第一法大腸菌群MPN 計數(shù)（精品課件）

1、第一法大腸菌群MPN 計數(shù) 操作步驟 6.1、樣品的稀釋6.1。1、 固體和半固體樣品:稱取25g 樣品，放人盛有225ml磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi)，8 00or/min-10 000r/min 均質(zhì)1 min2 min ,或放人盛有225ml磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)袋中,用拍擊式均質(zhì)器拍打1 min-2 min ，制成1：10 的樣品勻液。6.1.2、 液體樣品:以無菌吸管吸取25ml樣品，置盛有225ml磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶(瓶內(nèi)預(yù)置適當數(shù)量的無菌玻璃珠）中,充分棍勻，制成1：10 的樣品勻液.6。1.3、 樣品勻液的pH 值應(yīng)在6。57。5 之間,必要時

2、分別用1mol/L 氫氧化鈉(NaOH ）或1 mol/L 鹽酸(HCI )調(diào)節(jié)。6.1。4、 用1ml無菌吸管或微量移液器吸取1：10 樣品勻液1ml,沿管壁緩緩注人9ml磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用1 支1ml無菌吸管反復(fù)吹打，使其混合均勻，制成1:100 的樣品勻液。6.1.5、 根據(jù)對樣品污染狀況的估計，按上述操作，依次制成10 倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1 次，換用1 支1ml無菌吸管或吸頭.從制備樣品勻液至樣品接種完畢，全過程不得超過15 min 。6。2、 初發(fā)酵試驗每個樣品,選擇3 個適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液

3、（液體樣品可以選擇原液），每個稀釋度接種3 管月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯，每管接種1ml（如接種量超過1ml，則用雙料LST肉湯)， 361 培養(yǎng)24hZh ，觀察倒管內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生，如未產(chǎn)氣則繼續(xù)培養(yǎng)至48h2h 。記錄在24h 和48h 內(nèi)產(chǎn)氣的LST 肉湯管數(shù)。未產(chǎn)氣者為大腸菌群陰性，產(chǎn)氣者則進行復(fù)發(fā)酵試驗。6。3、 復(fù)發(fā)酵試驗用接種環(huán)從所有48h2h 內(nèi)發(fā)酵產(chǎn)氣的LST 肉湯管中分別取培養(yǎng)物l環(huán),移種于煌綠乳糖膽鹽（ BGLB)肉湯管中,361 培養(yǎng)48h2h ,觀察產(chǎn)氣情況。產(chǎn)氣者，計為大腸菌群陽性管。6。4、 大腸菌群最可能數(shù)（MPN ）的報告根據(jù)大腸菌群陽性管數(shù)，檢索M

4、PN 表（見附錄B ） ,報告每克（或毫升）樣品中大腸菌群的MPN 值. 第二法大腸菌群平板計數(shù) 8、 操作步驟 8.1、 樣品的稀釋按6。1 進行。8.2、 平板計數(shù)8.2.1、 選取2 個3 個適宜的連續(xù)稀釋度,每個稀釋度接種兩個無菌平皿,每皿1ml。同時分別取1ml生理鹽水加人兩個無菌平皿作空白對照。8.2。2、 及時將15 mL20ml冷至46 的結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂(VRBA ）約傾注于每個平皿中。小心旋轉(zhuǎn)平皿,將培養(yǎng)基與樣液充分混勻，待瓊脂凝固后，再加3 mL-4mlVRBA 覆蓋平板表層。翻轉(zhuǎn)平板,置于36l 培養(yǎng)18h-24h 。8。3、 平板菌落數(shù)的選擇選取菌落數(shù)在30150

5、 之間的平板，分別計數(shù)平板上出現(xiàn)的典型和可疑大腸菌群菌落。典型菌落為紫紅色，菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán),菌落直徑為0.5 mm 或更大。8。4、 證實試驗從VRBA 平板上挑取10 個不同類型的典型和可疑菌落，分別移種于BGLB 肉湯管內(nèi)，361 培養(yǎng)24h48h ，觀察產(chǎn)氣情況.凡BGLB 肉湯管產(chǎn)氣，即可報告為大腸菌群陽性。8。5 、大腸菌群平板計數(shù)的報告經(jīng)最后證實為大腸菌群陽性的試管比例乘以8.3 中計數(shù)的平板菌落數(shù)，再乘以稀釋倍數(shù)，即為每克(或毫升）樣品中大腸菌群數(shù)。 。.。.。文檔交流第三法大腸菌群PetrifilmTM 測試片法10、 操作步驟 10。1 樣品的稀釋按6.1 進行。

6、10。2、 測定10.2。1、 樣品接種及培養(yǎng)將待檢樣品選取2 個3 個適宜的連續(xù)稀釋度，每個稀釋度接種兩張測試片.將PetrifilmTM 大腸菌群測試片置于平坦實驗臺面，揭開上層膜，用吸管吸取1ml樣液垂直滴加在測試片的中央,將上層膜緩慢蓋下,避免氣泡產(chǎn)生和上層膜直接落下。把壓板（平面底朝下)放置在上層膜中央，輕輕地壓下，使樣液均勻覆蓋于圓形的培養(yǎng)面積上,切勿扭轉(zhuǎn)壓板.拿起壓板，靜置至少1 min 以使培養(yǎng)基凝固。將測試片的透明面朝上置于培養(yǎng)箱內(nèi)，堆疊片數(shù)不超過20片,361 培養(yǎng)24h2h 。10.2。2、 判讀培養(yǎng)24hZh 后應(yīng)立即計數(shù)，可目測或用標準菌落計數(shù)器、放大鏡或Petrif

7、ilmTM 自動判讀儀來計數(shù).紅色有氣泡的菌落確認為大腸菌群。圓形培養(yǎng)區(qū)邊緣上及邊緣以外的菌落不作計數(shù)。當培養(yǎng)區(qū)域出現(xiàn)大量氣泡,大量不明顯小菌落或培養(yǎng)區(qū)呈暗紅色三種情況，表明大腸菌群的濃度較高，需要進一步稀釋樣品以獲得更準確的讀數(shù)。10.3、 大腸菌群測試片計數(shù)的報告選取菌落數(shù)在15150 之間的測試片，計數(shù)其紅色有氣泡的菌落數(shù)，兩個測試片的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)即為每克(或毫升)樣品中的大腸菌群菌落形成單位（CFU ）數(shù)。如果所有稀釋度測試片上的菌落數(shù)都小于15 ，則計數(shù)稀釋度最低的測試片上的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告；如果所有稀釋度的測試片上均無菌落生長，則以小于1 乘以最低稀釋倍數(shù)報告；如果最高稀釋度的菌落數(shù)大于150 ，計數(shù)最高稀釋度的測試片上的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告.計數(shù)菌落數(shù)大于150 的測試片時，可計數(shù)一個或兩個具有代表性的方格