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1、藥物MTT實驗步驟(貼壁細胞)-個人改進版1. 邊緣孔用無菌PBS充填。收集對數(shù)期細胞,調(diào)整細胞懸液濃度為50000個/ml , 每孔加入100ul細胞懸液(每孔5000個細胞)。注:每次加入細胞都使槍頭貼著孔底邊緣 (最好相同位置),緩慢加入100ul 細胞懸液??准尤腠樞颍嚎蓮纳系较?,從左到右依次加入。為了保證細胞密度均勻,最好每加3-5列細胞混勻一下細胞懸液,避免因 重力沉降導(dǎo)致細胞密度不均。每塊96孔板加完細胞后,應(yīng)拿起板子 前后左右水平搖晃幾下(勿旋轉(zhuǎn)搖 晃),使細胞均勻分散。一般設(shè)6個復(fù)孔(B-G行),對照孔非常重要,且變異大,故設(shè) 2列(2, 3列為對照孔),4-10或4-11列
2、為給藥孔。邊緣孔用無菌PBS充填,2-11列均可加入細胞。因為要設(shè)置調(diào)零孔(即 不加細胞孔),所以可將第11列設(shè)為調(diào)零孔,也可將第12列的無菌PBS孔在第 2天加藥時改為調(diào)零孔。2. 細胞放入培養(yǎng)箱培養(yǎng),待貼壁后第二天給藥(通常前一天下午或晚上鋪板,第2天上午給藥)。給藥方法:先配好藥(用EP管配好藥),再拿出96孔板, 棄去原有培養(yǎng)液(可不用PBS洗,太麻煩了),加入藥物。注:MTTto藥時都是先配藥再棄去原培養(yǎng)液,最后加入藥物。切勿先棄去原有 培養(yǎng)液再配藥,因為配藥一般要花較長時間,若先棄去培養(yǎng)液再配藥會導(dǎo)致細胞 無營養(yǎng)液體而死亡。藥物是用母液溶于無血清培養(yǎng)基配成工作液 ,事先算好對照孔,
3、藥物孔, 調(diào)零孔如何配制,如何設(shè)置加藥順序。一般越靠中央的孔變異越小,故最重要的 給藥孔一般放在最中間,次要孔放邊緣,調(diào)零孔可用第11或12列。如果某個給藥孔需加入2種藥物,一般需要一種藥物先預(yù)處理1-2h (預(yù) 處理藥物可用Ep管配好后再分別加入各孔),1-2h再加入另一種藥物(直接加 入各孔)。3. 細胞放入培養(yǎng)箱 培養(yǎng)24h (或其他指定時間)。4. 藥物作用結(jié)束后,每孔加入20ul-MTT (避光)(5mg/ml),培養(yǎng)3-4h。若藥 物能與MTT反應(yīng),可先棄去原培養(yǎng)液,再加入含 MTT的培養(yǎng)液(無血清培養(yǎng)液: MTT=5 1 配制)。注:MTT使用前預(yù)先解凍。MTT對光敏感,故一般保存于負20E,配好 5mg/mlMTT后我習(xí)慣分裝于EP管中。5. 終止培養(yǎng),小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加入 150ul-DMSO (DMS可預(yù)先算好 所需體積加入15ml離心管中),37C溫箱孵育10分鐘或搖床低速振蕩10分鐘。 之后用酶標儀檢測OD-490nm (也有測570nm的)各孔的吸光度(A)值。6. 同時設(shè)置調(diào)零孔(無血清培養(yǎng)基,MTT, DMSO,對照孔(細胞,最大濃度的藥物溶解介質(zhì),無血清培養(yǎng)基,MTT, DMSO 。7. 細胞活力(cell viability):細胞活力(cell viability of contr
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