固定化酶技術(shù)(1)

1、. 1 固定化酶技術(shù) . 2 1 原理 2 特點 3 制備方法 4 應用 5 發(fā)展趨勢及建議 . 3 水溶性酶 1 原理 水不溶性載體 固定化技術(shù) 水不溶性酶 （固定化酶） . 4 2 特點 穩(wěn)定性高； 酶可反復使用； 產(chǎn)物純度高，極易將固定化酶與底物、產(chǎn)物分開； 固定化酶的反應條件易于控制 生產(chǎn)可連續(xù)化和自動化，節(jié)約勞動力； 設(shè)備小型化、可節(jié)約能源。 固定化酶同自由酶相比，具有以下優(yōu)點：固定化酶同自由酶相比，具有以下優(yōu)點： . 5 缺點： 固定化所需載體和試劑較貴，成本高，投資大 固定化時，酶活力有損失 長期生產(chǎn)，易污染，載體易降解，酶易失活 只能用于可溶性底物，較適用于小分子底物，對大 分

2、子底物不適宜 與完整菌體相比不適宜于多酶反應，特別是需要輔 助因子的反應 . 6 3 制備方法 必須注意維持酶的催化活性及專一性。 酶與載體的結(jié)合部位不應當是酶的活性部位（酶酶與載體的結(jié)合部位不應當是酶的活性部位（酶 活性中心的氨基酸殘基不發(fā)生變化）活性中心的氨基酸殘基不發(fā)生變化） 避免那些可能導致酶蛋白高級結(jié)構(gòu)破壞的條件。避免那些可能導致酶蛋白高級結(jié)構(gòu)破壞的條件。 由于酶蛋白的高級結(jié)構(gòu)是憑借氫鍵、疏水鍵和離由于酶蛋白的高級結(jié)構(gòu)是憑借氫鍵、疏水鍵和離 子鍵等弱鍵維持，所以固定化時要采取盡量溫和子鍵等弱鍵維持，所以固定化時要采取盡量溫和 的條件，盡可能保護好酶蛋白的活性基團的條件，盡可能保護好酶

3、蛋白的活性基團。 基本原則：基本原則： . 7 固定化應該有利于生產(chǎn)自動化、連續(xù)化。 載體能抗一定的機械力載體能抗一定的機械力。 固定化酶應有最小的空間位阻。 酶與載體必須結(jié)合牢固，利于固定化酶的回收及反 復使用。 固定化酶應有最大的穩(wěn)定性，所選載體不與廢物、 產(chǎn)物或反應液發(fā)生化學反應。 固定化酶成本要低，以利于工業(yè)使用。 . 8 3.1 固定化酶的傳統(tǒng)制備方法 3.1.1吸附法 吸附法是利用物理吸附法，將酶固定在纖維素、瓊脂糖等多糖類或多孔玻 璃、離子交換樹脂等載體上的固定方式。顯著特點是：工藝簡便及條件溫 和，包括無機、有機高分子材料，吸附過程可同時達到純化和固定化；酶 失活后可重新活化，

4、載體也可再生。但要求載體的比表面積要求較大，有 活潑的表面。 3.1.2包埋法 包埋固定化法是把酶固定聚合物材料的格子結(jié)構(gòu)或微囊結(jié)構(gòu)等多空載 體中，而底物仍能滲入格子或微囊內(nèi)與酶相接觸。這個方法比較簡便，酶 分子僅僅是被包埋起來，生物活性被破壞的程度低，但此法對大分子底物 不適用。 . 9 (1)網(wǎng)格型 將酶包埋在凝膠細微網(wǎng) 格中，制成一定形狀的 固定化酶，稱為網(wǎng)格型 包埋法。也稱為凝膠包 埋法。 (2)微囊型 把酶包埋在由高分 子聚合物制成的小 球內(nèi)，制成固定化 酶。由于形成的酶 小球直徑一般只有 幾微米至幾百微米， 所以也稱為微囊化 法。 . 10 1.3結(jié)合法 酶蛋白分子上與不溶性固相支

5、持物表面上通過離子鍵結(jié)合而使酶固定 的方法，叫離子鍵結(jié)合法。其間形成化學共價鍵結(jié)合的固定化方法叫 共價鍵結(jié)合法。共價鍵結(jié)合法結(jié)合力牢固，使用過程中不易發(fā)生酶的 脫落，穩(wěn)定性能好。該法的缺點是載體的活化或固定化操作比較復雜， 反應條件也比較強烈，所以往往需要嚴格控制條件才能獲得活力較高 的固定化酶。 . 11 1.4交聯(lián)法 交聯(lián)法是用多功能試劑進行酶蛋白 之間的交聯(lián)，使酶分子和多功能試 劑之間形成共價鍵，得到三向的交 聯(lián)網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，除了酶分子之間發(fā)生 交聯(lián)外，還存在著一定的分子內(nèi)交 聯(lián)。多功能試劑制備固定化酶方法 可分為：(1) 單獨與酶作用；( 2) 酶吸附在載體表面上再經(jīng)受交聯(lián)； ( 3) 多

6、功能團試劑與載體反應得到 有功能團的載體，再連接酶。交聯(lián) 劑的種類很多，最常用的是戊二醛， 其他的還有異氰酸衍生物、雙偶氮 二聯(lián)苯胺、N，N-乙烯馬來酰亞胺等。 交聯(lián)法的優(yōu)點是酶與載體結(jié)合牢固， 穩(wěn)定性較高；缺點是有的方法固定 化操作較復雜，進行化學修飾時易 造成酶失活。 . 12 3.2固定化酶的新型制備方法 3.2.1共價固定法 酶分子表面存在很多可供利用的化學基團。選擇性地利用酶分子表面遠離 活性位點的特定稀有基團(如巰基)進行反應，使該基團與載體上另一基團 共價交聯(lián)來同定酶蛋白，使其活性中心朝向溶液方向，以達到控制其空間 取向的目的。 3.2.2氨基酸置換法 利用基因定點突變技術(shù)在蛋白

7、質(zhì)分子表面合適位置置換一個氨基酸分子， 通過該氨基酸殘基特殊的側(cè)鏈基團控制固定方向。通過定點突變在枯草蛋 白酶(subtil2isin)分子表面遠離活性中心的位置引入半胱氨酸(Cys)殘基。經(jīng) 蛋白質(zhì)空間折疊后暴露出Cys，然后利用Cys殘基上的巰基固定枯草蛋白酶 分子，取得了較好的固定效果，固定效率和固定后催化活性均有很大提高。 . 13 3.2.3抗體耦聯(lián)法 大多數(shù)抗體具有足夠的穩(wěn)定性承受各種活化與偶聯(lián)方法。抗體分子中很多可供 偶聯(lián)用的官能團可以通過賴氨酸的-氨基或末端氨基、天冬氨酸的-氨基、谷 氨酸的-氨基或末端羧基進行一般性的偶聯(lián)。Spitznagel等用碘乙酸活化多孔玻 璃珠來定向固

8、定抗體酶(abzyme)48G7-4A1的Fab片段，抗體酶Fab片段保持了很 好的催化活性?？贵w分子Fc區(qū)的糖鏈部分氧化可產(chǎn)生醛基，醛基與載體上的氨 基通過縮合反應可實現(xiàn)定向固定。醛基若與載體上的酰肼通過腙鍵結(jié)合實現(xiàn)抗 體分子的定向固定，與隨機固定相比，固定后抗體穩(wěn)定性提高的同時免疫吸附 活性也提高了3倍。 3.2.4生物素-親和素親合法 生物素是存在于所有活細胞內(nèi)但含量甚微(00001)的中性小分子輔酶。親 和素是一個含有四個相同亞基的四聚體，每個亞基均含一個生物素結(jié)合位點(解 離常數(shù)105molL) 。生物素與親和素或相應細菌中的鏈霉親和素有高專一性 的、極強的親和力。這種特性使其成為免

9、疫分析、受體研究、免疫組織化學、 基因工程和蛋白質(zhì)分離等領(lǐng)域中獨特有力的工具。Min等將生物素羧化載體蛋 白、片段分別融合在熒光素酶和氧化還原酶的N末端，然后將這兩個融合蛋白 定向固定在親和素包被的瓊脂顆粒上。熒光活性提高了8倍，固定化酶的穩(wěn)定 性和固定效率均大大提高。 . 14 4 應用 4.1 在食品中的應用 4.2 在環(huán)境工程中的應用 4.3 醫(yī)學和臨床分析的應用 . 15 4.1 在食品中的應用 4.1.1 固定化木瓜蛋白酶應用于啤酒澄清 長期放置的啤酒會由于多肽和多酚物質(zhì)發(fā)生聚合反應而變得 混濁。為防止出現(xiàn)混濁，目前主要是采取向啤酒中添加蛋白 酶來水解啤酒中的蛋白質(zhì)和多肽，但水解過度

10、會影響啤酒保 持泡沫的性能。Witt等1970年用戊二醛交聯(lián)將木瓜蛋白酶固定 化制成反應柱，生產(chǎn)所得啤酒在長期貯存中可保持穩(wěn)定。 Finely 等人報道，用幾丁質(zhì)固定的木瓜蛋白酶可用于啤酒的大 罐冷藏或過濾后裝瓶進行處理，通過調(diào)節(jié)流速(酶柱法)和反應 時間(分批法)，可以精確控制蛋白質(zhì)的分解程度。處理后的啤 酒和固定化酶易分開，固定化酶可以多次反復使用，極為經(jīng) 濟。經(jīng)處理后的啤酒在風味上與傳統(tǒng)的啤酒無明顯差異。 . 16 4.1.2 固定化酶用于水解牛奶中的乳糖 牛奶中含有4.34.5的乳糖，患乳糖缺乏癥 的人飲用牛奶后將導致不良后果，用乳糖酶可 以將乳糖分解為半乳糖和葡萄糖。用固定化乳 糖酶

11、反應器可以連續(xù)處理牛奶，將乳糖分解。 此外，固定化乳糖酶還可以用來分解乳糖，制 造具有葡萄糖和半乳糖甜味的糖漿。乳糖在溫 度較低時易結(jié)晶，用固定化乳糖酶處理后，可 以防止其在冰激淋類產(chǎn)品中結(jié)晶，改善口感， 增加甜度。 . 17 4.1.3 固定化葡萄糖異構(gòu)酶在高果糖漿生 產(chǎn)中的應用 固定化葡萄糖異構(gòu)酶是世界上生產(chǎn)規(guī)模最大的 一種，它可以來催化玉米糖漿和淀粉生產(chǎn)高甜 度的高果糖漿。自1972年這技術(shù)產(chǎn)生以來，科 學家已經(jīng)固定了幾種芽孢桿菌和鏈霉菌中提的 葡萄糖異構(gòu)化酶，并大量應用于工業(yè)生產(chǎn)中， 今后幾十年中它將是應用最廣，市場份額最大 的固定化酶。 . 18 4.1.4 固定化酶法脫去柑桔類果汁

12、中 的苦味 柑桔類加工產(chǎn)品出現(xiàn)過度苦味是柑桔加工業(yè)中較重要的問題。 造成苦味的物質(zhì)主要是二類：一類為檸檬苦素的二萜烯二內(nèi) 酯化合物(A 環(huán)和B 環(huán))；另一類為果實中多種黃酮苷。脫去苦 味的方法有：吸附法和固定化酶法。吸附法是一次去除苦味 物質(zhì)，而酶法脫苦主要是利用不同的酶分別作用于檸檬苦素 和柚皮苷，生成不含苦味的物質(zhì)。工廠生產(chǎn)中常采用固定化 柚皮苷酶減少柑桔類果汁中的柚皮苷含量。Tsen等在1989 年 使用甲殼素固定柚皮苷酶，并且研究了固定化的動力學因子。 Manjon等14使用空心玻璃床作為載體，分別在1977 年使用 DEAE-Sephadex，1978 年使用單寧-2- 氨基乙基纖維

13、作為載體。 1996 年P(guān)uri等使用海藻糖，1998年Soures等使用醋酸纖維和三 醋酸纖維制成膜固定酶。 . 19 酶法去除苦味物質(zhì)因為酶的生物活性特征而使 其應用受到很多限制。為了在不改變底物理化 性質(zhì)條件下，使酶保持最大活性，通常要注意 以下幾個問題： 固定化材料的選擇；固定率；固定化后的酶活 性；最適pH值；溫度對酶活性的影響；酶在 不同濃度果汁中受到的抑制作用；酶的保存。 . 20 4.1.5 固定化酶技術(shù)應用于食品檢測 固定化酶技術(shù)的發(fā)展使生物傳感器應運而生。而它的問世不 僅使食品成分的快速、低成本、高選擇性分析測定成為可能， 而且生物傳感器技術(shù)的持續(xù)發(fā)展將很快實現(xiàn)食品生產(chǎn)的在

14、線 質(zhì)量控制，降低食品生產(chǎn)成本，并給人們帶來安全可靠及高 質(zhì)量的食品。生物傳感器的核心元件就是其分子識別元件， 即由生物活性物質(zhì)經(jīng)固定化后形成的敏感膜。 Kurube用酶傳感器測定了豬肉新鮮度； 日本農(nóng)林水產(chǎn)省研制出的滋味傳感器，可品嘗肉湯風味，用 于肉湯生產(chǎn)過程的質(zhì)量控制； Fernando采用電導型生物傳感器來檢查食品中有機農(nóng)藥的污染。 . 21 4.2 在環(huán)境工程中的應用 4.2.1 用于有機廢水處理 污水處理中常用的酶有辣根過氧化物酶、漆酶、酪 氨酸酶等。這些酶可降解有機廢水中毒性很強的酚 類。 利用固定化辣根過氧化物酶去除污水中的4-氯酚，去 除率高達80%。 用殼聚糖微球固定化辣根

15、過氧化物酶處理含酚廢水， 并考察酚濃度對去除率的影響。研究表明，酚濃度 低于100 mg/L 時，酚的去除率達90%以上，隨著酚 濃度的增加，酚的去除率逐漸下降。 . 22 用固定化酶處理受污染水體中的農(nóng)藥也取得了 很好的效果。 用聚丙烯負載二氧化鈦膜固定農(nóng)藥降解酶，降 解農(nóng)藥甲基對硫磷。研究發(fā)現(xiàn)，甲基對硫磷在 30 min 內(nèi)降解了70%以上。尤其等以殼聚糖為 載體，戊二醛為交聯(lián)劑，固定化真菌漆酶對農(nóng) 藥氯苯嘧啶醇進行降解。研究認為，在酸性條 件下，固定化漆酶對氯苯嘧啶醇具有良好的降 解作用。 . 23 “用于污染水源修復的固定化酶復合材料及其制備方法”發(fā) 明專利也用到了固定化酶。這種復合材

16、料造價低，廣泛應用 于廢水處理工程，是一種經(jīng)濟實用、前景廣闊的新型環(huán)保材 料，具有綜合交叉學科集成創(chuàng)新的特點， 為環(huán)保領(lǐng)域水處理 工程技術(shù)帶來嶄新的突破。 聯(lián)合固定化技術(shù)使酶的特性得到了更好的發(fā)揮，擴展了固定 化酶的應用范圍。將脫色酶與苯胺降解菌混合固定用來處理 染料廢水。結(jié)果表明， 脫色率及苯胺降解率分別達到80%和 90%以上。用苯酚甲醛樹脂吸附結(jié)晶型枯草桿菌淀粉酶處理 造紙廠廢水，廢水在反應器中停留4.5 h，可去除廢水中78%的 懸浮膠態(tài)淀粉。 . 24 4.2.2 用于環(huán)境污染物的監(jiān)測 由固定化酶制成的酶反應器可以直接或與其他檢測 器組成酶電極、酶傳感器等分析檢測系統(tǒng)來實現(xiàn)對 環(huán)境污

17、染物的監(jiān)測。 由于農(nóng)藥的面源污染、未經(jīng)處理的污水直接灌溉等 問題， 食品中的有毒有害物質(zhì)成為環(huán)境監(jiān)測對象。 固定化酶技術(shù)可以實現(xiàn)對食品中有害物質(zhì)的有效檢 測。用固定化草酸氧化酶完成了對河豚魚中河豚毒 素的快速檢測。用聚乙烯醇苯乙烯吡啶固定乙酰膽 堿酯酶， 與搗碎提取設(shè)備、酶標儀組合了一套檢測 設(shè)備，對200 多個蔬菜樣品進行了成功的檢測。 . 25 4.2.3 其他應用 CO2是一種重要的溫室氣體。目前全球每年排 放的數(shù)十億噸CO2需要得到妥善的處置。固定 化酶技術(shù)在固定CO2方面也取得了成果。據(jù)報 道，以工業(yè)固體廢棄物為原料， 利用固定化 碳酸酐酶和超重力強化反應可得到CO2的有效 固定 固

18、定化酶技術(shù)在清潔生產(chǎn)領(lǐng)域具有潛在的應用 價值。固定化的木聚糖酶和漆酶用于紙漿漂白， 可以避免產(chǎn)生傳統(tǒng)造紙工藝過程中用氯漂白產(chǎn) 生的難以生物降解的各類氯代有機物。 . 26 固定化酶技術(shù)還在污水生物處理工藝中得到了 應用。用大孔樹脂固定水解酶類到兩相厭氧反 應器中處理黃漿廢水。對厭氧濾池中的以納米 改性陶粒為載體固定化木瓜蛋白酶開展研究， 都取得了一系列相應的成果。 .27 4.3 固定化酶在醫(yī)藥治療上的應用固定化酶在醫(yī)藥治療上的應用 溶液酶的應用缺陷：溶液酶的應用缺陷： n酶作為異體物質(zhì)，在體內(nèi)應用會導致免疫反應酶作為異體物質(zhì)，在體內(nèi)應用會導致免疫反應 n酶是蛋白質(zhì)，在體內(nèi)易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)移除

19、和酶是蛋白質(zhì)，在體內(nèi)易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)移除和 被蛋白質(zhì)酶水解破壞被蛋白質(zhì)酶水解破壞 n由于稀釋效應，藥物酶無法集中于靶器官組織由于稀釋效應，藥物酶無法集中于靶器官組織 以達到治療所需的最適高濃度以達到治療所需的最適高濃度 .28 （1）轉(zhuǎn)入體內(nèi)發(fā)揮作用（口服和注入）轉(zhuǎn)入體內(nèi)發(fā)揮作用（口服和注入） n口服：最初主要限于消化酶類，近年來也有人嘗試將酶以口服：最初主要限于消化酶類，近年來也有人嘗試將酶以 口服方式用于尿中毒等疾患的治療?？诜膬?yōu)點是藥物通口服方式用于尿中毒等疾患的治療?？诜膬?yōu)點是藥物通 過粘膜吸收后能迅速進行擴散，進入體內(nèi)，通常不會引起過粘膜吸收后能迅速進行擴散，進入體內(nèi)，通常不會引

20、起 免疫反應。免疫反應。 n注入：是最有實用價值的一種方式，溶液酶的弱點集中于注入：是最有實用價值的一種方式，溶液酶的弱點集中于 此方式。此方式。 固定化酶可很好的地解決這一問題，辦法是將藥物酶包埋固定化酶可很好的地解決這一問題，辦法是將藥物酶包埋 于半透膜中，可防止藥物酶和蛋白水解酶以及其它免疫因于半透膜中，可防止藥物酶和蛋白水解酶以及其它免疫因 子等直接接觸，因而可延長酶在體內(nèi)的半衰期和避免免疫子等直接接觸，因而可延長酶在體內(nèi)的半衰期和避免免疫 過敏反應。過敏反應。 .29 （2 2）通過）通過“體外循環(huán)體外循環(huán)”做成人工臟器做成人工臟器 固定化酶也可做成固定化酶也可做成“人工臟器人工臟器

21、”參與體外循參與體外循 環(huán)，環(huán)， 應用有兩方面：應用有兩方面： 用于除去有害的毒性物質(zhì)及有潛在毒害作用的代謝用于除去有害的毒性物質(zhì)及有潛在毒害作用的代謝 產(chǎn)物產(chǎn)物 除去氨基酸，使需要這些物質(zhì)的病變組織除去氨基酸，使需要這些物質(zhì)的病變組織“餓死餓死”； 治療時只需將患者的血液引出體外，通過由固定化治療時只需將患者的血液引出體外，通過由固定化 酶等構(gòu)成的酶等構(gòu)成的“人工臟器人工臟器”加以處理，然后再回流體加以處理，然后再回流體 內(nèi)內(nèi)。 .30 實例：實例： A. 消血栓：消血栓： n纖溶酶是異源蛋白質(zhì)，在人體內(nèi)引起免疫反應，無法長期使用。纖溶酶是異源蛋白質(zhì)，在人體內(nèi)引起免疫反應，無法長期使用。 n

22、酶的不穩(wěn)定性使其在較短的時間內(nèi)失活。酶的不穩(wěn)定性使其在較短的時間內(nèi)失活。 用包埋法制備的酶固定化技術(shù)可克服上述弊端，酶在囊中不能漏出，用包埋法制備的酶固定化技術(shù)可克服上述弊端，酶在囊中不能漏出， 小分子物質(zhì)能自由進出。小分子物質(zhì)能自由進出。 .31 B.B.人工腎人工腎 將病人血液中的尿素將病人血液中的尿素 經(jīng)脲酶水解成氨，再用活經(jīng)脲酶水解成氨，再用活 性炭吸附。即：用微膠囊性炭吸附。即：用微膠囊 固定化脲酶和活性炭組成固定化脲酶和活性炭組成 人工腎。人工腎。 . 32 5 發(fā)展趨勢及建議 隨著生物技術(shù)的迅速發(fā)展，固定化酶在食品工業(yè)中的應用日 益廣泛，但并不是說可以使用酶的地方，都可以用固定化酶 來代替。在使用固定化酶技術(shù)