中國藥科大學藥物分析課件第十三章A

1、中國藥科大學藥物分析課件第十三 章A 第十三章第十三章 生化藥物和基因工程藥物生化藥物和基因工程藥物 分析概念分析概念 基本要求基本要求 概述概述 質量檢驗的基本程質量檢驗的基本程 序與方法序與方法 常用定量分析方法常用定量分析方法 及其應用及其應用 練習與思考練習與思考 中國藥科大學藥物分析課件第十三 章A 基本要求基本要求 1 1掌握本類藥物質量檢驗的基本程序與掌握本類藥物質量檢驗的基本程序與 方法類型。方法類型。 2 2掌握掌握HPLCHPLC法和酶活力測定法在本類藥法和酶活力測定法在本類藥 物測定中的應用。物測定中的應用。 3 3熟悉本類藥物的范圍、種類、質量控熟悉本類藥物的范圍、種類

2、、質量控 制的要點。制的要點。 4 4了解本類藥物含量測定的其他方法。了解本類藥物含量測定的其他方法。 中國藥科大學藥物分析課件第十三 章A 一、防病、治一、防病、治 病的三大藥源病的三大藥源 第一節(jié)第一節(jié) 概概 述述 biopharmaceutics or biopharmaceuticals biochemical drugs biotechnology drugs biological products 藥藥物物 化化學學藥藥物物 生生物物藥藥物物 中中藥藥 生生化化藥藥物物 生生物物技技術術藥藥物物 生生物物制制品品 中國藥科大學藥物分析課件第十三 章A 1 1生化藥物：生化藥物： 例

3、：氨基酸、多肽、蛋白質、酶等。例：氨基酸、多肽、蛋白質、酶等。 動動物物 植植物物 微微生生物物 提提取取 現現代代生生物物技技術術 生生命命基基本本物物質質及及 衍衍生生物物 降降解解物物 大大分分子子的的結結構構修修飾飾物物 生生物物- -化化學學半半合合成成 中國藥科大學藥物分析課件第十三 章A 2. 2. 基因工程藥物基因工程藥物： 以以DNADNA重組技術生產的蛋白質、多肽、重組技術生產的蛋白質、多肽、 酶、激素、疫苗、單克隆抗體和細胞生長酶、激素、疫苗、單克隆抗體和細胞生長 因子類藥物。因子類藥物。 中國藥科大學藥物分析課件第十三 章A DNADNA重組技術（基因工程）：生產過程為

4、重組技術（基因工程）：生產過程為 天然基因天然基因 合成的核合成的核 苷酸序列苷酸序列 內切酶內切酶 連接酶連接酶 載載 體體 重組重組 的遺的遺 傳物傳物 質質 轉轉 移移 到到 宿主宿主 細胞細胞 增殖、表達增殖、表達 分離純化分離純化目的目的 產物產物 中國藥科大學藥物分析課件第十三 章A 二、種類二、種類 氨基酸、多肽與蛋白質類氨基酸、多肽與蛋白質類 酶類與輔酶類酶類與輔酶類 多糖類多糖類 脂質類脂質類 核酸及其降解物和衍生物核酸及其降解物和衍生物 類藥物類藥物 1 1生化藥物生化藥物 中國藥科大學藥物分析課件第十三 章A 2 2基因工程藥物的種類基因工程藥物的種類 1 1）激素類及神

5、經遞質類藥物：）激素類及神經遞質類藥物： 人生長激素釋放抑制因子、人胰島人生長激素釋放抑制因子、人胰島 素、人生長激素素、人生長激素 2 2）細胞因子類藥物：）細胞因子類藥物： 人干擾素人白細胞介素、集落刺激人干擾素人白細胞介素、集落刺激 因子、促紅細胞生成素因子、促紅細胞生成素 3 3）酶類及凝血因子類藥物）酶類及凝血因子類藥物 中國藥科大學藥物分析課件第十三 章A 三、特點三、特點 1. 1. 生物體的基本生化成分生物體的基本生化成分 2. 2. 分子量大分子量大: : 分子量測定分子量測定 3. 3. 結構難確證結構難確證 4. 4. 全過程的質量控制：原料、生產過程、全過程的質量控制：

6、原料、生產過程、 最終產品最終產品 5. 5. 生物活性檢查生物活性檢查 中國藥科大學藥物分析課件第十三 章A 6. 6. 安全性檢查安全性檢查 7. 7. 效價（含量）測定：效價（含量）測定： 理化法：有效成分的含量理化法：有效成分的含量 效價測定和酶活力測定：有效成分效價測定和酶活力測定：有效成分 的生物活性的生物活性 中國藥科大學藥物分析課件第十三 章A 生化藥物和基因藥物質量控制的項目：生化藥物和基因藥物質量控制的項目： 來源與種類來源與種類 純度純度 性狀性狀 干燥失重或水分干燥失重或水分 鑒別鑒別 熾灼殘渣熾灼殘渣 氨酸組分分析氨酸組分分析 生物活性生物活性 肽圖肽圖 熱源試驗熱源

7、試驗 糖含量糖含量 含量分析含量分析 第二節(jié)第二節(jié) 質量檢驗的基本程序與方法質量檢驗的基本程序與方法 中國藥科大學藥物分析課件第十三 章A 一、鑒別一、鑒別 理化鑒別法：化學鑒別法理化鑒別法：化學鑒別法 紫外分光光度法紫外分光光度法 HPLCHPLC法法 生化鑒別法：酶法生化鑒別法：酶法 電泳法電泳法 等電聚焦法等電聚焦法 生物鑒別法：家兔驚厥試驗生物鑒別法：家兔驚厥試驗 中國藥科大學藥物分析課件第十三 章A （一）理化鑒別法一）理化鑒別法 1.1.化學鑒別法：化學鑒別法： 例：溶菌酶例：溶菌酶 - CONH- +Cu- CONH- +Cu2+ 2+ 絡合顯色 絡合顯色 藥藥物物 + + 試試

8、劑劑現現象象 顏顏色色 沉沉淀淀 中國藥科大學藥物分析課件第十三 章A 2.2.紫外分光光度法紫外分光光度法 溶劑：溶劑：0.01mol/L0.01mol/L鹽酸鹽酸 例：三磷酸腺苷二鈉例：三磷酸腺苷二鈉 濃度：濃度：20g/ml20g/ml 判斷：判斷： max max： ：2572571nm1nm A A250 250/A /A260 260： ：0.170.170.270.27。 3. HPLC3. HPLC法：法： 利用對照品溶液和供試品溶液色譜圖的保留利用對照品溶液和供試品溶液色譜圖的保留 時間和肽圖譜的一致性進行鑒別。時間和肽圖譜的一致性進行鑒別。 中國藥科大學藥物分析課件第十三

9、章A 4. 4.酶法：酶法： 例：尿激酶的鑒別例：尿激酶的鑒別-氣泡上升法氣泡上升法 原理：原理： 牛牛 纖纖 維維 蛋蛋 白白 原原 牛牛 凝凝 血血 酶酶 蛋蛋 白白 結結 塊塊 尿尿 激激 酶酶 牛牛 纖纖 維維 蛋蛋 白白 溶溶 酶酶 原原 結結 塊塊 溶溶 解解 ： ：氣 氣 泡泡 上上 升升 中國藥科大學藥物分析課件第十三 章A 方法：方法： 取小試管，加入尿激酶巴比妥溶液、牛纖取小試管，加入尿激酶巴比妥溶液、牛纖 維蛋白原溶液，再依次加入牛纖維蛋白溶酶原維蛋白原溶液，再依次加入牛纖維蛋白溶酶原 溶液、牛凝血酶溶液，迅速搖勻，立即置溶液、牛凝血酶溶液，迅速搖勻，立即置 37370.

10、50.5恒溫水浴保溫，記時。反應系統(tǒng)在恒溫水浴保溫，記時。反應系統(tǒng)在 30304040秒內凝結，凝結塊內有氣泡生成，秒內凝結，凝結塊內有氣泡生成，1515分分 鐘內凝結塊溶解，當凝結塊溶解時，氣泡逐漸鐘內凝結塊溶解，當凝結塊溶解時，氣泡逐漸 上升。以上升。以0.9%0.9%氯化鈉作空白，同法氯化鈉作空白，同法 操作，凝結操作，凝結 塊在塊在2 2小時內不溶。小時內不溶。 中國藥科大學藥物分析課件第十三 章A 5. 5. 電泳法：以肝素鑒別為例。電泳法：以肝素鑒別為例。 O O O O O OH COO- OSO3- HNSO3- CH2OSO3- 與國家肝素標準品對照，其移動位置相應。與國家肝

11、素標準品對照，其移動位置相應。 中國藥科大學藥物分析課件第十三 章A 6. 6. 生物法：生物法： 利用生物體進行試驗來鑒別藥物。利用生物體進行試驗來鑒別藥物。 例：家兔驚厥試驗鑒別胰島素。例：家兔驚厥試驗鑒別胰島素。 利用胰島素的降糖作用。給家兔大利用胰島素的降糖作用。給家兔大 劑量注射胰島素，家兔驚厥，迅速靜注劑量注射胰島素，家兔驚厥，迅速靜注 50%GS50%GS，驚厥停止。，驚厥停止。 中國藥科大學藥物分析課件第十三 章A （二）雜質檢查二）雜質檢查 一般雜質檢查一般雜質檢查 特殊雜質檢查：原料藥純度分析特殊雜質檢查：原料藥純度分析 生產過程中雜質的檢查生產過程中雜質的檢查 1. 1.

12、 原料藥純度分析原料藥純度分析： 多糖類多糖類-低聚糖、核酸、蛋白質低聚糖、核酸、蛋白質 酶類藥物酶類藥物-酶催化反應基本產物的分析，酶催化反應基本產物的分析， 具有一定活性的其他有關酶的檢查。具有一定活性的其他有關酶的檢查。 中國藥科大學藥物分析課件第十三 章A 例：胰蛋白酶中糜蛋白酶的檢查例：胰蛋白酶中糜蛋白酶的檢查 選用選用N-N-乙酰乙酰-L-L-酪氨酸乙酯作底物進行糜蛋酪氨酸乙酯作底物進行糜蛋 白酶的限度檢查。糜蛋白酶的限度為白酶的限度檢查。糜蛋白酶的限度為25002500個胰個胰 蛋白酶單位中不得大于蛋白酶單位中不得大于5050單位，按每單位，按每1mg1mg胰蛋白胰蛋白 酶為酶為

13、25002500個單位和每個單位和每1mg1mg糜蛋白酶為糜蛋白酶為10001000單位，單位， 折算成重量，則糜蛋白酶的限度為折算成重量，則糜蛋白酶的限度為5%5%（g/gg/g）。）。 1:1000=x:50 x=0.051:1000=x:50 x=0.05（mgmg） L=0.05/1=5% L=0.05/1=5% 2. 2. 生產過程中雜質的檢查生產過程中雜質的檢查 中國藥科大學藥物分析課件第十三 章A （三）安全性試驗（三）安全性試驗 熱源試驗熱源試驗 異常毒性試驗異常毒性試驗 : :急性毒性物質急性毒性物質 過敏試驗：異性蛋白過敏試驗：異性蛋白 降壓物質試驗：導致血壓降低的雜質、組

14、降壓物質試驗：導致血壓降低的雜質、組 胺、類組胺胺、類組胺 中國藥科大學藥物分析課件第十三 章A 無菌試驗：活菌無菌試驗：活菌 基因工程藥物中可能雜質與污染物檢查基因工程藥物中可能雜質與污染物檢查 來源于宿主細胞的殘留來源于宿主細胞的殘留DNADNA，外源性雜質，外源性雜質 致突變試驗致突變試驗 生殖毒性試驗生殖毒性試驗 中國藥科大學藥物分析課件第十三 章A （四）含量測定（四）含量測定 生化藥物和基因藥物的含量表示方法：生化藥物和基因藥物的含量表示方法： 百分含量：適用于結構明確的小分子藥百分含量：適用于結構明確的小分子藥 物或經水解后變成小分子的物或經水解后變成小分子的 藥物。藥物。 生物

15、效價或酶活力單位：適用于酶類、生物效價或酶活力單位：適用于酶類、 蛋白質類藥物。蛋白質類藥物。 中國藥科大學藥物分析課件第十三 章A 含量測定方法含量測定方法： 理化分析法：理化分析法： 化學分析法：重量測定法、滴定分析法化學分析法：重量測定法、滴定分析法 電化學分析法電化學分析法 光譜分析法：比色法、紫外分光、熒光分光光法光譜分析法：比色法、紫外分光、熒光分光光法 色譜分析法：色譜分析法：HPLCHPLC法：法：RP-HPLCRP-HPLC、 HPIEC HPIEC 、HPGFCHPGFC、 灌注色譜法、灌注色譜法、HPCEHPCE法法 酶法：酶活力測定法、酶分析法酶法：酶活力測定法、酶分析

16、法 電泳法電泳法 生物檢定法生物檢定法 中國藥科大學藥物分析課件第十三 章A 1 1電化學分析法電化學分析法 藥物膜電極藥物膜電極 生物組織膜電極生物組織膜電極 藥物電極藥物電極 微生物電極微生物電極 離子選擇性電極法離子選擇性電極法 免疫電極免疫電極 免疫場效應管免疫場效應管 酶電極酶電極 第三節(jié)第三節(jié) 常用定量分析方法及其應用常用定量分析方法及其應用 中國藥科大學藥物分析課件第十三 章A 2. HPLC2. HPLC法法 1 1）RP-HPLCRP-HPLC：柱前衍生化自動測定氨基酸：柱前衍生化自動測定氨基酸 柱：柱：RPRP1818， 柱溫：柱溫：48 48 流動相：流動相：A-0.05

17、% TFAA-0.05% TFA；B-B-乙腈乙腈- -異丙醇（異丙醇（4 4：1 1） 梯度洗脫梯度洗脫 熒光檢測器：熒光檢測器： ex ex=280nm =280nm340nm,340nm, em em=430nm =430nm 中國藥科大學藥物分析課件第十三 章A 測定：測定： 樣品樣品-肽肽 樣品水解：樣品水解：5.7mol/L5.7mol/L鹽酸，鹽酸，0.1%0.1%苯酚、通苯酚、通N N2 2， 110110，20h 20h 24h24h。 樣品干燥：真空樣品干燥：真空 樣品的衍生化：丹酰氯樣品的衍生化：丹酰氯 水解剩余的衍生化試劑：水解剩余的衍生化試劑：0.4mol/L NaO

18、H0.4mol/L NaOH 進樣測定進樣測定 中國藥科大學藥物分析課件第十三 章A N(CH3)2 SO2Cl R-NH2 SO2NHR N(CH3)2 + 中國藥科大學藥物分析課件第十三 章A 中國藥科大學藥物分析課件第十三 章A 2 2）HPIECHPIEC 測定對象：蛋白質，多肽測定對象：蛋白質，多肽 柱：離子交換鍵合相柱：離子交換鍵合相 流動相：流動相：0.3mol/L0.3mol/L1.0mol/L1.0mol/L的鹽的緩沖液。的鹽的緩沖液。 梯度洗脫：鹽的濃度增大。盡量避免使用鹵梯度洗脫：鹽的濃度增大。盡量避免使用鹵 素類鹽素類鹽 特點：可回收活性蛋白。特點：可回收活性蛋白。 中

19、國藥科大學藥物分析課件第十三 章A 3 3）HPGFCHPGFC 應用：蛋白質、多肽的分離及分子量測定。應用：蛋白質、多肽的分離及分子量測定。 示例：重組人腫瘤壞死因子衍生物的分子量示例：重組人腫瘤壞死因子衍生物的分子量 的測定的測定 柱：柱：Beckman Ultraspherogel SEC 3000Beckman Ultraspherogel SEC 3000 流動相：流動相：0.1mmol/LKH0.1mmol/LKH2 2POPO4 4:0.1mmol/LNa:0.1mmol/LNa2 2SOSO4 4 （ （1:11:1）0.05%0.05%疊氮化鈉疊氮化鈉 中國藥科大學藥物分析課

20、件第十三 章A 標準蛋白分子量曲線的制備標準蛋白分子量曲線的制備： 醛縮酶醛縮酶 血清白蛋白血清白蛋白 右旋糖苷藍右旋糖苷藍 碳酸酐酶碳酸酐酶 抑蛋白酶肽抑蛋白酶肽 酪氨酸酪氨酸 T T0 0 完全排阻完全排阻 完全進入填料空隙完全進入填料空隙 T Tt t 標準蛋白分子量曲線：標準蛋白分子量曲線：K Kd d - lg M.W. - lg M.W. 中國藥科大學藥物分析課件第十三 章A 樣品測定：樣品測定： Kd = T -T0 Tt - T0 測測定定樣樣品品的的 T T 查查出出 K Kd d 計計算算 l lg g M M. .W W. . 計計算算 M M. .W W. . 中國藥科

21、大學藥物分析課件第十三 章A 應用示例：應用示例：ChPChP（20002000）重組人胰島素的質量控制）重組人胰島素的質量控制 1 1）鑒別：）鑒別： 法法1 1：在效價測定項下，供試品主峰的保留時間：在效價測定項下，供試品主峰的保留時間 應與對照品的一致。應與對照品的一致。 法法2 2：供試品與對照品分別經過酶解后，再分別：供試品與對照品分別經過酶解后，再分別 進行梯進行梯 度洗脫，供試品的肽圖譜與對照品度洗脫，供試品的肽圖譜與對照品 的肽圖譜一致。的肽圖譜一致。 中國藥科大學藥物分析課件第十三 章A 2 2）檢查：）檢查： 檢查項目：有關物質、高分子蛋白、鋅、氮、檢查項目：有關物質、高分

22、子蛋白、鋅、氮、 干燥失重、無菌、細菌內毒素。干燥失重、無菌、細菌內毒素。 有關物質：供試液經梯度洗脫，按峰面積歸一化有關物質：供試液經梯度洗脫，按峰面積歸一化 法計算有關物質的量不得超過法計算有關物質的量不得超過3.0%3.0%。 高分子蛋白質：高分子蛋白質： 中國藥科大學藥物分析課件第十三 章A 固定相：色譜用親水硅膠，它可以分離分子量固定相：色譜用親水硅膠，它可以分離分子量 為為5000500060006000的球狀蛋白。的球狀蛋白。 流動相：流動相：0.4mol/L 0.4mol/L 碳酸氫銨碳酸氫銨- -乙腈（乙腈（69 : 3169 : 31） 測定：分別測定供試液（測定：分別測定供試液（1mg/ml1mg/ml）和對照液（將）和對照液（將 供試液稀釋成供試液稀釋成0.01mg/ml0.01mg/ml），供試液顯示的所有），供試液顯示的所有 分子量大于重組人胰島素單體的各峰面積之和，分子量大于重組人胰島素單體的各峰面積之和， 應不大于對照液主峰面積（限量應不大于對照液主峰面積（限量1.0%)1