【2019年整理】發(fā)酵染菌原因分析

1、發(fā)酵染菌原因分析 第一部分：基礎(chǔ)知識 1）雜菌的類型 空氣中的微生物大多數(shù)是細(xì)菌和芽孢 ,還有一定數(shù)量的霉菌、 酵母和病毒。 細(xì)菌的大小有 零點(diǎn)幾微米至幾個(gè)微米 . 根據(jù)以上特點(diǎn)我們應(yīng)得出如下結(jié)論： A ：這些微生物在空氣中極少單獨(dú)游離存在 ,基本上是附著于灰塵、液滴等微粒的表面上。 B:介質(zhì)過濾除菌就是把空氣中的各種微粒和極少量的游離微生物捕集起來予以除掉。 因此我們通常所用的空氣過濾器為什么 0.3u 可以保證無菌發(fā)酵生產(chǎn)的原因。 2）無菌檢查與染菌的處理 在抗生素生產(chǎn)過程中 ,為了及早發(fā)現(xiàn)染菌并進(jìn)行恰當(dāng)處理 ,保證生產(chǎn)正常進(jìn)行 , 對菌種制 備、種子罐、發(fā)酵罐的接種前后和培養(yǎng)過程中 ,須

2、要按工藝規(guī)程要求按時(shí)取樣， 進(jìn)行無菌檢驗(yàn)。 A :無菌檢查 培養(yǎng)液是否污染雜菌可從三個(gè)方面進(jìn)行分析: a:無菌試驗(yàn) b:培養(yǎng)液的顯微鏡拉查 c:培養(yǎng)液的生化指標(biāo)變化情況。 其中無菌試驗(yàn)是判斷染菌的主要依據(jù)。 無菌試驗(yàn) 現(xiàn)在采用的無菌試驗(yàn)方法有肉湯培養(yǎng)法、雙碟培養(yǎng)法、斜面培養(yǎng)法。其中以酚紅肉湯培 養(yǎng)法和雙碟培養(yǎng)法結(jié)合起來進(jìn)行無菌檢查用的較多。 （1）肉湯培養(yǎng)法 直接用裝有酚紅肉湯的無菌試管取樣 ，然后放入37C恒溫室（箱）內(nèi)培 養(yǎng)。定時(shí)觀察試管內(nèi)肉湯培養(yǎng)基的顏色變化 ,同時(shí)進(jìn)行顯微鏡觀察。 （2）斜面培養(yǎng)法 先用空白無菌試管取樣 ,然后在無菌條件下接種于斜面培養(yǎng)基上 ,置于 37C恒溫室（箱）內(nèi)

3、培養(yǎng)。定時(shí)觀察有無雜菌菌落生長。 （3） 雙碟培養(yǎng)法 種子罐樣品先取入肉湯培養(yǎng)基中 ,然后在無茵條件下在雙碟培養(yǎng)基上 面劃線,剩下的肉湯培養(yǎng)物在恒溫室 （箱）內(nèi)培養(yǎng) 6小時(shí)后復(fù)劃線一次 ,發(fā)酵罐培養(yǎng)液直接取入空 白無菌試管中,于37C下培養(yǎng)6小時(shí)后在雙碟培養(yǎng)基上劃線。24小時(shí)內(nèi)的雙碟定時(shí)在燈光下 檢查有無雜菌生長。 24小時(shí)48小時(shí)的雙碟 1 天檢查一次 ,以防生長緩慢的雜菌漏檢。正常生 產(chǎn)過程中 ,種子罐和發(fā)酵罐每隔 8小時(shí)取樣一次 ,進(jìn)行無菌檢查。該方法經(jīng)常用于單菌落挑選， 可以從染有雜菌的培養(yǎng)液中經(jīng)多次劃線挑取單菌落進(jìn)行分離培養(yǎng)，得到純種的種子。 無菌試驗(yàn)的結(jié)果一般需要 812 小時(shí)才能

4、作出判斷。為了縮短判斷時(shí)間 ,有時(shí)向培養(yǎng)基中 加入赤霉素、對氨基苯甲酸等生長激素以促進(jìn)雜菌的生長。 B:染菌的判斷 培養(yǎng)基的染菌判斷是錯(cuò)綜復(fù)雜的工作 ,又是一種細(xì)微觀察、認(rèn)真分析的王作。 染菌罐的判斷方法: 以無菌試驗(yàn)中的酚紅肉湯培養(yǎng)和雙碟培養(yǎng)的反應(yīng)為主,以鏡檢為輔。每個(gè)無菌樣品的無菌 試驗(yàn)，至少用 2 只酚紅肉湯或斜面同時(shí)取樣培養(yǎng)。要定量或用接種環(huán)蘸取法取樣，公司現(xiàn)階 段基本都直接從發(fā)酵罐直接取樣。因取樣量不同 ,影響顏色反應(yīng)和渾濁程度的觀察。如果連續(xù) 3 個(gè)時(shí)間的酚紅肉湯無菌樣發(fā)生顏色變化或產(chǎn)生渾濁 ,或斜面連續(xù) 3 個(gè)時(shí)間樣品長出雜菌即判 斷為染菌。有時(shí)酚紅肉湯反應(yīng)不明顯 ,要結(jié)合鏡檢確

5、認(rèn)連續(xù) 3 個(gè)時(shí)間樣品染菌，即判為染菌。 各級種子罐的染菌判斷亦參照上述規(guī)定。 對肉湯和無菌斜面的觀察及保存期的規(guī)定 ,發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌后應(yīng)取無菌樣，以后每隔 8 小 時(shí)取無菌樣一次，直至放罐。無菌試驗(yàn)的肉湯和雙碟應(yīng)保存并觀察至本罐批放罐后 12 小時(shí)， 確認(rèn)無雜菌污染后方可棄去。無菌檢查時(shí)間應(yīng)每 6 小時(shí)觀察一次無菌試驗(yàn)樣品，以便能及早 發(fā)現(xiàn)染菌。 2、染茵率的統(tǒng)計(jì) 以發(fā)酵罐染菌罐批 （次）為基準(zhǔn), 染菌罐批 （次）應(yīng)包括染菌重消后的重復(fù)染菌的灌（批）次 在內(nèi)。發(fā)酵總過程 （全周期 ）無論前期或后期染菌 ,均作“染菌”論處。 發(fā)酵罐染菌罐批 （次 ） 染菌率（% ） =X100% 總投罐批 （

6、次） 3）染菌 （包括染噬菌體 ）的處理 （一）污染雜菌的處理 發(fā)酵罐污染雜菌后 ,依據(jù)染菌時(shí)間、 所染雜菌的危害性及時(shí)進(jìn)行處理 ,同時(shí)對所涉及的設(shè)備 也要及時(shí)處理。 a. 種子罐染菌的處理 種子罐染菌后都不能往下道工序移種 ,要及時(shí)用高壓蒸汽直接滅菌后經(jīng)過濾處理放下水。 b. 發(fā)酵罐染菌的處理 發(fā)酵罐前期染菌 ,污染的雜菌對產(chǎn)生菌的危害性大 ,采用蒸汽滅菌經(jīng)過濾處理后放掉 ;如果 危害性不大 ,可用重新滅菌、重新接種的方式處理 ,如營養(yǎng)成分消耗較多 ,可放掉部分培養(yǎng)液補(bǔ) 入部分新培養(yǎng)基后進(jìn)行滅菌 ,重新接種；如污染的雜菌量少且生長緩慢 ,可以繼續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)下去 ,但 要時(shí)刻注意雜菌數(shù)量和代謝的變化

7、。 在發(fā)酵的中后期染菌 ,一是加入適量的殺菌劑 ,如呋喃西林 或某些抗生素 ,抑制雜菌的生長。二是降低培養(yǎng)溫度或控制補(bǔ)料量來控制雜菌的生長速度。如 果采用上述兩種措施仍不見效 ,就要考慮提前放罐。 c. 染菌后的設(shè)備處理 . 染菌后的罐體用甲醛等化學(xué)物質(zhì)處理 ,再用蒸汽滅菌包括各種附屬設(shè)備 。在再次投料 之前,要徹底清洗罐體、附件 ,同時(shí)進(jìn)行嚴(yán)密程度檢查 ,以防滲漏。染菌后的處理尤為重要，很 多大面積染菌都是由于處理不徹底而造成的系統(tǒng)污染，造成無法及時(shí)處理好各個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)連 續(xù)污染。 （二）污染噬菌體的處理 抗生素等產(chǎn)品發(fā)酵過程中有時(shí)出現(xiàn)噬菌體污染,輕者造成生產(chǎn)能力大幅度下降 ,重者造成停產(chǎn)。

8、一般噬菌體污染后往往出現(xiàn)發(fā)酵液突然轉(zhuǎn)稀，泡沫增多，早期鏡檢發(fā)現(xiàn)菌體染色不均勻，在 較短時(shí)間內(nèi)菌體大量自溶，最后僅殘留菌絲斷片，平皿培養(yǎng)出現(xiàn)典型的噬菌斑，溶氧濃度回升提 前，營養(yǎng)成分很少消耗，產(chǎn)物合成停止等現(xiàn)象。 發(fā)酵過程中污染噬菌體后，一般做如下處理： 1發(fā)酵液用高壓蒸汽滅菌后放掉，嚴(yán)防發(fā)酵 液任意流失；2.全部停產(chǎn)，對環(huán)境進(jìn)行全面的清洗和消毒，斷絕噬菌體的寄生基礎(chǔ)；3.更換生產(chǎn) 菌種，不斷篩選抗噬菌體菌種，防止噬菌體的重復(fù)污染。 污染烈性噬菌體時(shí)出現(xiàn)上述現(xiàn)象。如果污染溫和噬菌體時(shí)，其反應(yīng)溫和，平皿培養(yǎng)不出現(xiàn)明 顯的噬菌斑，只出現(xiàn)部分菌體自溶，生化指標(biāo)變化不顯著，生產(chǎn)能力降低，對生產(chǎn)的危害亦是

9、嚴(yán)重 的,但不易被發(fā)現(xiàn)。防止溫和噬菌體污染的方法同上所述。 第二部分：染菌原因分析 染菌是發(fā)酵工業(yè)的大敵，不制服染菌就不能實(shí)現(xiàn)優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)。在抗生素發(fā)酵生產(chǎn)中造成發(fā)酵 染菌的原因很多，分析染菌的原因是很困難的。但在眾多的原因分析中，從人、機(jī)、料、法、 環(huán)各個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行細(xì)致的分析.從多方面查找原因，查出雜菌的來源，采取相應(yīng)措施予以制服。 一、染菌原因的分析。 染菌的途徑多，表現(xiàn)的現(xiàn)象多樣。因而追查雜菌的來源是困難的，從現(xiàn)有的經(jīng)驗(yàn)可從下述幾 千方面進(jìn)行分析。 （一）從染菌的規(guī)模和時(shí)間分析 在發(fā)酵過程中，如果是種子罐和發(fā)酵罐同時(shí)大面積染菌 ，雜菌的主要來源可能是空氣凈化 系統(tǒng),如空氣過濾器失效或空氣管道滲

10、漏造成的。其次考慮種子制備工序。如果只是發(fā)酵罐大 面積染菌，除考慮空氣凈化系統(tǒng)帶菌外，還要重點(diǎn)考查接種管道、補(bǔ)料系統(tǒng)。發(fā)酵培養(yǎng)基采用連 續(xù)滅菌工藝時(shí),還要嚴(yán)格檢查連消系統(tǒng)是否帶入雜菌。 如果是部分發(fā)酵罐在發(fā)酵早期染菌，可能是培養(yǎng)基滅菌不徹底，或種子罐帶菌，或接種管道 滅菌不徹底造成的。如果是發(fā)酵的中后期染菌，重點(diǎn)分析補(bǔ)料系統(tǒng)和加消沫劑系統(tǒng)，個(gè)別發(fā)酵 罐連續(xù)染菌,就從單個(gè)罐體查找雜菌來源，如罐內(nèi)是否有“死角”或冷卻系統(tǒng)有滲漏。當(dāng)然還要 檢查附件，個(gè)別罐批的散在性染菌，其原因很難追查，要具體情況具體分析。 （二）從雜菌類型分析 發(fā)酵過程染菌，多種菌型出現(xiàn)的機(jī)率多，單菌型機(jī)率較少。染的是耐熱芽抱桿菌

11、時(shí)，這與培 養(yǎng)基滅菌不徹底或設(shè)備內(nèi)部有“死角”關(guān)系甚大?？諝庵幸泊嬖谘勘U菌 ，污染的雜茵是不耐 熱的球菌或桿菌時(shí)，可從空氣凈化系統(tǒng)和冷卻系統(tǒng)進(jìn)行追查。 二、制服染菌的要點(diǎn) 從表5-4的抗生素發(fā)酵染菌原因分析的統(tǒng)計(jì)資料看，空氣凈化系統(tǒng)帶菌是導(dǎo)致染菌的主 要因素。但仔細(xì)分析,設(shè)備穿孔和滲漏等造成的染菌占33.85%，占第1位。 表54染菌原因的系統(tǒng)分析 染菌原因 所占百分比， 染菌原因 所占百分比,% 1種子帶菌或懷疑種子帶菌 9.64 8.接種管穿孔。 0.29 2接種時(shí)罐壓降至大氣壓力 0.19 9.閥門泄漏 1.45 3.精養(yǎng)基消毒不透 0.791 10.攪拌軸封的泄漏 2.09 4總空氣

12、系統(tǒng)帶菌 1 .96 11.罐蓋泄漏 1.54 5泡沫升至罐頂 0.48 12.其它設(shè)備泄漏 10.13 6央套穿孔 12.36 13.操作問題 10.15 7蛇管穿孔 5.89 14.原因不明 24.91 據(jù)已有的制服染菌經(jīng)驗(yàn)，對發(fā)酵過程中涉及的空氣凈化系統(tǒng)、設(shè)備系統(tǒng)、蒸汽質(zhì)量、工藝 操作提出下述要求。 1對空氣凈化系統(tǒng)的要求 防止空氣凈化系統(tǒng)帶菌的主要措施有提高空氣進(jìn)口的空氣潔凈度；除盡壓縮空氣中夾帶 的油和水,保持過濾介質(zhì)的除菌效率?，F(xiàn)在公空氣系統(tǒng)應(yīng)該有了很大的進(jìn)步，不存在油的問題， 但在夏秋兩季，由于空氣濕度較大可能出現(xiàn)預(yù)過濾器放出水的現(xiàn)象，因此各個(gè)車間應(yīng)根據(jù)車 間情況，定時(shí)放水。另外

13、，在過濾器滅菌時(shí)要防止過濾介質(zhì)被沖翻或燒灼，還要防止發(fā)酵液倒流 入空氣過濾器內(nèi)。 2對蒸氣的要求 首先要重視蒸汽質(zhì)量，一般采用飽和蒸汽，嚴(yán)格控制蒸汽中的含水量，按照不同滅茵工藝要 求提供穩(wěn)定的蒸汽壓力，滅菌過程中蒸汽壓力不可以大幅度的波動，以保證滅菌質(zhì)量，我公司蒸 汽情況是過熱蒸汽，希望熱電車間在處理蒸汽的時(shí)候保證蒸汽噴水的均勻性。 3.對設(shè)備的要求 發(fā)酵罐及其附屬設(shè)備應(yīng)做到無“滲漏”，無“死角”。凡與物料、空氣、下水道連接的管 件閥門應(yīng)保證嚴(yán)密不漏，蛇管和夾層應(yīng)定期試漏。連續(xù)滅菌設(shè)備要定時(shí)拆卸清洗。無菌操作室 和菌種培養(yǎng)間定期消毒，以保持無菌狀態(tài)。 4對工藝操作的要求 發(fā)酵罐放罐之后，對罐體

14、和附屬設(shè)備進(jìn)行全面清洗和檢查，清除罐內(nèi)的殘?jiān)?，除盡罐壁上的 污垢,清除罐內(nèi)附件處的堆積物。 配制培養(yǎng)基時(shí)要防止物料結(jié)塊或帶入異物，配料罐和輸送料液系統(tǒng)要定時(shí)清洗消毒。 在實(shí)罐滅菌、空罐滅菌、培養(yǎng)基連續(xù)滅菌、各種管道的滅菌等的操作過程中，要嚴(yán)格執(zhí)行 工藝規(guī)程要求。滅菌中要保證蒸汽暢通，保證蒸汽壓力與溫度的對應(yīng)關(guān)系。這里重點(diǎn)強(qiáng)調(diào)一下 關(guān)于假壓力的問題，保證空氣排盡，注意分配主進(jìn)汽，付進(jìn)汽。 菌種組的工作人員要嚴(yán)格按工藝規(guī)程制備生產(chǎn)種子。對進(jìn)入無菌室的全部物料、器械實(shí) 行滅菌。堅(jiān)持無菌間和無菌操作人員的菌落檢測制度。 發(fā)酵過程的無菌檢查工作，要嚴(yán)密取樣操作，力求減少取樣和平皿劃線時(shí)的操作誤差。嚴(yán)格

15、鏡檢崗位的操作要求，降低無菌檢查中的錯(cuò)判與誤判。發(fā)酵染菌罐批，及時(shí)查明雜菌來源，并采 取相應(yīng)措施予以處理， 對空氣凈化系統(tǒng)、補(bǔ)料系統(tǒng)、轉(zhuǎn)種系統(tǒng)等要嚴(yán)格管理 ，加強(qiáng)無菌檢查。 第三部分：滅菌的對數(shù)殘留定律 1實(shí)消滅菌的時(shí)間計(jì)算：t=2.303/klogNo/Ns t滅菌時(shí)間秒 k-速度常數(shù)，1/秒與滅菌采用的溫度和菌的種類有關(guān) N o-開始滅菌時(shí)原有菌個(gè)數(shù) Ns-結(jié)束滅菌時(shí)菌個(gè)數(shù) 2）2）連續(xù)滅菌的時(shí)間計(jì)算：t=2.303/klogCo/Cs t滅菌時(shí)間秒 k-速度常數(shù)，1/秒與滅菌采用的溫度和菌的種類有關(guān) Co-開始滅菌時(shí)每毫升原有菌個(gè)數(shù) Cs-結(jié)束滅菌時(shí)每毫升菌個(gè)數(shù) 第四部分：空氣過濾器膜的

16、介紹 分離機(jī)理：氣體一阻留、沉積、擴(kuò)散、攔截、靜電 膜材料：醋纖一三醋纖、磺化聚砜、磺化聚醚砜、芳香聚酰胺、陶瓷 供應(yīng)廠商：PAUL DH MILIPOR 上海過濾器廠 上海一鳴 MF分類一膜 材料 金屬膜，金屬合金膜，高分子膜，高分子合金膜，陶瓷膜 型式 板狀膜，管狀膜一毛細(xì)管狀、多通道管狀、圓管狀 制法 相轉(zhuǎn)化，膨化拉伸，燒結(jié)，核跡一刻蝕，溶膠一凝膠 特性 親水膜，疏水膜，耐腐蝕膜，耐高溫膜，高強(qiáng)度膜 效率 絕對過濾膜，公稱過濾膜，預(yù)過濾膜 孔型 絕對過濾膜，公稱過濾膜，預(yù)過濾膜 25 膜過濾一一微濾（MF ） MF評價(jià) 膜評價(jià) 內(nèi)因 孔結(jié)構(gòu)，孔徑及其分布，孔隙率 外因: 耐熱性，耐化學(xué)品

17、腐蝕性，機(jī)械強(qiáng)度 器評價(jià) 可靠性 精度，效率，耐溫性，耐化學(xué)品腐蝕性，親疏水性，機(jī)械強(qiáng)度 經(jīng)濟(jì)性 通量，購買成本，更換頻率 內(nèi)因與精度、效率、通量關(guān)聯(lián)，外因與使用環(huán)境關(guān)聯(lián)。 技術(shù)關(guān)鍵：（1）膜無缺陷制作工藝，（2）器無損傷制作工藝，（3）正確的評價(jià)方法。 MF膜評價(jià)一孔徑及其分布 方法 *氣泡點(diǎn)法，汞壓入法，流速 法 原理 :毛細(xì)管模型（常規(guī)） 孔板模型（YM專有技術(shù)） 模型 算式 r =4k 6 cos 0 /p r =4k 6 cos 0 /5p r-孔徑，k修正系數(shù)， 6測試液表面張力， 0 膜材料與測試液接觸角， p起泡點(diǎn)壓力 分布類型 左傾斜，對稱（正態(tài)分布），右傾斜 28 MF膜評

18、價(jià)一耐熱性 膜材質(zhì) PTFE PVDF PES N6 CA-CN Ni SS 長期使用最高溫度 ：80 ：80 80 70 60 250 400 短期蒸汽消毒溫度 142 138 130 121 121 350 600 MF膜評價(jià)一耐化學(xué)品腐蝕性 實(shí)驗(yàn)法：溶劑中浸泡24hr，其泡點(diǎn)下降v 10%，通量下降v 20%，則可定義為膜能耐該種溶 劑。 MF組件評價(jià)一過濾精度與效率試驗(yàn)方法 完整性試驗(yàn)：破壞性實(shí)驗(yàn)，非破壞性實(shí)驗(yàn) 破壞性實(shí)驗(yàn)：細(xì)菌實(shí)體試驗(yàn)，雜質(zhì)實(shí)體試驗(yàn) 非破壞性實(shí)驗(yàn)：流量擴(kuò)散試驗(yàn)，氣泡點(diǎn)試驗(yàn)，壓力保持試驗(yàn)，油霧實(shí)體試驗(yàn) MF組件評價(jià)一常見評價(jià)法 方法 擴(kuò)散流法 壓力衰減法 油霧法 泡點(diǎn)法

19、 原理 :Fick定律 道爾頓定律 類比原理 You ng方程 類型 間接 間接 直接 間接 研究 對象 以流經(jīng)膜的氣體 量為考查對象， 來評價(jià)膜孔大 小,推算過濾精 度、效率 以膜前氣體壓力 的變化為考查對 象，來評價(jià)膜孔 大小，推算過濾 精度、效率 以油霧粒子在過 濾前后數(shù)量（重 量）變化為考查對 象，來計(jì)算過濾精 度、效率 以膜濕潤后冒出氣 泡時(shí)的壓力為考查 對象，來評價(jià)膜孔 大小，推算過濾精 度、效率 局限 性 不完全適用于氣 體 不完全適用于氣 體 不完全適用于液 體 不完全適用于組件 MF過濾機(jī)理一氣體 機(jī)理 意義 直接阻留 膜使所有比膜孔徑大的粒子全部阻留在截留表層上 慣性沉積

20、微粒有足夠的慣性力，使它不能隨流線繞過膜而被阻留 扌二集截留 微粒慣性較小時(shí)，雖能隨流線運(yùn)動，但幾乎完全沉沒在環(huán)繞膜 體的粘性流中，由于粘性流足夠的慢而使顆粒被留下 擴(kuò)散截留 微粒由于布朗運(yùn)動而從流線中游離出來，經(jīng)碰撞膜體而被阻留 靜電截留依靠微粒與膜體間實(shí)有的或誘導(dǎo)的靜電力，使微粒撞擊到膜體 上被捕集 圖片： 產(chǎn)品名稱： 玻纖披覆氟聚物微孔濾膜 (HFGF) 產(chǎn)品特點(diǎn)： *纖維表面經(jīng)氟聚物處理* 集纖維與膜的過 產(chǎn)品參數(shù)： 尺寸：280Xx mm F-. 產(chǎn)品型號： F-B、E 材質(zhì)結(jié)構(gòu)： 氟聚物(HF)，玻璃纖維(GF) 使用說明： 請垂詢一鳴公司 第五部分：查找染菌原因的深層次分析案例

21、大觀霉素發(fā)酵生產(chǎn)的染菌率較低。個(gè)別發(fā)酵罐染菌后，生長代謝所受影響也較小，大 多能正常周期放罐，發(fā)酵單位所受損失也不大。99年出現(xiàn)的幾批染菌罐卻表現(xiàn)出了很大異常: 確定染菌后，發(fā)酵罐PH開始急劇下降，糖耗快，氨氮降低，發(fā)酵單位開始下滑，只能提前 放罐。嚴(yán)重影響正常。本文從染菌原因分析，給制服無菌提供了一個(gè)新思路，為國內(nèi)抗生素 生產(chǎn)廠家對制服染菌有借鑒作用。 為找清染菌原因，從染菌罐分離出雜菌，考察其培養(yǎng)特性，做耐熱實(shí)驗(yàn)。然后根據(jù)這 種菌在發(fā)酵培養(yǎng)基中的生長速度，推算出雜菌進(jìn)入發(fā)酵罐的時(shí)間，最終確定了染菌原因，并 采取了相應(yīng)的措施，制服了這次染菌。現(xiàn)將這次染菌的原因分析及相應(yīng)的對策介紹如下。 一：

22、染菌特征 1：發(fā)酵罐培養(yǎng)至 50 小時(shí)左右， 33 小時(shí)后的無菌肉湯跟蹤樣開始變色，確認(rèn)染菌。此 后，發(fā)酵罐 PH 開始急劇下滑，糖耗快，氨氮下降，發(fā)酵單位停止增長， 60小時(shí)左右提 前放罐。 2：變色肉湯涂片鏡檢：短桿菌。 3：發(fā)酵液（周期 60 小時(shí)左右）涂片鏡檢：桿菌，已經(jīng)形成芽孢。 二：雜菌分離、培養(yǎng) 1把變色肉湯接入無菌紅色肉湯，37C恒溫培養(yǎng)。24小時(shí)后肉湯變黃，表明這種菌代 謝產(chǎn)生酸性物質(zhì)。 2:向變色肉湯中加入2滴5M的NaOH溶液，搖勻（PH為10），放置10分鐘。把該 肉湯接入無菌肉湯，37E恒溫培養(yǎng)48小時(shí)，肉湯仍不變色。說明這種雜菌對堿性環(huán)境 的耐受性較差。 3:用細(xì)菌

23、培養(yǎng)基對這種雜菌進(jìn)行平板分離，雜菌菌落具有細(xì)菌菌落的典型特征。挑取 單菌落接入肉湯，培養(yǎng)特征與直接從染菌罐接入的肉湯中的雜菌一致。鏡檢，雜菌呈 短桿狀，可觀察到部分菌體進(jìn)行二分裂繁殖。 4:把雜菌接入菌種效價(jià)跟蹤用的發(fā)酵瓶，培養(yǎng)情況與發(fā)酵罐的代謝情況類似。 5:把雜菌接入空白發(fā)酵瓶，培養(yǎng) 24 小時(shí)后進(jìn)行平板分離及肉湯檢測，結(jié)果證明這種 菌能在發(fā)酵瓶中存活、生長繁殖。由于發(fā)酵瓶和發(fā)酵罐的營養(yǎng)成分、培養(yǎng)條件一致， 因此可以用發(fā)酵瓶來模擬雜菌在發(fā)酵罐中的生長情況。 三:雜菌耐熱性實(shí)驗(yàn) 用牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基培養(yǎng)這種菌， 吸取定量體積的菌液分別接入 11 支無菌 肉湯。取1支作對照，另10支每2支

24、為1組，分別在100C沸水浴中加熱5分鐘，10 分鐘，15分鐘，20分鐘，25分鐘。37T恒溫培養(yǎng)24小時(shí)，只有加熱25分鐘的兩支 肉湯不變色。說明這種菌的耐熱性較強(qiáng)。 四:染菌時(shí)間判斷 把雜菌接入空白發(fā)酵瓶，在不同培養(yǎng)時(shí)間取樣，進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算出發(fā)酵 瓶內(nèi)的菌體數(shù)。該菌的繁殖方式為二分裂，根據(jù)培養(yǎng)時(shí)間和菌體數(shù)目的對應(yīng)關(guān)系，可以 計(jì)算出該菌在發(fā)酵瓶內(nèi)繁殖一代所需的時(shí)間（代時(shí)）。 1:制備菌體稀釋液（濃度約每毫升幾百個(gè)） 從平板上挑取單菌落，按梯度稀釋法制得菌體稀釋液（約520個(gè)/毫升）。 2:代時(shí)的確定 吸取1毫升稀釋液接入空白發(fā)酵瓶（30毫升培養(yǎng)基），發(fā)酵瓶培養(yǎng)條件與發(fā)酵罐培 養(yǎng)條件保

25、持一致。在不同時(shí)間取樣，進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)。計(jì)算出對應(yīng)的菌濃和菌體數(shù)， 如下表。 培養(yǎng)時(shí)間 取樣量 菌落數(shù) 菌濃 菌體數(shù) （小時(shí)） （毫升） （個(gè)） （個(gè)/毫升） （個(gè)） 0 0.5 16 32 960 1.5 0.5 40 80 2400 3.0 0.2 49 245 7350 4.5 0.2 122 610 18300 6.0 0.1 172 1720 51600 根據(jù)公式X=Xx 2（t2?ti）/T, t2-t 1=3.322 x Tx lg （XVXi）和上表數(shù)據(jù)，計(jì)算得到代時(shí)（T）約 為1.1小時(shí)。 其中，X為時(shí)間11時(shí)的菌體數(shù)量， X為時(shí)間t 2時(shí)的菌體數(shù)量， T為代時(shí)（繁殖一代所需