品 微量移液器每日用完后，應(yīng)旋轉(zhuǎn)到最大刻度，讓彈簧 恢復(fù)原形，保持彈性。 為了確保微量移液器的準確性，移液器必須定期進行

4、校準。 9行業(yè)材料 3. 瓊脂糖凝膠制作 選擇好膠盒、膠板和梳子，洗凈，把膠板放入膠盒中， 梳子插上。 量取25ml 1TBE溶液放入錐形瓶或燒杯中 稱量0.25g 瓊脂糖，倒入錐形瓶中 將錐形瓶放入微波爐中，讓溶液沸騰2-3次，瓊脂糖徹 底融化 錐形瓶取出，稍稍冷卻后倒入膠盒中 等待瓊脂糖冷卻凝固形成點樣孔后即可 10行業(yè)材料 掌握酚氯仿法提取的原理和操作。掌握酚氯仿法提取的原理和操作。 11行業(yè)材料 生物的大部分或幾乎全部都集中在細胞核或類 核中。DNA在體內(nèi)通常都與蛋白質(zhì)結(jié)合，蛋白質(zhì)對 DNA制品的污染常影響到以后的DNA操作過程，因此 需把蛋白質(zhì)除去，一般采用酚氯仿抽提法。苯酚、氯 仿

5、對蛋白質(zhì)有極強的變性作用，而對DNA無影響。經(jīng) 苯酚、氯仿抽提后，蛋白質(zhì)變性而被離心沉降到酚相 與水相的界面，DNA則留在水相，少量的或與DNA緊 密結(jié)合的蛋白質(zhì)可用蛋白酶予以去除。DNA制品中少 量的RNA無影響，必要時可加入不含DNase的 RNase去除RNA污染。 12行業(yè)材料 消化緩沖液: TE 、EDTA、 NaCl、 SDS、蛋白酶K Tris平衡酚、氯仿:異戊醇(24:1)，NaAc，無水乙醇， 70%乙醇 微量移液器、高速離心機、1.5ml管、吸頭、烘箱、 水浴鍋、1.5ml管架、膠頭滴管、冰箱 13行業(yè)材料 、切取組織 ，剪碎放入研缽(越細越好)，磨成粉末。 以消化緩沖液處

6、理55水浴過夜，獲得組織消化液。 、取出消化組織液，5000rpm ，min，取上清液 于新離心管 。 、 加等體積ris-平衡酚，輕輕混勻min。 4、1000rpm，10min，留上清，取上清液于新離心 管 。 、加等體積酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)抽提，輕輕混 勻min。 、同。 、加等體積氯仿:異戊醇，輕輕混勻min。 、同。 14行業(yè)材料 、加 1/10 體積3mol/L NaAc，及. 倍體 積預(yù)冷（）無水乙醇，混勻。 沉淀min。 、12000rpm，15min，棄上清。 、加70%乙醇1ml，混勻。 、 同。 、管放置于烘箱中烘干。 、加ul TE或ddH2O溶解。 、瓊

7、脂糖凝膠電泳檢測。 15行業(yè)材料 提取染色體的基本原理是什么？操作中 應(yīng)該注意什么？ 16行業(yè)材料 、學(xué)習擴增的基本原理。、學(xué)習擴增的基本原理。 、掌握技術(shù)的常規(guī)操作。、掌握技術(shù)的常規(guī)操作。 、了解擴增的參數(shù)設(shè)計。、了解擴增的參數(shù)設(shè)計。 實驗三實驗三擴增擴增 17行業(yè)材料 、聚合酶鏈反應(yīng) (Polymerase chain reaction， PCR)：利用核酸變、復(fù)性的性質(zhì)，以待擴增的 為模板，在體外由引物介導(dǎo)的酶促合成特異片 段的過程。 、反應(yīng)體系 引物、dNTP、 Mg 、模板、 Taq DNA聚合酶， Buffer。 18行業(yè)材料 、循環(huán)參數(shù) 9 5min 9 30s 5 30s 72

8、 30s goto times 72 10min 19行業(yè)材料 Taq DNA聚合酶，PCR緩沖液， MgCl2，dNTP，引物，模板， ddH2O，TBE電泳緩沖液，EB,加樣緩沖液 旋渦混合器，微量移液取樣器，移液器吸頭， 0.2ml PCR微量離心管，PCR儀，臺式離心機， 瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)，紫外凝膠成像系統(tǒng) 20行業(yè)材料 、在0.2ml PCR 微量離心管中配制30ul反應(yīng)體系。 dd water 20.5ul 10PCR buffer（不含MgCl2） 3ul 25mM MgCl2 2ul 10mmol/L dNTP 1ul 10mol/L Primer 1 1ul 10mol/L

9、 primer 2 1ul 模板 1ul Taq酶 0.5ul 總體積 30ul 21行業(yè)材料 、在離心機中混勻。 、管放入儀中，按照原理中的條件設(shè)置程 序，進行反應(yīng)。 、PCR結(jié)束后，取3ul PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳 檢測。 22行業(yè)材料 PCR中產(chǎn)生非特異性條帶的原因可能有哪些？ 23行業(yè)材料 實驗四 凝膠電泳法回收目的 DNA及其體外連接 24行業(yè)材料 1. 學(xué)習和掌握從瓊脂糖凝膠中回收DNA片段的方法。 2. 掌握DNA體外連接的方法。 25行業(yè)材料 1.DNA分子在瓊脂糖凝膠中的電泳速率與以下因素有 關(guān) DNA分子大小 DNA分子構(gòu)象 瓊脂糖凝膠濃度 電泳所用電壓 電泳緩沖液

10、26行業(yè)材料 2. 利用硅膠膜在高鹽濃度時能特異性吸附DNA，而在低 鹽濃度時可使DNA被洗脫的原理純化DNA。 3. Taq酶參與PCR反應(yīng)中，產(chǎn)物雙鏈核酸中的3端各多 連接一個脫氧腺苷酸A，與商業(yè)開發(fā)的pMD18-T載體 可在DNA連接酶作用下，按照堿基配對形成環(huán)狀的完 整質(zhì)粒。 27行業(yè)材料 凝膠電泳系統(tǒng)，刀片，紫外儀，酒精燈 1.5ml EP管，1.5ml EP管架，65 水浴鍋 PCR產(chǎn)物，1TBE，加樣緩沖液，TakaRa膠回收試 劑盒，TA克隆試劑盒，DL2000 marker 28行業(yè)材料 1. 2%瓊脂糖凝膠電泳 2. 在紫外燈下用干凈的手術(shù)刀割下含有目的DNA瓊脂糖塊 裝在

11、1.5ml的EP管中稱量減1克即為凝膠塊重量 3. 加入5個凝膠體積量的DR- Buffer 4. 混勻 65加熱融化凝膠塊 5. 加入DR-Buffer量的1/2 體積的DR- Buffer, 當目 的片段小于400bp再加入終濃度為20% 的異丙醇 6. 將上述溶液short后轉(zhuǎn)移至spin coloumn中12000rpm, 1min 棄濾液 7. 加入500ul RinseA 12000rpm 30s 棄濾液 8. 加入700ul RinseB 12000rpm 30s棄濾液 9. 同8 29行業(yè)材料 10. 將spin coloumn安置于新的1.5ml EP管中 在spin col

12、oumn膜中央加25ulElution Buffer 放入烘箱1min 12000rpm 1min 保存1.5ml EP管1%膠檢測 11. 鏈接反應(yīng)（冰上操作） 在一支0.2 ml EP管中加入以下試劑： 純化的目的DNA片段 4.5ul Vector 0.5ul 連接液 5ul 混勻 16連接過夜 30行業(yè)材料 為什么連接反應(yīng)的溫度要定在16度？ 31行業(yè)材料 實驗五 感受態(tài)細胞的制備 1.掌握感受態(tài)細胞的制備方法 2. 學(xué)習和理解影響細胞感受態(tài)的因素 32行業(yè)材料 感受態(tài)是指受體（或者宿主）細胞最易接受外源 DNA片段并實現(xiàn)其轉(zhuǎn)化的一種生理狀態(tài)，它是有受體菌 的遺傳性所決定的。轉(zhuǎn)化過程中

13、所用的受體細胞一般 是限制修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，既不含限制性內(nèi)切 酶和甲基化酶的突變株。用Cacl2處理受體細胞，使細 胞的通透性發(fā)生了暫時性的改變，成為能允許外源DNA 分子進入的感受態(tài)細胞。 33行業(yè)材料 培養(yǎng)皿，離心管，冷凍高速離心機，超低溫冰箱，搖 床，錐形瓶 Cacl2， LB Amp-液體培養(yǎng)基， LB Amp-固體培養(yǎng)基， DH5甘油菌 34行業(yè)材料 1.先從保存菌種DH52(-70),劃線培16h(37) 2.從平板中挑取一個單菌落移到4ml，LB Amp- 培養(yǎng)基中，37搖蕩過夜180250rpm 3.按1%的接種量將過夜培養(yǎng)的菌轉(zhuǎn)接于50ml LB Amp-的培養(yǎng) 基中，3

14、7，250rpm（2h2.5h） 4.當培養(yǎng)菌生長至OD600達0.50.6時（約22.5h），將培養(yǎng) 菌取出，在無菌條件下將細菌轉(zhuǎn)移至50ml無菌聚乙烯離心 管中，冰浴10min，以使培養(yǎng)液冷至0 35行業(yè)材料 5.4，5000rpm/min,7min 6.細胞沉淀用10ml冰冷的Cacl2溶液重懸于4，5000rpm/min， 5min 7.細胞沉淀用10ml冰冷的Cacl2溶液重懸冰上放置30min， 于 4，5000rpm/min，5min 8.用2ml冰冷Cacl2溶液重懸各管細胞，然后按每管100ul的量 分裝于預(yù)冷的0.5ml EP管中存于-70 36行業(yè)材料 如果實驗對照組本不

15、該長菌落的平板上長出了一些菌 落，你將如何解釋這種想象？ 37行業(yè)材料 實驗六 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化 掌握重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化方法 38行業(yè)材料 1.轉(zhuǎn)化是將外源DNA 分子引入受體細胞，使之獲得新的 遺傳性狀的一種手段。 2.化學(xué)轉(zhuǎn)化法 利用Cacl2處理感受態(tài)受體細胞，然后通過熱休克 處理，即置于42高溫熱激90s，熱休克后，是受體菌 在不含抗生素的培養(yǎng)液中生長至少半小時以上，使其 表達足夠蛋白質(zhì)，以便能在含抗生素的平板上生長菌 落。 39行業(yè)材料 水浴鍋，培養(yǎng)箱，槍頭，冰盒，超凈臺，微量加樣器， 制冰機，牙簽 DH5感受態(tài)細胞，連接產(chǎn)物，LB Amp-液體培養(yǎng)基， LB Amp+液體培養(yǎng)基，LB A

16、mp+ 培養(yǎng)基平板 40行業(yè)材料 1.5ul連接液加100ul感受態(tài)細胞（-70取出），置冰上，加后輕輕旋動 2.冰上靜置30min 3.42水浴90s熱休克，冰上3min 4.加10ul LB （Amp-）至菌液，混勻（顛倒） 5.37烘箱30min 6.37，搖床 30min 180rpm 7.涂平板 100ul/板， 37培養(yǎng)1216h 8.挑克隆 挑取菌落接入5ml LB Amp+液體培養(yǎng)基中，37 振蕩過夜 41行業(yè)材料 當質(zhì)粒加入宿主細胞進行轉(zhuǎn)化，再涂布在含有Amp的LB 培養(yǎng)基平板前，為什么要在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)1h? 42行業(yè)材料 實驗七 質(zhì)粒的提取 1.學(xué)習質(zhì)粒DNA提取的基本

17、原理 2.掌握質(zhì)粒最常用提取方法 43行業(yè)材料 細菌質(zhì)粒DNA的提取是根據(jù)環(huán)狀質(zhì)粒DNA分子具有相對 分子質(zhì)量較小、易于復(fù)性的特點進行的，堿法是常用 的提取方法。在熱或堿性條件下DNA分子雙鏈解開，若 此時將溶液置于復(fù)性條件，由于變性的質(zhì)粒分子能在 較短的時間內(nèi)復(fù)性而染色體DNA不能復(fù)性，從而分離質(zhì) 粒DNA。 44行業(yè)材料 高速離心機、微量移液器、槍頭、凝膠電泳系統(tǒng)，凝膠 紫外成像系統(tǒng)，EP管 EB，加樣緩沖液，陽性克隆的培養(yǎng)液，質(zhì)粒提取試劑盒 45行業(yè)材料 1. 取14ml過夜培養(yǎng)的陽性克隆菌液，12000rpm離心 2min,棄上清 2.用250ul的solution(含RNaseA1)

18、充分懸浮細菌沉淀 3.加入250ul的solution輕輕上下翻轉(zhuǎn)混合56次使菌 體充分裂解，形成透明溶液 4.加入400ul的4 預(yù)冷的solution，輕輕上下翻轉(zhuǎn)混 合56次，直至形成緊實凝集塊，室溫靜置2min 46行業(yè)材料 5.室溫12000rpm， 10min，取上清 6.將試劑盒中的Spin column安置于collection Tube上 7.將操作6中的上清液轉(zhuǎn)移至Spin column中12000rpm， 1min，棄濾液 8.將500ul的RinseA加入Spin column中， 12000rpm，30s， 棄濾液 9.加700ul的RinseB加入Spin colu

19、mn中， 12000rpm，30s， 棄濾液 10.同9 47行業(yè)材料 11.將Spin column安置于新的1.5ml離心管上,在Spin column膜中央處加入60ul滅菌或Elution Buffer,室溫 靜置1min 12. 12000rpm， 1min洗脫DNA 13.凝膠電泳檢測提取效果，并以空載體做對照，從質(zhì)粒 大小上初步判斷是否有外源基因進入載體 48行業(yè)材料 在堿法提取質(zhì)粒DNA操作過程中應(yīng)該注意哪些問題？ 49行業(yè)材料 實驗八 重組質(zhì)粒的酶切鑒定 1.學(xué)習和掌握限制性內(nèi)切酶的特性 2.了解重組質(zhì)粒的鑒定方法，重點掌握重組質(zhì) 粒的酶切鑒定方法 50行業(yè)材料 1.限制性核酸內(nèi)切酶：是一類能識別雙鏈DNA分子特異性 核酸