丙型肝炎病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3解旋酶保守性表位單克隆抗體及其意義

1、丙型肝炎病毒非結(jié)構(gòu)蛋白 3 解旋酶保守性表位單克隆抗體及其意義丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV感染而引起的嚴(yán)重威脅人類健康的傳染性疾病。全球約有1.3-1.7億HCV感染者,大約20刑以自然 清除,80%發(fā)展為HCV慢性感染。10-20%勺HCV慢性感染會(huì)進(jìn)一步發(fā)展為慢性進(jìn)行性肝病，包括肝硬化、肝細(xì) 胞癌等。HCV是一種非甲非乙型肝炎病毒，后命名為丙型肝炎病毒，歸屬于肝炎病 毒屬 (Hepacivirus),黃病毒科(Flaviviridae) 。HCV病毒體呈球形，為單股正鏈RNA病毒。HCV-RN全長約為9.6kb,包括 個(gè)位于基因中央的開放閱讀框 (O

2、RF)。該閱讀框編碼 3000 多氨基酸的前體多聚蛋白 , 其通過宿主和病毒的蛋白酶 作用被切割成10個(gè)具有獨(dú)立功能的HCVS白,根據(jù)功能的不同分別命名為核心蛋 白 Core (C), 包膜蛋白 (envelope protein)1 、 2(E1 、 E2), p7 和非結(jié)構(gòu)蛋白 (nonstructural protein) NS2、NS3 NS4A NS4B NS5A和 NS5B NS3蛋白是 HCV 病毒復(fù)制中重要的功能蛋白之一，發(fā)揮絲氨酸蛋白酶，解旋酶和NTP酶活性，成為 當(dāng)今HCV診斷，治療和預(yù)防的研究熱點(diǎn)。NS3蛋白N末端1/3具有絲氨酸蛋白酶活性，與NS4A勾成復(fù)合體，對(duì)多聚蛋

3、 白前體起到剪切作用。C末端2/3氨基酸構(gòu)成HCV NS解旋酶(helicase),發(fā)揮 三磷酸腺苷酶(ATPase)和解旋酶作用，使雙鏈RNA解旋,對(duì)HCVRN復(fù)制起到重要 作用。此外，研究表明,NS3解旋酶含有大量B細(xì)胞優(yōu)勢(shì)表位，能在HCV感染早期誘 導(dǎo)機(jī)體發(fā)生體液免疫反應(yīng)，產(chǎn)生抗體。因此NS3蛋白(11921457aa)常用作HCV 抗體 EIA 檢測(cè)試劑盒中的包被蛋白。近年來,由于NS3蛋白功能的進(jìn)一步明確,發(fā)現(xiàn)NS3解旋酶區(qū)域中包含大量的 高度保守的功能區(qū),例如,模序I (Walker A:207GSGKS21是ATP吉合位點(diǎn),在ATP 水解中發(fā)揮作用。因此，NS3解旋酶成為抗HCV

4、病毒復(fù)制的理想靶位。研究者致力于抑制劑與NS3解旋酶的相互作用,來研發(fā)新一代NS3解旋酶抑 制劑。在本課題中，制備了大量抗HCVNS解旋酶的單克隆抗體(單抗),研究單抗 識(shí)別表位位點(diǎn)及意義，并進(jìn)一步研究單抗對(duì)HCVNS功能的影響，探索表位氨基酸 位點(diǎn)和單抗在HCV診斷與治療中的潛在價(jià)值。我們從含有HCVNS3(lb型)全長基因的質(zhì)粒PMD20NS2-4中,擴(kuò)增NS3目的基 因,并構(gòu)建表達(dá)載體PET-32a-NS3,采用基因原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行目的基因表達(dá)。 可 溶性蛋白通過Ni-NTA親和層析純化,獲得純度約為90%勺截短型NS3蛋白 (1192-1459aa) T-rNS3 。以T-rNS3蛋白

5、為抗原免疫BALB/C小鼠,采用鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞雜交技 術(shù)制備抗HCVNS單克隆抗體。此外,我們獲得了三種NS3全長蛋白：一種是從轉(zhuǎn) 染pTY-CMV-NS質(zhì)粒并穩(wěn)定表達(dá) HCV NS3S白的293T細(xì)胞中獲得重組 NS3蛋白 (FL-rNS3); 種是從轉(zhuǎn)染HCV2a型RNA(JFH-1)的Huh7.5.1細(xì)胞中獲得的天然NS3蛋白；還有一種為純度為95%勺商品化蛋白FL4b-rNS3,用來進(jìn)行解旋酶體外 功能實(shí)驗(yàn)。為確定B細(xì)胞表位,設(shè)計(jì)并合成了 47條多肽。其中,29條為重疊7個(gè)氨基酸 的長度為16個(gè)氨基酸長肽,12條為根據(jù)長肽P05 P21設(shè)計(jì)的短肽,5條為根據(jù)P05 P21與其他亞

6、型HCV.GB病毒C比對(duì)結(jié)果設(shè)計(jì)的突變肽,一條布魯士桿菌16 肽作為陰性對(duì)照。用合成肽通過peptide-ELISA和競(jìng)爭抑制ELISA方法與單克隆抗體反應(yīng),對(duì) 抗體識(shí)別表位進(jìn)行確定。通過 ELISA、Western-Blot 和免疫熒光染色 （IFS） 等方 法,用T-rNS3蛋白,FL-rNS3蛋白,天然NS2蛋白,FL4b-rNS3蛋白對(duì)單克隆抗體進(jìn) 行鑒定并對(duì)抗體識(shí)別表位進(jìn)行分類。為確定線性表位的保守性,我們從Gen Ba nk數(shù)據(jù)庫中隨機(jī)選取了大量HCV不 同亞型和黃病毒科其他病毒的氨基酸序列與線性表位氨基酸進(jìn)行比對(duì)。 根據(jù)比對(duì) 結(jié)果合成突變肽,分別與單抗進(jìn)行ELISA反應(yīng),分析線性

7、表位的保守性和單抗的 特異性。為確定線性表位的免疫優(yōu)勢(shì)性 , 通過 peptide-ELISA 方法對(duì)源于我國廣東和 北京地區(qū)獻(xiàn)血者中的HCV感染者和健康獻(xiàn)血者進(jìn)行研究，測(cè)定表位多肽與血清中 抗體的反應(yīng)性，與常規(guī)兩種不同血清抗體EIA試劑盒篩查和核酸檢測(cè)結(jié)果相比較， 評(píng)估表位多肽ELISA檢測(cè)與常規(guī)方法檢測(cè)的符合率。根據(jù)兩種EIA方法測(cè)定抗體 和PCF方法測(cè)定病毒載量的結(jié)果,將136份HCV感染樣本分為50份自然康復(fù)性 （RNA-/Ab+）和86份慢性（RNA+/Ab+）.以128份健康人血樣作為陰性對(duì)照,確定健 康人血清抗體水平（S/CO值：mean+2SD,95可信區(qū)間）,以此評(píng)估多肽與H

8、CV陽性 樣品的反應(yīng)陽性率,繪制ROCi線并確立最優(yōu)Cut-off值,并以此計(jì)算得到表位多 肽與抗體反應(yīng)的靈敏度、特異性、陽性預(yù)測(cè)值 （PPV）和陰性預(yù)測(cè)值（NPV）。用 Kolmogorov-Smirnov Z 分析 ROCS與標(biāo)準(zhǔn)值(0.5)的差異。用 PearsonChi-Square檢驗(yàn)比較表位多肽分別與HCV慢性感染樣品和HCV!然康復(fù)性樣品 反應(yīng)兩組之間的差異。此外,我們還通過體外HCVNS解旋酶活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，評(píng)估單克隆抗體對(duì)解旋酶的抑制作用程度。用單項(xiàng)方差分析和Dunnett s T3法來比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組 的差異 ,P<0.05 即為差異顯著。通過以上實(shí)驗(yàn)方法 , 用雜交

9、瘤技術(shù)制備了 29 株單克隆抗體。 單抗分別與多肽 進(jìn)行ELISA反應(yīng),結(jié)果示,有6株單克隆抗體識(shí)別8條16個(gè)氨基酸的長肽,其中單 抗1C11所識(shí)別的P13P14可以示為一條表位氨基酸序列,而1A10所識(shí)別的P09P16是一條不連續(xù)的線性表位序列。因此, 表位篩選共獲得 5 條連續(xù)性的線性表位和一條非連續(xù)性的線性表位。29株單抗與重組NS3蛋白和天然NS3蛋白的West on-blot結(jié)果顯示：27株與變 性的T-rNS3反應(yīng)；8株與變性的FL-rNS3反應(yīng),其中3株與變性的天然蛋白反應(yīng)。與重組NS3蛋白和天然NS3蛋白的IFS結(jié)果顯示：10株單抗與非變性的FL-rNS3蛋白反應(yīng)；7株與非變性

10、的天然FL-rNS3蛋白反應(yīng),其中六株（mAb2E12, mAb4B4, mAb3E5, mAb3H3, mAb5F6, mAb6G與 FL-rNS3 蛋白交叉反應(yīng),一株 （mAb5C9不反應(yīng)。通過上述結(jié)果,將29株單抗識(shí)別的HCVNS抗原表位分為線性 （6 株）、構(gòu)象性（3 株）、半構(gòu)象性（3 株）三個(gè)類型（其余 17株未分類）。識(shí)別線性表位的單抗中,單抗2E12和3E5與天然NS3蛋白結(jié)合。為精確這兩株單抗識(shí)別的表位,我們用短肽與單抗預(yù)孵育的混合物通過ELISA方法和16個(gè)氨 基酸的長肽進(jìn)行競(jìng)爭抑制；并用短肽包被 , 與單抗進(jìn)行 peptide-ELISA 。結(jié)果示,2E12識(shí)別的表位EP

11、05為205PTGSGKSTKQ角E5識(shí)別的表位EP21 為346EIPFYGKAIPIETIKG361 亥表位其核心氨基酸序列為 347IPFYGKAI354分析 兩條表位在HCVNS蛋白中的位置,發(fā)現(xiàn)EP05所在位置覆蓋了 NS3軍旋酶中的ATP 結(jié)合位點(diǎn)（207GSGKS211）, EP21的位置接近核苷酸結(jié)合位點(diǎn)。將兩條表位氨基酸與HCVM他亞型和黃病毒科其他病毒的相似位點(diǎn)的氨基 酸序列進(jìn)行比較，分析線性表位的特異性與相似性。發(fā)現(xiàn)EP05氨基酸序列與不同亞型HCV和黃病毒科非人類感染病毒 GB病毒B相似位點(diǎn)的氨基酸完全相同,與人 感染病毒GB病毒C相近(存在K208A變異)；根據(jù)變異情

12、況,設(shè)計(jì)突變肽GP05 (K208A),結(jié)果示單抗2E12不與GP05反應(yīng),說明EP05在HCV各個(gè)亞型中完全保 守, 在人感染性的黃病毒科中高度特異。EP21與不同亞型的HCV!似序列相比較,氨基酸呈現(xiàn)高度保守性,僅在少數(shù) 亞型中有I347V、K352RI354L變異,與黃病毒科GB病毒C比較存在K352HA353G 變異；Peptide-ELISA 結(jié)果示,單抗 3E5不與 VatP2101(I347V)、VatP2102(K352R) 和 GP21 (K352H 和 A353G)反應(yīng)，與 VatP2103(I354L)弱反應(yīng)。但是，在 ELISA和IFS中,單抗3E5與含有1347V和K

13、352R突變位點(diǎn)的FL-rNS3(4b型)和天然NS3 蛋白(2a型)反應(yīng)陽性，說明EP21核心區(qū)域上述位點(diǎn)氨基酸的改變，可能影響表位 在線性條件下與單抗的結(jié)合 , 但在空間狀態(tài)下 , 由于游離表位氨基酸的結(jié)構(gòu)復(fù)雜 性, 即使上述位點(diǎn)氨基酸改變也不影響與單抗的反應(yīng)。單抗2E12和3E5均不與登革熱病毒發(fā)生交叉反應(yīng)。進(jìn)一步證明了單克隆抗 體能特異性結(jié)合HCVNS蛋白。為評(píng)估高度保守性表位與HCV感染性樣品中抗體反應(yīng)的潛在優(yōu)勢(shì)，通過Peptide-ELISA 方法,用含有表位EP05的長肽P05和含有表位EP21的長肽P21 對(duì)136份HCV感染性血液樣品(86份慢性感染：RNA+/Ab+;50份

14、自然康復(fù):RNA-/Ab+)和128份健康者血液樣品(RNAJAb-)進(jìn)行篩查。根據(jù)長肽與健康者血 樣反應(yīng)結(jié)果,通過計(jì)算mean+2SD得到Cut-Off值分別為0.267(P05)和 0.298(P21) 。以此計(jì)算P05和P21與慢性感染樣品反應(yīng)的陽性率分別為 79.1%和 59.3%,顯著高于與自然康復(fù)性樣品反應(yīng)的陽性率58%和 30%(P&It;0.001)。以P05和P21 分別與 214份血樣(86 份慢性感染樣品和 128份健康獻(xiàn)血者樣品 ),178 份血樣(50 份自然康復(fù)性樣品和 128份健康獻(xiàn)血者樣品 ),264 份全部樣品(86 份慢性感染樣 品、50份自然康復(fù)性樣品和1

15、28份健康獻(xiàn)血者樣品)的ELISA結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)結(jié) 果進(jìn)行符合率比較,繪制ROC線。結(jié)果示,P05和P21與214份血樣反應(yīng)曲線下面積分別為 0.930、0.859 ;0.843、P05 ,P21與178份自然康復(fù)性感染和健康人血清反應(yīng)的曲線下面積分別為0.782 ; P05,P21與264份全部血清反應(yīng)的曲線下面積分別為0.898、0.830。兩 條多肽對(duì)于診斷HCV均具有顯著意義(P<0.001)。P05、 P21 兩個(gè)表位多肽與常規(guī)法檢測(cè)結(jié)果的符合率分別為73%、 88%,是 HCV 的兩個(gè)優(yōu)勢(shì)抗原表位。 由上述結(jié)果及分析可知 ,單抗 2 E 1 2識(shí)別表位覆蓋了解旋酶 區(qū)域I的A

16、TP結(jié)合位點(diǎn)，這樣抗體與表位的結(jié)合就有可能對(duì)解旋酶的功能造成影 響。為了對(duì)此進(jìn)行研究 , 我們?cè)隗w外進(jìn)行解旋酶活性功能實(shí)驗(yàn)。按不同濃度將高 純度4b型重組全長NS3蛋白(FL4b-rNS3)與DNA底物混合，F(xiàn)L4b-rNS3發(fā)揮解旋 功能,將雙鏈DNA解旋為單鏈,釋放FAM熒光。儀器通過對(duì)熒光的檢測(cè)，來評(píng)估解旋酶的效率。結(jié)果示：隨著 FL4b-rNS3濃 度的增加,解旋效率越高。根據(jù)解旋酶活性功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果,將適當(dāng)濃度的mAb2E1環(huán)口一株非相關(guān)抗體 (作為陰性對(duì)照)分別與FL4b-rNS3預(yù)孵育后的混合物加入到 DNA底物中。通過熒 光檢測(cè)結(jié)果,可以發(fā)現(xiàn)mAb2E1訓(xùn)以對(duì)FL4b-rNS3解旋酶活性起到一定的抑制作 用(P=0.003),使解旋活性降低大約50%,而對(duì)照抗體則不具有抑制性(P=0.239)。由此可以推測(cè)出,mAb2E12可能起到HCVS旋酶抑制劑的作用,進(jìn)而有可能影響到HCV病毒復(fù)制。但是由于FL4b-rNS3蛋白不能達(dá)到相對(duì)高的純度,使蛋白污 染了少量的宿主細(xì)胞的解旋酶。這種污染會(huì)對(duì)雙鏈DNA起到一定的解旋作用,產(chǎn)生單鏈DNA釋放熒光,干擾 體外抑制試驗(yàn)結(jié)果。為了避免其他解旋酶的污染,精確驗(yàn)證mAb2El2勺抑制功能, 我們將在下一步的實(shí)驗(yàn)研究中進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)的解旋酶功能實(shí)驗(yàn) , 即把重組 mAb2E12 的病毒載體轉(zhuǎn)染到穩(wěn)定復(fù)制HCV勺H