干細(xì)胞培養(yǎng)全攻略

1、For personal use only in study and research;not for commercial use羈ES細(xì)胞培養(yǎng)螂A.FBS的滅活與分裝芆1.化凍袇將血清(Fetal Bovine Serum, Hyclone )從20C冰箱取出，放于 4C冰箱化凍過夜; 也可室溫(或浸于自來水中)化凍，化凍后若不馬上滅活，可以放入4 C冰箱暫時(shí)保存；羈2.滅活(1)(2) 罿放入室溫的水浴鍋內(nèi)開始加熱(同時(shí)放入一個(gè)內(nèi)裝200 ml自來水的血清瓶，插入 一根溫度計(jì)，溫度監(jiān)控以此為準(zhǔn))；(3)(3) 肇當(dāng)溫度計(jì)顯示56C時(shí)，控制在此溫度 30分鐘土 3分鐘；若不小心使溫度上升超

2、過 56 C，則：若仍未超過 60 C，且時(shí)間很短(比如：不超過 5分鐘)，則仍可使用； 若超過60C，或者時(shí)間較長(zhǎng)，則棄去不用，或者嘗試用于ME細(xì)胞的培養(yǎng)；(2)(3) 薆取出，自然冷卻至室溫(約需 1 3小時(shí))，可分裝或20 C繼續(xù)凍存；肁3.分裝荿(1)轉(zhuǎn)入細(xì)胞間，用移液器將血清分裝，注意預(yù)先要將血清輕輕搖動(dòng)數(shù)周、混勻；吹出 血清時(shí)要注意：不要吹出氣泡(血清很粘稠，很容易產(chǎn)生氣泡；如果已產(chǎn)生氣泡，則 在酒精燈火焰上過一下)；標(biāo)好批號(hào)和日期；蝿(2)放入20 C冰箱凍存(分裝一次大約可以使用 1 2個(gè)月)。莄B配制DME血清培 養(yǎng)基賺1.提前一天將分裝好的 FBS從一20C冰箱取出，放于

3、4C冰箱化凍；螀2.在細(xì)胞間中將 FBS以及其它需要添加的成分（如，丙酮酸鈉、抗生素等），按照比例加入DMEM培養(yǎng)基中，作好標(biāo)簽；放入 4C冰箱保存。腿配制比例如下：膃50ml體積的干細(xì)胞培養(yǎng)液配制-+- 芁賺衿 DME( High glucose ) /DMEM培養(yǎng)基(高糖膆莀羋谷氨酰胺（）莇 50ul羅蒀非必需氨基酸蠆 500ul聿螄丙酮酸鈉螄 500ul肀薇B-巰基乙醇螇？襖蒁雙抗艿 50ul節(jié)蝕血清蚈 7.5ml蒂肀LIF螀5ul螄膄蝿袀膅C.原代胚胎成纖維細(xì)胞（ME的制備薂1.取12.5-13.5dpc 孕鼠，斷頸處死；袂2.將鼠腹面向上放置，70%酒精潤(rùn)濕、消毒腹部（防止腹毛飛揚(yáng)，

4、污染內(nèi)臟及子宮），剪開皮膚層、肌肉層，打開腹腔，將連接在子宮上的結(jié)締組織及脂肪剪去，將子宮取出，轉(zhuǎn)入 無菌10cm平皿中；羀3.把平皿轉(zhuǎn)入超凈臺(tái)；薆4.用鑷子打開子宮壁，擠出鼠胚，并與胚外組織、胎盤等分離，除去鼠胚的頭、四肢及 各種內(nèi)臟（主要為肝臟、肺臟、心臟和腸胃等）；莄5將鼠胚移入另一新的無菌皿，用PBS洗三次；薁6.棄去PBS用彎頭剪將鼠胚剪碎，加入PBS洗至溶液基本無色（1 4 次）;聿7.加入適量Trypsin-EDTA （0.25% Gibco 25520，下同），體積約等于組織塊體積；羇8. 用滴管輕輕吹勻，室溫下消化 1 1 0分鐘（或消化至溶液渾濁變粘） ，加入與消化液等 體

5、積培養(yǎng)基，輕輕吹打混勻（ 510次），靜置；螂 9. 沉降后將上部溶液輕輕吸出，轉(zhuǎn)入離心管中。莀10. 將細(xì)胞懸液管離心（ 1000轉(zhuǎn) 5分鐘）；聿11.棄去上清，向沉淀中加入適量培養(yǎng)基，輕輕吹打重懸，將其分種至10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，補(bǔ)加適量培養(yǎng)基，作標(biāo)簽（ME- 0;注意：若凍存，則可以使用復(fù)蘇后的 0代ME制作Feeder; 若直接使用則最好不用0代ME細(xì)胞做Feeder，要傳到一代以后再用來制作Feeder比較好），轉(zhuǎn)入培養(yǎng)箱培養(yǎng)；肄12. 視細(xì)胞生長(zhǎng)情況換液（一般 3 天換液一次） ，若細(xì)胞已長(zhǎng)滿，則凍存，或者 1： 3-5 傳 代（視細(xì)胞疏密而定），放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)（此后不用再換液

6、）；1 5代的ME細(xì)胞均可用來制作 Feeder。蒄飼養(yǎng)層細(xì)胞（Feeder）的制備腿注：含10 ug/ml絲裂霉素C的DMEM血清培養(yǎng)基（FBS占10%）（實(shí)驗(yàn)室所用 MM（為10 mg/mL, Calbiochem ）腿1.棄去細(xì)胞培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液， 加入適量含10ug/ml絲裂霉素C的培養(yǎng)基（DMEM+10FBS）;蒅2. 放入培養(yǎng)箱培養(yǎng) 3小時(shí)（ 24小時(shí)）；羂3. 用 0.1% 明膠處理培養(yǎng)皿 （將明膠加入, 搖動(dòng)使明膠覆蓋全部皿底, 然后吸出明膠棄去 即可）,室溫放置 2 小時(shí)以上,至皿底明膠干燥為止；膂4.棄去含有絲裂霉素 C的培養(yǎng)基，加入 2 3 mL PBS,輕輕搖動(dòng)，棄去

7、PBS如此洗3-5 次（必須洗 3 次以上，以便徹底洗去殘存的絲裂霉素，絲裂霉素是有絲分裂抑制劑，因而對(duì) ES細(xì)胞有毒性）;24. 加入適量胰酶消化 30 秒,吸去消化液,靜置至細(xì)胞層出現(xiàn)裂縫或明顯滑壁為止,加入 培養(yǎng)基,吹打, 種至明膠處理過的培養(yǎng)皿中即可（如細(xì)胞過稀,可再補(bǔ)加絲裂霉素處理過的 細(xì)胞），半小時(shí)后即可使用（如果急用，則可以用ES細(xì)胞培養(yǎng)基終止消化，然后與ES細(xì)胞一起轉(zhuǎn)入明膠處理過的新板上） ,可使用 610天,用前更換培養(yǎng)液（如未用明膠處理培養(yǎng) 皿，則需在培養(yǎng)箱中放置 2小時(shí)以上方可使用；最好是前一天下午制作Feeder，第二天上午使用，這時(shí)的Feeder狀態(tài)最好，最適于 ES

8、細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，而且萬一制作的Feeder在第二天早上發(fā)現(xiàn)出了問題,還可以趕緊補(bǔ)做） 。ES細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM+15%FBS2- 巰基乙醇： 5.5uM1000XGibco 21985-023L- 谷氨酰胺： 2mM100XLIF ：1000U/mL10000X非必需氨基酸： 100uM100XSigma G8540Chemicon ESGRO? (LIF); 10E7 units ，貨號(hào) :ESG1107Gibco 11140-050雙抗：100XGibco 15070-063ES細(xì)胞的復(fù)蘇1. 提前制備好相應(yīng)數(shù)量的 Feeder ；2. 準(zhǔn)備37- 39C的熱水，從液氮罐中取出所需凍存管（凍

9、存細(xì)胞），迅速投入熱水中，迅速劇烈搖動(dòng)直至凍存液全部融化；3. 轉(zhuǎn)入無菌間， 1000轉(zhuǎn)/ 分鐘離心 5-10 分鐘；4. 棄上清，加入 1 ml ES 培養(yǎng)液輕輕吹打重懸，轉(zhuǎn)入鋪有飼養(yǎng)層細(xì)胞的培養(yǎng)皿中（凍存前 細(xì)胞來自多大的培養(yǎng)皿，復(fù)蘇時(shí)就用相應(yīng)大小的培養(yǎng)皿） ，補(bǔ)加適量培養(yǎng)液；5. 轉(zhuǎn)入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，次日換液；此后每 24 小時(shí)換一次液，每 48 小時(shí)傳一次代（視生長(zhǎng)情 況）。ES細(xì)胞的換液1. 提前半小時(shí)左右將培養(yǎng)基從 4C冰箱取出，放于室溫（或者放于37C溫箱內(nèi)）；2. 細(xì)胞培養(yǎng)皿從培養(yǎng)箱內(nèi)取出，相差顯微鏡下作常規(guī)觀察（判斷生長(zhǎng)情況，并確證未發(fā)生 污染）后轉(zhuǎn)入無菌操作臺(tái)內(nèi)；3. 將ES細(xì)

10、胞培養(yǎng)皿內(nèi)的液體吸出、棄去，換新鮮培養(yǎng)基（6 cm培養(yǎng)皿約5 mL, 3.5 cm培養(yǎng)皿約3 mL培養(yǎng)基；若死細(xì)胞較多則可以先用PBS洗一次，再加培養(yǎng)基）；4. 放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。ES細(xì)胞的傳代1. 前一天下午做好所需數(shù)量的 Feeder 細(xì)胞板；2. 提前半小時(shí)左右將培養(yǎng)基從 4C冰箱取出，放于室溫（或者放于37C溫箱內(nèi)）；3. 將ES細(xì)胞培養(yǎng)皿、Feeder細(xì)胞培養(yǎng)皿從培養(yǎng)箱內(nèi)取出 （相差顯微鏡下作常規(guī)觀察，F(xiàn)eeder細(xì)胞應(yīng)生長(zhǎng)良好，細(xì)胞覆蓋95%左右，至少90%以上的培養(yǎng)皿面積）；ES細(xì)胞應(yīng)生長(zhǎng)良好，接近長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿，細(xì)胞集落大小一致、疏密均勻，集落形狀規(guī)則、呈橢圓形、邊緣光滑、表 面

11、光滑，細(xì)胞生長(zhǎng)致密、核大、胞質(zhì)少；4將ES細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)的液體吸出、棄去，用PBS 1 mL左右洗一遍，加入胰蛋白酶溶液，作用約 30秒，小心吸出胰蛋白酶溶液，棄去；再作用15分鐘，不時(shí)觀察，待細(xì)胞層（皿底一層白色臟東西樣膜） 出現(xiàn)裂縫并明顯開始下滑時(shí)，補(bǔ)加培養(yǎng)基，適度吹打（視消化程度 及管口粗細(xì)而定，至看不到明顯的大的細(xì)胞團(tuán)塊為止）；平均分到 Feeder 培養(yǎng)皿中（滴加，以免將 Feeder 細(xì)胞吹脫落下來） ，滴加補(bǔ)加培養(yǎng)基至 5 ml 左右（滴加，以免將 Feeder 細(xì)胞 吹脫落下來；若為 3.5cm 培養(yǎng)皿，則補(bǔ)加至 3ml 左右），作好標(biāo)簽；5. 前后左右水平晃動(dòng)培養(yǎng)皿，使ES細(xì)胞

12、均勻分布于培養(yǎng)皿中，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。ES細(xì)胞的凍存1. 常規(guī)方法將細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液；2. 轉(zhuǎn)入試管， 1000轉(zhuǎn)/分鐘離心 5分鐘；3. 配適量?jī)龃嬉海楹?10%二甲亞砜（DMSO, 10% FBS的DMEM培養(yǎng)液）；4. 棄上清，每管加入1ml凍存液，吹打成細(xì)胞懸液（只要使ES細(xì)胞分散成35個(gè)細(xì)胞的 小團(tuán)塊即可） ，轉(zhuǎn)入凍存管，作好標(biāo)簽；5. 放入程序凍存盒內(nèi) 24 小時(shí)后轉(zhuǎn)入液氮罐中凍存。僅供個(gè)人用于學(xué)習(xí)、研究；不得用于商業(yè)用途For personal use only in study and research; not for commercial use.Nur f u r

13、 den pers?nlichen f u r Studien, Forschung, zu kommerziellen Zwecken verwendet werden.Pour l e tude et la recherche uniquementa des fins personnelles; pasa des fins commerciales.to員bko gA.nrogeHKO TOpMenob3ymm aoadyHeHuac egoB u HHuefigoHMucno 員 B30BaTbCEb KOMMepqeckuxqe 員 ex.以下無正文For personal use only in study and research; not for commercial use僅供個(gè)人用于學(xué)習(xí)、研究；不得用于商業(yè)用途For personal use only in study and research; not for commercial use.Nur f u r den pers?nlichen f u r Studien, Forschung, zu kommerziellen Zwecke