G418篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系經(jīng)驗(yàn)總結(jié)

1、G418篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系經(jīng)驗(yàn)總結(jié) 我做了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，從G418濃度確定到最后的單克隆化鑒定。有自己的體會也有 其他戰(zhàn)友遇到的情況，和大家分享.沒有總結(jié)好的地方，大家補(bǔ)充。 篩選之前確定G418濃度： 1、山于每種細(xì)胞對G418的敬感性不同，而且不同的丿家生產(chǎn)的G418有效成分 的比重不同，一般lg的粉劑中有效的G418含量大約為0.722go 2、G418是新霉素的類似物，兩者都是通過抑制核糖體的功能和蛋白質(zhì)的合成而 殺死細(xì)胞的。但是新霉素對真核細(xì)胞無作用而G418對細(xì)菌和真核細(xì)胞都起作用。 neo就是編碼3 磷酸轉(zhuǎn)移酶的基因，它表達(dá)的蛋口能夠分解新霉素G418o在 進(jìn)行轉(zhuǎn)染時細(xì)胞膜受到影響，

2、抗生素可能對細(xì)胞產(chǎn)生較大影響，加上G418有殺 菌作用，所以有人主張轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)染時不加其它抗生素。 3、匯合度對G418篩選結(jié)果的影響很大，一般篩選時匯合度不宜超過50% 4、G418的活性不盡相同，所以在篩選之前，一定要確定G418的最佳篩選濃度。 具體如下：將細(xì)胞稀釋到1000個細(xì)胞/ml,在lOOug/ml-lmg/ml的G418濃度 范圍內(nèi)進(jìn)行篩選，選擇出在10-14天內(nèi)使細(xì)胞全部死亡的最低G418濃度來進(jìn) 行下一步的篩選試驗(yàn)。6個細(xì)胞電轉(zhuǎn)后，分別接種1/4000. 1/1000, 1/300細(xì) 胞到一個具體試驗(yàn)：3x1024孔板中，48h后加藥篩選，此時1/300細(xì)胞孔內(nèi)大 約50%匯合度

3、。理論上1/4000孔內(nèi)應(yīng)有4%的匯合度。篩選9天后，觀察1/4000 孔內(nèi)有兩三個克隆，按比例1/300孔內(nèi)應(yīng)該有兒十個克隆，事實(shí)上，它們兒乎 全死光了，只有兒個克隆。 加藥時間和維持濃度 1, 山于基因轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)之后要一段時間才能表達(dá)出蛋白質(zhì)。所以篩選不能太 早；但是也不能太晚，因?yàn)檗D(zhuǎn)染了外源基因的細(xì)胞代謝負(fù)荷較大，增值較慢，時 間長了就會被沒有外源基因轉(zhuǎn)入的細(xì)胞所淹沒，最終導(dǎo)致篩選不出陽性克隆，一 般要在轉(zhuǎn)染24小時之后才開始加G418篩選。隨著細(xì)胞的代謝G418的濃度和 活性都會下降，所以每35天都要更換一次含有G418的篩選液。這時藥物濃度 可以降至200ug/mlo 2, 加抗生

4、素的時機(jī)，主要是考慮插入到細(xì)胞基因組的抗性基因是否已經(jīng)得到表 達(dá)。一般是轉(zhuǎn)染48小時后加入抗生素。挑出單克隆后就可以用維持濃度，一般 是篩選濃度的。1/2. 關(guān)于維持濃度，有人說細(xì)胞會出現(xiàn)對抗生素的抗性，應(yīng)不斷提高其濃度。而且, 如果你要挑選到兒個陽性克隆中較高表達(dá)的克隆的話，可以調(diào)整抗生素的濃度。 當(dāng)然，抗性基因高表達(dá)，目的基因不一定就跟著高表達(dá)。 篩選時的培養(yǎng)液 加藥篩選約6天左右，細(xì)胞會大量死亡，孔中只剩下的細(xì)胞寥寥無兒。這時會岀 現(xiàn)兩個問題： 1，死亡的細(xì)胞會裂解釋放出有害物質(zhì)，導(dǎo)致那些有neo表達(dá)的陽性細(xì)胞死亡， 即非選擇性死亡，因此要及時換液 2 ,孔中細(xì)胞數(shù)LI很少，細(xì)胞之間的信

5、號會變得很弱，也會導(dǎo)致陽性細(xì)胞的狀態(tài) 不佳其至死亡。這個時候需要一種特殊的培養(yǎng)液：假如你要轉(zhuǎn)染3T3細(xì)胞，在 3T3細(xì)胞匯合度達(dá)到80%的時候，換液，培養(yǎng)過夜之后收集培養(yǎng)液，通過濾器 消毒，和新鮮的培養(yǎng)液按1： 1混合備用。再轉(zhuǎn)染后篩選過程中就可以應(yīng)用這種 培養(yǎng)基。 3, 適當(dāng)增加血清濃度。 篩選時出現(xiàn)的問題及其解決辦法： 問題1。做hela細(xì)胞的篩選，現(xiàn)在已經(jīng)篩選3周，在6孔板中已經(jīng)長出一 些細(xì)胞簇，想把它挑到96孔板中，就用2ul胰酶消化，在消化過程中，胰酶擴(kuò) 散，細(xì)胞已經(jīng)四散開，和周圍的其它細(xì)胞簇融合在一起（我的細(xì)胞簇離的很近）， 就是說兒個細(xì)胞簇被胰酶融合在一起，那樣根本沒有辦法做下去

6、了，該怎么辦？ a、可以減少胰酶量；胰酶在加入之前要用37度溫箱預(yù)熱，并且PBS潤洗細(xì)胞 層，以減少可能殘存的血清的影響； b、加入胰酶后，稍過兒秒鐘就可以吸走消化液了，不用吸干凈，然后放到37 度溫箱中繼續(xù)作用1MIN,這時，消化酶可以繼續(xù)作用的，乂可避免胰酶擴(kuò)散; c、顯微鏡下觀察細(xì)胞完全松散開，就可以在你感興趣的局部加培養(yǎng)基，并吸走 你的可隆了呀 d、具體消化的時間，你注意摸索一下，如果在步驟2中顯微鏡下見細(xì)胞尚未完 全松散開，可以再重復(fù)的，直到松散開，能夠被吸走為止。 我的建議：1、在100mm dish中挑克隆，細(xì)胞分的稀一點(diǎn)。2、把細(xì)胞全部消化 下來，在96孔板中逐步稀釋獲得單克隆

7、 2, 問題2。篩選成功的概率：只要有抗性加壓篩選，挑選到的機(jī)率還是比較大 的。一般能挑到穩(wěn)定表達(dá)的概率我認(rèn)為大概有70-80%,但是想挑到表達(dá)量高 且能穩(wěn)定表達(dá)的，不大容易。這個可能是在染色體上，合適的整合位點(diǎn)太少的緣 故。 3, 問題3。細(xì)胞形態(tài)的改變：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后陽性克隆均出現(xiàn)不同程度的細(xì)胞形態(tài) 的改變。 想請教各位有經(jīng)驗(yàn)的高手，你們做穩(wěn)定轉(zhuǎn)染時有此發(fā)現(xiàn)嗎？我的也是，而且好象 還有好兒種不同類型的細(xì)胞。不過，我轉(zhuǎn)的是一種抑癌基因。 4, 問題4。單克隆化的時機(jī)和個數(shù)：加藥篩選時，一般等到確認(rèn)的轉(zhuǎn)染細(xì)胞長到 70%以上時，再做有限稀釋法，以克隆出陽性細(xì)胞，同時要保持適當(dāng)?shù)乃幬餄舛龋?以防突變

8、和污染。若細(xì)胞長好了，如有40%以上，就可以有限稀釋了一般，篩選5, 6個克隆就有需要的克隆，但保險起見，篩10個吧。 5, 從單克隆化時開始，就要加大營養(yǎng)，清和生長因子。單克隆化的操作方法； 1 方法lo單克隆細(xì)胞的培養(yǎng)就是這樣的，我現(xiàn)在作了 15個96孔板的單克隆，總 共才得到大約50株單克隆在做時候應(yīng)保證每個孔中的細(xì)胞是一個，因此，我一般 在200毫升的培養(yǎng)液中加入小于96個的細(xì)胞,這樣平均到每個孔中因該可以山滿 意的結(jié)果你所說的現(xiàn)象我也遇到過，我也白思不得其解，只好做多一點(diǎn)的96孔板 來補(bǔ)充。培養(yǎng)SPC-A1 （人肺癌細(xì)胞），轉(zhuǎn)染了 EGFP,然后進(jìn)行了 G418抗性篩 選和96孔板單

9、克隆篩選，最終獲得了成功將我的實(shí)驗(yàn)步驟寫出來，希望對你有 所幫助。 2方法2。實(shí)驗(yàn)步驟大致為：預(yù)先對96孔板除第一排之外的所有孔加含15%胎 牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，0.1ml/孔，并放于細(xì)胞培養(yǎng)箱中溫育，然后胰酶消化穩(wěn)定 表達(dá)GFP的細(xì)胞，細(xì)胞液稀釋至密度為1000cell/ml的單細(xì)胞懸浮液，上述細(xì)胞 液接種于96孔板的第一排，0.2ml/孔，從中吸取0.1ml細(xì)胞溶液接種于第二排， 混合后，從第一排中吸取0.1ml接種于第三排，一直到第八排，最后一排都 丟棄0.1ml細(xì)胞液，操作示意圖見下圖。一般來說，每一列都會有某個孔中只有 1-2個細(xì)胞。 3方法3。我的改進(jìn)之處：我在顯微鏡下觀察，標(biāo)記孔

10、中小于10個細(xì)胞的孔， 然后在顯微鏡下用記號筆在皿底把單個熒光細(xì)胞圈住，然后在操凈臺里用滅過菌 底牙簽將圈外的細(xì)胞戳死，這樣留在孔中的就是單克隆了，通過這樣的，我一共 獲得了 6株單克隆。但需注意的是：時間不能超過30min,否則細(xì)胞極容易死亡。 解決操作時間長的方法：拿一個96板，在里面隨便種一些細(xì)胞，然后用牙簽練 習(xí)，我練了 56次后非常熟練了 培養(yǎng)液：最好是含15%的胎牛血清，加大營養(yǎng)，有利于細(xì)胞生長；另外一種方 法是對還沒有變黃的細(xì)胞液進(jìn)行過濾，過濾后的培養(yǎng)含有很多生長因子，可以作 為單克隆的培 養(yǎng)液。 4方法鐵 我曾經(jīng)幫同事做過挑單克隆，直接將倒置顯微鏡搬到操凈臺內(nèi)紫外照 射30分鐘

11、，然后先在顯微鏡下把要挑的單克隆初看一遍，算一下大概要挑兒個， 然后在96孔板內(nèi)先加好培養(yǎng)基，再將6孔板內(nèi)的培養(yǎng)基吸岀，加入少量的胰酶， 大概能蓋住板底即可，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，在有些變圓時，即用10ul 槍在顯微鏡下直接吸克隆，放入事先準(zhǔn)備好的加了培養(yǎng)基的96孔板內(nèi)，先吸大 的克隆，在胰酶完全起到作用使細(xì)胞松散擴(kuò)散開了時，已經(jīng)吸了將近十個克隆了， 動作快一些時能吸十兒個克隆，我做過兒次了效果很好，沒有出現(xiàn)污染。（在要 進(jìn)行操作時，用酒精將手好好擦擦，將顯微鏡用新潔爾滅也擦一下，一般不會有 什么問題），你可以試試，只要小心一些就行了。 5方法5。關(guān)于穩(wěn)轉(zhuǎn)的方法，好像園子里很多xdjm都

12、用的是有限稀釋法來作， 但是我們實(shí)驗(yàn)室基本上都不用九十六孔做有限稀釋來作單克隆的，一般的做法都 是這樣： lo 3.5cm 1IIL鋪細(xì)胞，長到大概80%以上的時候作轉(zhuǎn)染。 2。轉(zhuǎn)染后一天消化，傳到一個大皿（4 6）或者兩個大皿（1： 12）。 3。再過一天后加入帶G418的培養(yǎng)基。 4。依據(jù)細(xì)胞不同，大概從加入G418的第三天到第八天之間細(xì)胞開始出現(xiàn)大量 死亡，活下來的細(xì)胞就形成單克隆。 5。單克隆長到相對較大的集落后，于顯微鏡下用200U1槍挑取細(xì)胞集落，一般 挑上48個，種在兩塊24孔板上。 6。于24孔板上繼續(xù)培養(yǎng)，約4、5天后即可消化傳代，取部分作收蛋白western 之用，根據(jù)we

13、stern結(jié)果確定真陽性。 我們基本上都是這樣pick stable的，除非一些對細(xì)胞生長抑止作用強(qiáng)大或者 apoptosis的inducer之類的基因比較難挑到stable夕卜，一般還都能挑到stable。 當(dāng)然，轉(zhuǎn)染效率不能太低，超過50%就相對比較容易了，10%以上的可能最后 形成的細(xì)胞集落就少，而且真陽性也較少。對于那些轉(zhuǎn)染效率很低的細(xì)胞，我會 連續(xù)轉(zhuǎn)染三次（中間如果細(xì)胞長滿了就傳代），好像比較有效。 除非是類似帶GFP這樣能直接觀察到是否真陽性的基因，我們才用有限稀釋法 來作，要不好像也太麻煩了吧？耗時也多 單克隆化后細(xì)胞特點(diǎn)和處理： 1 單克隆后細(xì)胞生活習(xí)性改變：考慮質(zhì)粒的表達(dá)對細(xì)

14、胞的生長有一定的影響，查 文獻(xiàn)確認(rèn)一下。 2單克隆后的培養(yǎng)需要多加些血清，再傳代時保證板子不影響細(xì)胞貼壁，避免出 現(xiàn)傳代后細(xì)胞浮起來后死亡的現(xiàn)象。 3篩選成單克隆后，不加藥培養(yǎng)2代，再加藥繼續(xù)篩選兩代，此時如果不出現(xiàn)死 亡細(xì)胞則可以認(rèn)為是穩(wěn)定細(xì)胞系。復(fù)蘇后加G418傳代2次，然后按部就班。 4過一段時間再篩選時，G418的濃度有人認(rèn)為需要比穩(wěn)轉(zhuǎn)時小寫，此外，加藥 后對蛋白質(zhì)的表達(dá)，細(xì)胞形態(tài)有影響，因此做功能時要停藥培養(yǎng)合適時間后再做。 5穩(wěn)轉(zhuǎn)PA317細(xì)胞后再次篩選（需要隔一段時間再加壓篩一次），細(xì)胞也是死的 厲害，不過還是可以篩到，不過需要用合適的濃度?？梢栽诩?xì)胞傳兒代后，分出 一小部分，不

15、加G418培養(yǎng)一段時間，然后再加你維持細(xì)胞的抗性的G418濃度 培養(yǎng)一天看細(xì)胞會不會死亡，如果死亡，說明外源基因還沒有丟失。 6有人這樣做的：轉(zhuǎn)染加藥一段時間后，板子上出現(xiàn)了兒個克隆，如果有兒十個 克隆，然后挑其中七八個克隆到24孔板里繼續(xù)加藥篩選，等24孔長滿后再轉(zhuǎn) 到6孔板繼續(xù)加藥篩選，6孔板里長差不多滿后，每孔消化下來大概一半做WB 鑒定LI的基因表達(dá)，剩一半留著繼續(xù)加藥培養(yǎng)，等WB結(jié)果出來有陽性的孔就保 留下來，陰性的丟掉。 單克隆化后鑒定： 1 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞，通過PCR鑒定，發(fā)現(xiàn)U的基因并不上調(diào)，瞬時轉(zhuǎn)染表達(dá)是增高 的。原因：瞬轉(zhuǎn)是在強(qiáng)啟動子下，穩(wěn)轉(zhuǎn)時你得到的細(xì)胞株可能失去了此啟動子

16、，或 者是改變了細(xì)胞的生理特性!用WB和瞬轉(zhuǎn)對照鑒定一下！ 2轉(zhuǎn)染后質(zhì)粒整合到基因組是隨機(jī)的，一般兩月后（傳代10代以上）還表達(dá)你 想要蛋白的單克隆可以認(rèn)為是整合了質(zhì)粒的。 G418篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系 1.G418的配制: 方案一：300mgG418加入3ml PBS溶液，濃度為1 OOmg/mb完全溶解后， 0.22um 過濾，-20C保存。 方案二:（1）配制1MHEPES： 23.8gHEPES （緩沖能力更強(qiáng)）粉末溶于100ml ddH2O, lONNaOH （加量較多）調(diào)節(jié)pH至7.3,過濾除菌（較難過濾），4C保 存，終濃度為lmol/Lo （2）5gG418 溶于 10ml IM

17、 HEPES （pH7.3）,終濃度為 500mg/mb -20C保存。 注：實(shí)驗(yàn)中采用方案二時效果較好。 2制備篩選培養(yǎng)基:用培養(yǎng)基將G418稀釋為0 ug/ml、200ug/ml、300ug/ml、 400 ug/mR500ug/ml 600 ug/ml 700 ug/ml s800 ug/mR900ug/mR1000ug/ml HOOug/mk 1200ug/ml 24孔板，每孔lml培養(yǎng)基（含有G418的完全培養(yǎng)基），每個濃度4個重復(fù)，則 每次換液需各個濃度培養(yǎng)基4ml, 現(xiàn)用現(xiàn)配。 400 ug/ml 800 ug/ml 1200 ug/ml 500 ug/ml 900 ug/ml1

18、000 200 ug/ml 600 ug/ml ug/ml 300 ug/ml 700 ug/ml 1100 ug/ml 3ml 完全培養(yǎng)基 998.4 997.6996.8996 995.2 994.4 993.6992.8992 991.2990.4 G418(500mg/ml 1.6ul 2.4ul3.2ul4.0ul 4.8ul 5.6ul 6.4ul 7.2ul 8.0ul8.8ul9.6ul 3細(xì)胞培養(yǎng)：將凍存的細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)傳代3至4次使細(xì)胞達(dá)到良好的生長狀 態(tài)，鋪24孔板（20000/JL）, 12h換液，加篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)。 4確定G418最佳篩選濃度：將培養(yǎng)孔中培養(yǎng)基吸除，PB

19、S洗滌一次，每孔加入 不同濃度篩選培養(yǎng)基，隔天更換一次篩選培養(yǎng)基，培養(yǎng)10J4天，以最低細(xì)胞全 部死亡濃度為基準(zhǔn)。 注：實(shí)驗(yàn)中所確定的最佳篩選濃度為1200ug/mL 5鋪6孔板（20萬/孔），第二天轉(zhuǎn)染，6小時后換新鮮正常培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染24小 時后加最佳篩選濃度培養(yǎng)基，隔天換液。 注意：細(xì)胞數(shù)量不能太多，否則將會影響篩選效果（G418很難發(fā)揮作用）。 時，吸出所有培養(yǎng)液，離心6在換液一兩次后（換液后培養(yǎng)過夜），細(xì)胞達(dá) 50%-80%C4倍體積新鮮最佳篩選濃度培養(yǎng)液，加入2混勻3000-4000rpm,吸 上清022um過濾，備用。中所配制?；蛘呖梢栽?培養(yǎng)天左右細(xì)胞大量死亡 時，可以換用適應(yīng)性

20、培養(yǎng)基，即67血清，此時則可以采用20%血清。加血清 濃度培養(yǎng)，例如原來用10% G418濃度減半，維持篩選圧力。8培養(yǎng)10天后將 天 后可見有抗性克隆出現(xiàn)。9篩選約14套環(huán)法或刮除法結(jié)合有限稀釋法篩選陽性 克隆，高倍鏡下標(biāo)記陽性克隆,10.挑單克?。簩⑵滢D(zhuǎn)入多孔板培養(yǎng)。消化，把 消化液吸到另外一套環(huán)法：用套環(huán)套住陽性克隆，在套環(huán)內(nèi)加胰酶或EDTA個 新的培養(yǎng)孔中培養(yǎng)。刮除法：刮除隱性克隆，消化陽性克隆后繼續(xù)篩選培養(yǎng)。 檢測LI的基因的表達(dá)，RT-PCR單克隆鑒定：細(xì)胞大量擴(kuò)增后，提取總 ll.RNA western檢測目的基因。 抗注意：轉(zhuǎn)染時壓系時細(xì)胞不能鋪的太滿，不然肖細(xì)胞連接緊密后，壓

21、系時不具 G418性的細(xì)胞死亡時極易將具有抗性的細(xì)胞一起從壁上脫落下來。 G418篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系總結(jié)一 題也不是很大，那就是：在老外的一本實(shí)驗(yàn)手冊中提到，在脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染時所用培 養(yǎng)基中最好不加任何抗生素。我想他的想法可能是脂質(zhì)體對細(xì)胞膜有影響，可能 此時加抗生素均是氨基糖貳類藥物，其藥理作用完對細(xì)胞損傷較大。因?yàn)閼c大霉 素、鏈霉素、G418全一樣。所以沒有必要再用，而且山于另外抗生素的添加實(shí) 際增加氨基糖貳類藥物的濃度，劑量有誤差，不利于各實(shí)驗(yàn)室之間的交流，在實(shí) 際操作中，培養(yǎng)液中有抗生素對細(xì)胞培養(yǎng)與篩選影響不大。 有人認(rèn)為用磷酸鈣共沉淀轉(zhuǎn)染法篩選穩(wěn)定整合子較好，但這種觀點(diǎn)是很多年以前 的觀

22、點(diǎn)了，而且只是少數(shù)人的觀點(diǎn)。我兩種方法都用過，但沒有特異的比較過, 感覺都可以。磷酸鈣便宜，但對溶液配置和實(shí)驗(yàn)操作要求很高，尤其是溶液的 PH值，要求精確到小 從沒有人說這種方法做整合穩(wěn)定表達(dá)不行。位。脂質(zhì)體是現(xiàn)在主流的轉(zhuǎn)染試劑, 數(shù)點(diǎn)后2Qiagen非脂質(zhì)體是這兒年發(fā)展很快的技術(shù)，轉(zhuǎn)染效率低，細(xì)胞毒性小, 價格也不貴，就有一個系列。我個人覺得不必要花太多時間在這方面，自己實(shí)驗(yàn) 室用得好的技術(shù)可以堅持，沒有經(jīng)驗(yàn)的可以選擇一個較著名的公司的產(chǎn)品開始, 購買之前先下載個說明書看看。有精力就比較一下兒種方法，一般的用達(dá)到LJ 的就行了。關(guān)鍵是實(shí)驗(yàn)設(shè)計。和篩選G418篩選之前的活性G418 III于每

23、種細(xì) 胞對G418的敬感性不同，而且不同的廠家生產(chǎn)的相同濃度的的最佳篩選濃度。 具體如下：將細(xì)胞稀G418不盡相同，所以在篩選之前，一定要確定濃度范圍內(nèi) 進(jìn)行篩選，選擇出G418100ug/mL-lmg/mL的釋到1000個細(xì)胞/mL,在G418 濃度來進(jìn)行下一步的篩選試驗(yàn)。天內(nèi)使細(xì)胞全部死亡的最低在10-14范圉。而 且1000ug/ml山于每種細(xì)胞對G418的敬感性不同，一般變動在100ug/ml的 活性不盡相同，所以在篩選之詢，一定要確定你不同的廠家生產(chǎn)的相同濃度的 G418的最佳用G418的最佳篩選濃度。盡管如此，特性明確的細(xì)胞系的細(xì)胞對 這一批G418的最佳用量。量還是穩(wěn)定的。分子克

24、隆給出了兒個常用細(xì)胞系 所需G418 ug/m 1濃度（）細(xì)胞系或機(jī)體 G418800 700中國倉鼠卵巢細(xì)胞細(xì)犬腎Madin-Darby500 胞細(xì)胞人上皮A431400 細(xì)胞猿CV-1500 35盤基網(wǎng)柄菌屬10植物10 500 酵1256細(xì)胞到，101/300個細(xì)胞電轉(zhuǎn)后，分別接種1/4000, 1/1000看下面的 一個試驗(yàn)：3X1/400050%匯合度。理論上細(xì)胞孔內(nèi)大約孔板中，48h后加藥篩 選，此時1/300241/3001/4000孔內(nèi)有兩三個克隆，按比例孔內(nèi)應(yīng)有4%的匯合 度。篩選9天后，觀察孔內(nèi)應(yīng)該有兒十個克隆，事實(shí)上，它們兒乎全死光了，只 有兒個克隆。所以匯合度對50%篩

25、選結(jié)果的影響很大，一般篩選時匯合度不宜 超過！ G418加藥時間山于基因轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)之后要一段時間才能表達(dá)出蛋口質(zhì)。 所以篩選不能太早;但是也不能太晚，因?yàn)檗D(zhuǎn)染了外源基因的細(xì)胞代謝負(fù)荷較大， 增值較慢，時間長了就會被沒有小時之后外源基因轉(zhuǎn)入的細(xì)胞所淹沒，最終導(dǎo)致 篩選不出陽性克隆，一般要在轉(zhuǎn)染24天都的濃度和活性都回下降，所以每 3-5G418篩選。隨著細(xì)胞的代謝G418才開始加。G418的篩選液。這時藥物濃 度可以降至200ug/ml要更換一次含有 培養(yǎng)液天左右，細(xì)胞會大量死亡，孔中 只剩下的細(xì)胞寥寥無兒。這時會出現(xiàn)兩個6加藥篩選約表達(dá)的陽性細(xì)胞死亡，即 neol死亡的細(xì)胞會裂解釋放出有害物

26、質(zhì)，導(dǎo)致那些有問題：孔中細(xì)胞數(shù)LI很少， 細(xì)胞之間的信號會變得很弱，也會導(dǎo)致陽性細(xì)胞非選擇性死亡。2細(xì)胞，在的狀 態(tài)不佳其至死亡。這個時候需要一種特殊的培養(yǎng)液：假如你要轉(zhuǎn)染3T3的時候， 換液，培養(yǎng)過夜之后收集培養(yǎng)液，通過濾器消毒，和80%細(xì)胞匯合度達(dá)到3T3混 合備用。再轉(zhuǎn)染后篩選過程中就可以應(yīng)用這種培養(yǎng)基。：11新鮮的培養(yǎng)液按挑 選單克隆的優(yōu)化可為了盡量減少陰性克隆的死亡給陽性克隆造成的不利影響以 及增加陽性克隆的得率，以應(yīng)用套環(huán)法或刮除法結(jié)合有限稀釋法來篩選陽性克隆。 加藥后，在高倍鏡下，陽性克隆和陰性克隆很容易辨認(rèn)，在陽性克隆下用記號筆 做個標(biāo)記。然后刮除隱性克隆，消化消EDTA陽性克

27、隆后繼續(xù)篩選培養(yǎng)；或則用 套環(huán)套住陽性克隆，在套環(huán)內(nèi)加胰蛋白酶或孔板96化，把消化液吸到巧外一個 新的孔中培養(yǎng)。最后再用有限稀釋法把陽性克隆在中篩選。 鑒定之后但是外源基因如果沒有整合到得到的陽性克隆都比較穩(wěn)定。一般經(jīng)過 4周左右的篩選，基因組中的話，LI的基因還是很容易丟失的。但是外源基因整 合到基因組中的概率太小隨著培養(yǎng)時間的延續(xù)，會導(dǎo)致表達(dá)的LI的蛋白的量產(chǎn)生 很大差異。了，而且是隨機(jī)整合，強(qiáng)表達(dá)LI的蛋口的那些丟失了外源基因的細(xì)胞 和很少表達(dá)LI的基因的細(xì)胞會占據(jù)優(yōu)勢，次以上的篩選之后才能找到細(xì)胞會越來 越少。2這樣再次篩選是必不可少的。只有經(jīng)過 那種我們想要的強(qiáng)分泌U的蛋 白的，遺傳

28、穩(wěn)定的細(xì)胞克隆。最全的2 () G418篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系總結(jié)！ Protocal ,過濾消溶于1.G418的配制：取lgG4181ml lMlOml的HEPES液中，加蒸憎 水至 毒，4度保存。6細(xì)胞培養(yǎng)：取待測培養(yǎng)細(xì)胞，制備成細(xì)胞懸液，按等量接 種入多孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)2.小時左右開始加藥。范圍內(nèi)確定兒個梯度，比如先 做個1000ug/ml3.制備篩選培養(yǎng)基：在100ug/ml制成G418100ug/ml、 400ug/mK 800ug/mll000ug/ml,按梯度濃應(yīng)用培養(yǎng)基稀釋篩選培養(yǎng)基。每孔 中加入不同濃度的篩選培養(yǎng)洗滌一次，4加G418篩選：吸除培養(yǎng)孔中培養(yǎng)基， PBS基。每5換液

29、：根據(jù)培養(yǎng)基的顏色和細(xì)胞生長情況，35天更換一次篩 選培養(yǎng)基。方法同4濃度即為最佳G4186.確定最佳篩選濃度：在篩選1014 天內(nèi)能夠殺死所有細(xì)胞的最小濃度的可能性不大，最有可能的是出現(xiàn)這種情 G418篩選濃度。在第一輪就篩選出最佳G418況：用某一濃度G418的量在篩 選14天后還不能殺死細(xì)胞，而用下一個梯度的在第800ug/ml天前就看不到活 細(xì)胞了。10假如是400ug/ml不能殺死細(xì)胞，而的量在進(jìn)一步篩選，、則可以再 用500ug/ml 700ug/ml600ug/ml5天就把所有細(xì)胞都?xì)⑺懒?，的最佳用量還是 比較穩(wěn)定的，G418以確定最佳篩選濃度！心得：山于特性明確的細(xì)胞系，現(xiàn)在

30、我所以有時候不需要在這么大范圍內(nèi)進(jìn)行篩選。比如說你要轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞。 這時的敬感性，我用的篩選濃度是200 ug/mlG418告訴你我測試過NIH3T3細(xì) 胞對 三個濃度進(jìn)行篩選。300ug/ml、你就可以做150ug/ml200ug/ml 通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定了最佳篩選濃度后，就可以做穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了。 密度傳代，繼續(xù)a轉(zhuǎn)染：轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)2441：小時或者更長，到細(xì)胞增長接近匯 合時按培養(yǎng)，待細(xì)胞密度增至50%匯合時；70篩選培養(yǎng)基。G418去掉培 養(yǎng)液,G418:PBS洗一次，加入按最佳篩選濃度配制好的b加當(dāng)有大量35換液： 根據(jù)培養(yǎng)基的顏色和細(xì)胞生長情況，每天更換一次篩選培養(yǎng)基。c 天后，可見有

31、抗性的克隆1014篩選細(xì)胞死亡時，可以把G418濃度減半維持 篩選。 岀現(xiàn)，停藥培養(yǎng)，待其逐漸增大后；孔板中。在96個d挑單克?。褐苽浼?xì)胞 懸液，細(xì)胞訃數(shù)，用培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞到1/lOul待其逐漸增大后轉(zhuǎn)入到孔，加入 培養(yǎng)基150U1/再加入細(xì)胞懸液10ul/?Lo 48孔中增殖。e單克隆鑒定：細(xì)胞大 量擴(kuò)增后，提取總RNA檢測H的基因是否存在做RT-PCR 常見問題：1 轉(zhuǎn)進(jìn)去的重組質(zhì)粒以什么形式存在于細(xì)胞內(nèi)的？無怪乎兩種形式: 整合在染色體中和存在于細(xì)胞質(zhì)中。沒有經(jīng)過篩選前大部分轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞的質(zhì)粒是 存在于胞質(zhì)中的，但是這種質(zhì)粒是不穩(wěn)定的，基本上篩選不出這種單克隆，只 有穩(wěn)定整合入染色體的才是

32、我們想要的穩(wěn)定細(xì)胞系?；蚝蚒的基因是不是一 定會整合在一起？ 2neo基因表達(dá)而LI的基因不一定都表達(dá)，所以在篩選neo整 合是隨機(jī)發(fā)生的非同源性重組，的方法進(jìn)一步鑒定。之后還要用RT-PCR培養(yǎng) 基處理的個人技巧體內(nèi)的任何細(xì)胞被置于體外培養(yǎng)后，對環(huán)境都有一個適應(yīng)過程, 期間細(xì)胞對培養(yǎng)液具有同化作用，即細(xì)胞從培養(yǎng)液中攝取營養(yǎng)的同時，也向培養(yǎng) 液排出自己的代謝產(chǎn)物和其它一些物質(zhì)，其中有排泄物也有促細(xì)胞生長因子。這 個過程也是細(xì)胞同化培養(yǎng)基的過程。細(xì)胞越多則其同化作用越強(qiáng)，所以細(xì)胞數(shù)I 多比數(shù)LI少較易生長。在篩選后期，大批細(xì)胞死亡，不換液沒有死亡的細(xì)胞就會 受到死亡細(xì)胞的影響，換液后殘留的少量

33、細(xì)胞對培 養(yǎng)基的同化作用不強(qiáng)，也不 利于生長。我是用適應(yīng)性培養(yǎng)基來解決這一問題的：適應(yīng)性培養(yǎng)基的配制 a培養(yǎng)同源細(xì)胞至半?yún)R合狀態(tài)時，更換一次培養(yǎng)液，再繼續(xù)培養(yǎng)2448小時后， 吸出所有培養(yǎng)液 b離心：30004000rpm 10 min后，吸取上清液 倍體積的新鮮培養(yǎng)基，低溫凍存?zhèn)溆?。濾器過濾，再加入2c慮過：再經(jīng)直徑 0.22um eeflying 加入，每孔lOOuLl. G418篩選要做預(yù)試驗(yàn)確定最佳濃度，將細(xì)胞稀釋至 1000cell/mL, 500300, 400 濃度稀釋至 0, 100, 200, G418 有培養(yǎng)基的 24 孔板,將每孔中的天,以最低細(xì)胞10-14等12個級別。

34、培養(yǎng)，900, 1000, U00ng/mL700600, 800維持使用篩左右，篩選時比該濃度再高一個級別，全 部死亡濃度為基準(zhǔn)，一般400-800選濃度的一半。代以后用維持量，但不能不 用，因?yàn)橛袝r候抗性基因會丟失，10.我們掌握是傳過2G418.很快會形成優(yōu) 勢的。如果沒有G418抗性，也不一定有的基因，單克隆化操作是很重要的。. 3即是有LI的蛋白表達(dá)有的多，轉(zhuǎn)染后，每個細(xì)胞內(nèi)L1的基因與宿主染色體的整 合狀況是不同的，在生長若干代之后，外源蛋口表達(dá)少的細(xì)胞山于代謝負(fù)荷較小， 所以生長較快，有的少，表達(dá)少的細(xì)胞會形成優(yōu)勢，長期之后，表達(dá)最弱的細(xì)胞 會山于競爭優(yōu)勢占主要，轉(zhuǎn)綠色熒光蛋口基

35、因后，表達(dá)越來越暗就是這個道理。 所以，要進(jìn)行單克隆化操作，使得到的均來自于同一祖先細(xì)胞，遺傳性狀盡量 一致，也是對高表達(dá)細(xì)胞的保護(hù)。 左右就可以進(jìn)行該操作了，大多數(shù)凍存，留200cell操作用96孔板法，每代細(xì) 胞長滿后，該方法在很多關(guān)于單克隆抗體和細(xì)胞原代培養(yǎng)書中均有講述。這點(diǎn) 外源基因與宿主染色體之間的整合是隨機(jī)的而且不是單拷貝的，1.可以肯定的 是，立體結(jié)構(gòu)都驗(yàn)證過，表達(dá)量與整合數(shù)LE上游序列特性，特定部位DNA我 們做過FISH但并不能掩蓋其它因素對表達(dá)的影響oSV40只是增加了表達(dá)了數(shù)山 是相關(guān)的，裝入了基因也是這樣，neo的細(xì)胞應(yīng)該亮度一致，但實(shí)際上差別很大。 GFP按你的講法，

36、轉(zhuǎn)染完而且，同一細(xì)胞中不同基因的拷貝數(shù)不會相同，不同細(xì) 胞同一基因的數(shù)LI也不會相同，表達(dá)了，但U的基因丟失了的情這點(diǎn)可以用數(shù)學(xué) 關(guān)于泊松分布的觀點(diǎn)理解。有時，neo況也是有的。某一細(xì)胞內(nèi)隨機(jī)含有一定 那為什么還要篩選基因？是這樣，用概率論的思維來理解，2. 的可能性，及所有拷貝均為另一種基數(shù)LI拷貝數(shù)外源基因，那么，一種基因拷貝 數(shù)為0*. 個因的概率就很小，很大的概率為外源基因的不均質(zhì)。打個比方，一個大口袋， 抓100然后以從中抓若干個，這些球均為紅球的概率有多大呢？應(yīng)該個黃球， 紅球，再抓100,實(shí)際上是篩選的外源neo是很小的。紅球就是neo,黃球就是 你的LI的基因。我們用個紅球，另

37、一次抓著5基因整合的數(shù)口，怎么說呢？用剛 才的例子來說，如果我們抓著個紅球，可以肯定，第二次抓的球比較多，那么第 二次黃球數(shù)LI比第一次多的概率10就很大了。因?yàn)槎叱霈F(xiàn)的概率比是恒定的。 但不能沒有?；蛘吒粢欢〞r間從維持就是只要養(yǎng)這種細(xì)胞，就要維持。可以再低 些，3. 祈使用篩選量壓一下，我不知你是否干臨床，想想抗生素的用藥原則，反向思維 一下，實(shí)際上我們在篩選耐藥株呀。酶來支持，否則細(xì)胞也要被毒neoG418濃 度就要有更多的4. neo的產(chǎn)物是酶，過高的死的，而此時過多的酶要求會對細(xì)胞 代謝造成太大負(fù)擔(dān),細(xì)胞可能因此無法完成分裂與液中生長速度也不G418增殖， 我們曾試過，即使在同一轉(zhuǎn)染

38、陽性細(xì)胞，在不同濃度的同，嚴(yán)重形態(tài)也不同。這 就是酶與底物的比例關(guān)系嘛，這回不用數(shù)論的，用米氏方程理 解吧。 胰酶的作用不必理會，有的細(xì)胞受影響，還有的細(xì)胞不受影響，山兒代之后，不 受影5. 響的細(xì)胞會占優(yōu)勢的。僅是我從臨床抗生素和化療藥的使用原則中悟出的道理, 實(shí)在是個人經(jīng)驗(yàn)，而且在基礎(chǔ) 科學(xué)領(lǐng)域頂多算票友，我還是想聽聽諸位專業(yè)人 士的理解和經(jīng)驗(yàn)。96孔板單克隆操作了在第10天左右就手挑單克隆或者本帖 開始我就講了如何確定基準(zhǔn)濃度，篩選濃度是基準(zhǔn)濃度的高一級，維持用篩選濃 度的一半。 篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系總結(jié)三G418也許是我們實(shí)驗(yàn)室的翻譯，實(shí) 際上就是指細(xì)胞占培養(yǎng)表面的比例，（conflue

39、nce）匯合度100%。匯合，也就是 匯合度如果細(xì)胞鋪滿了整個容器，我們就認(rèn)為它們100%6和1/4000X10細(xì)胞 電轉(zhuǎn)后，我把電激杯中的細(xì)胞分別接種最近的一個實(shí)驗(yàn)是：3細(xì)胞l/300g418 孔板中，48小時后加篩選，這個時候接種了 241/3001/1000和到左右匯合，今 天是篩選細(xì)胞的孔會匯合，而理論上接種了的孔會大約50%1/40004%: 個克隆，但孔會有2030天，觀察到1/4000孔有兩三個小克隆，按道理1/300 后第9實(shí)際的情況是它們兒乎全部死光了，僅有少數(shù)存活細(xì)胞！ g418篩選影 響很大，這耽誤了我將一個多月。所以我認(rèn)為匯合度對篩選時間太長，到后來一 般會對細(xì)同意菊花

40、與刀對你的建議。我的感覺G418jiangql 胞生長有影響。以下是一些建議，供參考：首先需要擴(kuò)增細(xì)胞，凍存部分中間 產(chǎn)物細(xì)胞后，再做克隆化比較合適，否則一旦污染就 會全軍覆沒。就可以減半 維持。7天后G418 一般5 勤換液，去除死細(xì)胞，可以減少對存活細(xì)胞的影響。 20%,質(zhì)量要好。血清濃度可以高到 進(jìn)行真核轉(zhuǎn)染的一般程序：準(zhǔn)備真核表達(dá) 載體一將H的基因插入表達(dá)載體中一轉(zhuǎn)染一克隆U的基因（經(jīng)測序驗(yàn)證）一篩 選一鑒定 為LI的基因，介紹真核轉(zhuǎn)染的實(shí)驗(yàn)操作。為載體，pl6下面以pcDNA3 試劑準(zhǔn)備一、 調(diào) 1M Hepes,90ml ddH 溶于 0,加入、1 HBS （Hepes-buffe

41、red saline ）： 876mg NaCh，濾過除菌。至100ml pH7.47.4,pH到補(bǔ)ddHO22.核酸貯存液,過濾除 菌。3、培養(yǎng)基：含血清或不含血清的，用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞的正常培養(yǎng)。二.操作 步驟（一）克隆LI的基因端分別-檢索的口的基因序列，設(shè)訃擴(kuò)增引物，并在上、 下游引物的5、根據(jù)IGenBank oXho I，行RT-PCR I和引入酶切位點(diǎn)BamHT2 回收特異性擴(kuò)增片段，連入載體。 ,質(zhì)粒制備。3、轉(zhuǎn)化DH5、酶切初步鑒定，測序證實(shí)。4真核重組表達(dá)載 體的構(gòu)建：（二） 載體帶有在大腸桿菌中復(fù)制的原核序列、便于挑選帶重組質(zhì)粒細(xì)菌的抗生素抗 PCDNA3序列所必需的所有真核表

42、達(dá)組件。性基因，以及表達(dá)外源DNA丨雙酶 切BamH I和XhoM組質(zhì)粒與pcDNA3分別用 線性片段回收插入片段和pcDNA3 連接酶連接T4 a轉(zhuǎn)化DH5質(zhì)粒制備【雙酶切鑒定。和XhoBamH細(xì)胞：轉(zhuǎn) 染SHG-44 （三）重組pcDNA3、分別用100mg/L培養(yǎng)于24孔培養(yǎng)板一G418 SHG-44 1、G418篩選濃度測定：復(fù)孔，設(shè)正常加入，各濃度3、500mg/L、 轉(zhuǎn)染細(xì)胞共孵育的過程中，血清乂是培養(yǎng)基的一部分。C預(yù)溫。在轉(zhuǎn)染之前更 換培養(yǎng)基，可提高轉(zhuǎn)染效率，但所用培養(yǎng)基必須373. 混合物應(yīng)當(dāng)逐滴加入，盡可能保持一致，從培養(yǎng)皿一邊到另一邊，/DNA脂質(zhì) 體4、 邊加入邊輕搖培養(yǎng)

43、川L,以確保均勻分布和避免局部高濃度。 常見問題和解答：96孔辦法效率高。Q：我覺得套環(huán)法操作不如96用如果克 隆效率較低的細(xì)胞，套環(huán)可能更好：也不一定A依據(jù)實(shí)驗(yàn)U的與要求而定. 即使是增加到每孔十兒個細(xì)胞或上如果不是每孔單個細(xì)胞,就不能保證是單克隆 孔板法，萬個細(xì)胞個板）0010 個96孔板也只能培養(yǎng)一萬個細(xì)胞，十萬個細(xì)胞就 至少需要白個，且細(xì)胞在單獨(dú)生長條對于轉(zhuǎn)基因細(xì)胞篩選或基因打靶丄作量就 太大了就需要100個板有因此還得看這位朋友使用的是什么細(xì)胞”件下,遠(yuǎn)遠(yuǎn)不 如千萬個細(xì)胞共同培養(yǎng)活力好需要的單細(xì)胞克隆株數(shù)篩選還是不篩選”轉(zhuǎn)基因還 是非轉(zhuǎn)基因限細(xì)胞系還是無限細(xì)胞系,？量多少 篩抗性基因

44、的質(zhì)粒后，如何用G418Q：請問一種細(xì)胞如果轉(zhuǎn)染了穩(wěn)定表達(dá)的， 含neo兒篇文獻(xiàn)后發(fā)現(xiàn)沒有一個定論的說法。即使對于同一種細(xì)胞50選？我查 看了國內(nèi)、外其篩選劑量和篩選時間也不一樣。我自己認(rèn)為，從理論上講，如果 穩(wěn)定表達(dá)最好要一直篩選到細(xì)胞傳代后。不知這種觀點(diǎn)對不對。然而開始篩選的 劑量、維持劑量以及篩選持 續(xù)時間乂該如何確定？維持劑量與開始篩選時的劑 量是否有一定關(guān)系？加100U1篩選要做預(yù)試驗(yàn)確定最佳濃度，將細(xì)胞稀釋至 1000cell/ml,每孔 A： 1. G4180,100, 200,300, 400,500, 600,700,濃度稀釋至將 每孔中的G418入有培養(yǎng)基的24孔板，以最低

45、細(xì)胞全部死亡濃度為基天，培養(yǎng) 10-14800,900,1000J100ng/ml 等 1 2 個級別 8 0 0左右，篩選時比該濃度再高一個級別，維持使用篩選濃度的一半。準(zhǔn), 一般400代以后用維持量，但不能不用，因?yàn)橛袝r候抗性基因會丟失，2。我 們掌握是傳過10 ,很快會形成優(yōu)勢的。如果沒有G418G418抗性，也不一定 有目的基因，單克隆化操作是很重要的。3。即是有 :請問：能談一談單克隆化操作的步驟以及其與LI的基因表達(dá)的關(guān)系嗎？ Q： 轉(zhuǎn)染后，每個細(xì)胞內(nèi)LI的基因與宿主染色體的整合狀況是不同的，I的蛋口表達(dá) 有A的多，有的少，外源蛋白表達(dá)少的細(xì)胞山于代謝負(fù)荷較小，所以生長較快， 在生

46、長若干表達(dá)最弱的細(xì)胞會山于競爭優(yōu)勢占主要，長期之后，代之后，表達(dá)少 的細(xì)胞會形成優(yōu)勢，轉(zhuǎn)綠色熒光蛋白基因后，表達(dá)越來越暗就是這個道理。所以， 要進(jìn)行單克隆化操作，使得到的均來自于同一祖先細(xì)胞，遺傳性狀盡量一致也 是對高表達(dá)細(xì)胞的保護(hù)。操作用左右就可以進(jìn)行該操作了，該孔板法，每代細(xì)胞 長滿后，大多數(shù)凍存，留2 0 0 96cell方法在很多關(guān)于單克隆抗體和細(xì)胞原代培 養(yǎng)書中均有講述，我就不贅述了。必須指出，單克隆化要做兒遍，一遍是不夠的， 我前十代都是這樣的，結(jié)果綠色熒光蛋白不但沒減弱，反而增強(qiáng)了很多?，F(xiàn)在 很多代了，很穩(wěn)定。 基因，好像就不存在外源蛋口表達(dá)少的細(xì)胞形與neoSV40Q： 1。我

47、的質(zhì) 粒中含有成優(yōu)勢這個問題了吧（弋，篩選要進(jìn)行。2按您的講法，10那么維 持劑量要進(jìn)行多長時間？如果我使用對照組 在對照組細(xì)胞全部死亡后就用維持劑量進(jìn)行培養(yǎng)行嗎？對G4183o在細(xì)胞用胰 酶進(jìn)行傳代時，此時細(xì)胞膜受到一定影響，如果培養(yǎng)基中存在 細(xì)胞是否有影響? 對之都無影響？從理論上講是否無論多大濃度的G4184o既然細(xì)胞表達(dá)neo,可以 肯定的是，外源基因與宿主染色體之間的整合是隨機(jī)的而且不是單拷貝的，1A： 立體結(jié)驗(yàn)證過，表達(dá)量與整合數(shù)LE上游序列特性，特定部位FISHDNA這點(diǎn)我 們做過只是增加了表達(dá)了數(shù)LI,但并不能掩蓋其它因素對表達(dá)的構(gòu)都是相關(guān)的， 裝入了 SV40基因也的細(xì)胞應(yīng)該

48、亮度一致，但實(shí)際上差別很大。neo影響。按你 的講法，轉(zhuǎn)染完GFP是這樣，而且，同一細(xì)胞中不同基因的拷貝數(shù)不會相同， 不同細(xì)胞同一基因的數(shù)LI也不表達(dá)了，但LI的基因丟會相同，這點(diǎn)可以用數(shù)學(xué)關(guān) 于泊松分布的觀點(diǎn)理解。有時，neo失了的情況也是有的。 2。那為什么還要篩選基因？是這樣，用概率論的思維來理解，某一細(xì)胞內(nèi)隨機(jī) 含有一的可能性，及所有拷貝均為另0定數(shù)口拷貝數(shù)外源基因基因，那么，一種 基因拷貝數(shù)為一種基因的概率就很小，很大的概率為外源基因的不均質(zhì)。打個比 方，一個大口袋，抓這些球均為紅球的概率有多大個黃球，然后以從中抓若干個， 1 0 0個紅球，再抓100,實(shí)際上是篩neoneo,黃球就

49、是你的LI的基因。我們 用呢？應(yīng)該是很小的。紅球就是選的外源基因整合的數(shù)Lh怎么說呢？用剛才的 例子來說，如果我們抓著5個紅球，列一次抓著1 0個紅球，可以肯定，的二次 抓的球比較多，那么第二次黃球數(shù)H比第一次多的概率就很大了。因?yàn)槎叱?現(xiàn)的概率比是恒定的。3。維持就是只要養(yǎng)這種細(xì)胞，就要維持?？梢栽俚托?但不能沒有。或者隔一定時間反向思維一下，我不知你是否干臨床，想想抗生素 的用藥原則，從新使用篩選量壓一下，實(shí)際上我們在篩選耐藥株呀。酶來支持， 否則細(xì)胞也要4 1 8濃度就要有更多的Gneo 4 o neo的產(chǎn)物是酶，過高的被毒 死的，而此時過多的酶要求會對細(xì)胞代謝造成太大負(fù)擔(dān)，細(xì)胞可能

50、因此無法完成 分液中生長速度G418裂與增殖，我們曾試過，即使在同一轉(zhuǎn)染陽性細(xì)胞，在不 同濃度的也不同，嚴(yán)重形態(tài)也不同。這就是酶與底物的比例關(guān)系嘛，這回不用數(shù) 論的，用米氏方程理解吧。 5。胰酶的作用不必理會，有的細(xì)胞受影響，還有的細(xì)胞不受影響，山兒代之后， 不受 影響的細(xì)胞會占優(yōu)勢的。 僅是我從臨床抗生素和化療藥的使用原則中悟?qū)绲牡览恚瑢?shí)在是個人經(jīng)驗(yàn)，而且 在基 礎(chǔ)科學(xué)領(lǐng)域頂多算票友，我還是想聽聽諸位專業(yè)人士的理解和經(jīng)驗(yàn)。Another answer: 外源基因整合后的基因表達(dá)量與整合的位置高度相關(guān)，如果整合發(fā)生在活性轉(zhuǎn)錄 染色1 質(zhì)區(qū)，則有利于表達(dá)。通常用的載體是靠非同源重組隨機(jī)整合的，所

51、以為 了獲得高表達(dá)的復(fù)制起始位點(diǎn)，包含SV40細(xì)胞株，需要對重組克隆進(jìn)行篩選。 某些載體如pcDNA3有利于提高質(zhì)粒的隨抗原的細(xì)胞系中復(fù)制，增強(qiáng)瞬時表達(dá), 可以是質(zhì)粒在反式提供大T機(jī)整合兒率。對普通的表達(dá)載體來說，即使抗性基因 表達(dá)也無法保證外源基因的整合，表達(dá)載體隨機(jī)整合的結(jié)果常常導(dǎo)致L的基因 的損壞甚至丟失。 2。關(guān)于概率論的思維，我認(rèn)為紅球和黃球的比喻很形象，但未必準(zhǔn)確。因?yàn)榭?性基因和目的基因有一定的聯(lián)鎖，并不是完全相互獨(dú)立的。 PROTOCOL G418篩選穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系，過濾消10ml的HEPES液中，加蒸鐳水至1.G418 的配制：取lgG418溶于1ml 1M度保存。毒，46細(xì)

52、胞培養(yǎng)：取待測培養(yǎng)細(xì)胞， 制備成細(xì)胞懸液，按等量接種入多孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)2.小時左右開始加藥。范 圍內(nèi)確定兒個梯度，比如先做個lOOOug/mllOOug/ml3.制備篩選培養(yǎng)基：在 制成，按梯度濃度用培養(yǎng)基稀釋1000ug/mlG418400ug/mK 800ug/mK lOOug/ml.篩選培養(yǎng)基。每孔中加入不同濃度的篩選培養(yǎng)PBS洗滌一次，G418 篩選：吸除培養(yǎng)孔中培養(yǎng)基，4加 基。天更換一次篩選培養(yǎng)基。方法同45. 換液：根據(jù)培養(yǎng)基的顏色和細(xì)胞生長情況，每35濃度即為最佳天內(nèi)能夠殺死 所有細(xì)胞的最小14G4186.確定最佳篩選濃度：在篩選10濃度的可能性不大, 最有可能的是出現(xiàn)這種情

53、篩選濃度。在笫一輪就篩選出最佳G418G418的量在 篩選G41814天后還不能殺死細(xì)胞，而用下一個梯度的況：用某一濃度在第而 800ug/ml假如是的量在10天詢就看不到活細(xì)胞了。400ug/ml不能殺死細(xì)胞, 進(jìn)一步篩選，、則可以再用5天就把所有細(xì)胞都?xì)⑺懒耍?500ug/ml600ug/ml700ug/mk 以確定最佳篩選濃度！心得：山于特性明確的細(xì)胞系G418的最佳用量還是比較 穩(wěn)定的，所以有時候不需要在這么大范圍內(nèi)進(jìn)行篩選。比如說你要轉(zhuǎn)染NIH3T3 細(xì)胞，現(xiàn)在我告訴你我測試過NIH3T3細(xì)胞對G418的敬感性，我用的篩選濃度 是200 ug/mlo這時你就可以做150ug/ml、2

54、00ug/ml 300ug/ml三個濃度進(jìn) 行篩選。 通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定了最佳篩選濃度后，就可以做穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了。 a轉(zhuǎn)染：轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24小時或者更長，到細(xì)胞增長接近匯合時按1： 4密度傳 代，繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞密度增至50%70%匯合時； b加G418法掉培養(yǎng)液，PBS洗一次，加入按最佳篩選濃度配制好的G418篩選 培養(yǎng)基。 c換液：根據(jù)培養(yǎng)基的顏色和細(xì)胞生長情況，每35天更換一次篩選培養(yǎng)基。 當(dāng)有大量細(xì)胞死亡時，可以把G418濃度減半維持篩選。篩選1014天后，可 見有抗性的克隆出現(xiàn)，停藥培養(yǎng)，待其逐漸增大后； d挑單克隆：制備細(xì)胞懸液，細(xì)胞訃數(shù)，用培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞到1個/10uh在96 孔板中加入培

55、養(yǎng)基150ul/?L,再加入細(xì)胞懸液10ul/孔。待其逐漸增大后轉(zhuǎn)入到 48孔中增殖。 e單克隆鑒定：細(xì)胞大量擴(kuò)增后，提取總RNA,做RT-PCR檢測U的基因是否存 在。 常見問題： 1 轉(zhuǎn)進(jìn)去的重組質(zhì)粒以什么形式存在于細(xì)胞內(nèi)的？ 無怪乎兩種形式：整合在染色體中和存在于細(xì)胞質(zhì)中。沒有經(jīng)過篩選前大部分轉(zhuǎn) 染進(jìn)細(xì)胞的質(zhì)粒是存在于胞質(zhì)中的，但是這種質(zhì)粒是不穩(wěn)定的，基本上篩選不出 這種單克隆，只有穩(wěn)定整合入染色體的才是我們想要的穩(wěn)定細(xì)胞系。 2.neo基因和目的基因是不是一定會整合在一起？ 整合是隨機(jī)發(fā)生的非同源性重組，neo基因表達(dá)而U的基因不一定都表達(dá)，所以 在篩選之后還要用RT-PCR的方法進(jìn)一

56、步鑒定。 培養(yǎng)基處理的個人技巧 體內(nèi)的任何細(xì)胞被置于體外培養(yǎng)后，對環(huán)境都有一個適應(yīng)過程，期間細(xì)胞對培養(yǎng) 液具有同化作用，即細(xì)胞從培養(yǎng)液中攝取營養(yǎng)的同時，也向培養(yǎng)液排出自己的代 謝產(chǎn)物和其它一些物質(zhì)，其中有排泄物也有促細(xì)胞生長因子。這個過程也是細(xì)胞 同化培養(yǎng)基的過程。細(xì)胞越多則其同化作用越強(qiáng)，所以細(xì)胞數(shù)LI多比數(shù)LI少較易 生長。在篩選后期，大批細(xì)胞死亡，不換液沒有死亡的細(xì)胞就會受到死亡細(xì)胞的 影響，換液后殘留的少量細(xì)胞對培 養(yǎng)基的同化作用不強(qiáng)，也不利于生長。我是用適應(yīng)性培養(yǎng)基來解決這一問題的： 適應(yīng)性培養(yǎng)基的配制小時后，吸出48培養(yǎng)同源細(xì)胞至半?yún)R合狀態(tài)時，更換一 次培養(yǎng)液，再繼續(xù)培養(yǎng)a 24所

57、有培養(yǎng)液4000rpm 10 min后，吸取上清液b離 心：3000倍體積的新鮮培養(yǎng)基，低溫凍存?zhèn)溆谩?22umc慮過：再經(jīng)直徑濾 器過濾，再加入2 篩選實(shí)驗(yàn)相關(guān)問題G418 天內(nèi)細(xì)胞死亡的最小濃度，然篩選預(yù)實(shí)驗(yàn)用未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞做，選1014問：G418 后將更高一級別的濃度應(yīng)用于轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，是這樣嗎？ 答：G418是一種細(xì)胞毒性藥物（氨基糖昔類抗生素），依不同濃度，對細(xì)胞有一 定的抑制或殺傷作用，而擬轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒上帶有G418的藥代酶，能降解G418, 從而使細(xì)胞獲得對G418的耐藥性。也就是說轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞可以耐受G418,而 未轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞不能耐受G418,因而被殺滅或抑制。通過G418篩選

58、體系， 使得未轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞比例不斷減少，轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞比例不斷增高。如果G418 濃度太高則會殺傷所有的細(xì)胞，如果G418濃度太低則沒有什么毒性，兩種情況 都不能起到篩選作用。G418篩選預(yù)實(shí)驗(yàn)則是先用未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞做，選14天內(nèi) 細(xì)胞死亡的最小濃度應(yīng)用于轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，因?yàn)椴煌募?xì)胞對G418的耐受性也不 一樣，這樣的U的是找一個實(shí)驗(yàn)細(xì)胞能耐受G418的匸作濃度，從而為篩選轉(zhuǎn)染 的細(xì)胞打下基礎(chǔ)，因?yàn)檫@種濃度只能抑制未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，而不抑制轉(zhuǎn)染成功的細(xì) 胞的！從而起到篩選作用。建議你再多查找一下國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，實(shí)驗(yàn)動手之前 一定要明白其原理,要不然會很盲（J,充分的準(zhǔn)備可以避免走很多不必要的彎路!

59、問：第二次篩選要怎么做？ 以殺傷或第二次篩選就是將轉(zhuǎn)染好的細(xì)胞接種培養(yǎng)后，向培養(yǎng)液中加入G418答：, 所以要抑制其中的未轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞，因?yàn)椴还苻D(zhuǎn)染效率多么高，都不可能是 100%篩選體系（或者其他篩選體系）來篩掉那些沒有成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，此時加 入通過G418的濃度可以略高于你笫一次預(yù)實(shí)驗(yàn)時摸索出來的“最小有效濃度S 實(shí)驗(yàn)中可以G418再根據(jù)細(xì)胞生長情況進(jìn)行濃度的調(diào)整！第二次篩選是經(jīng)過第一 次篩選以后，已經(jīng)篩選出一部分轉(zhuǎn)染細(xì)胞了，但是因?yàn)閱枺哼@時候次篩選，有些 細(xì)胞還是會丟失U的基因所以要得到穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞還要進(jìn)行2-3還是用原來 預(yù)實(shí)驗(yàn)的濃度，還是要再提高一個濃度？你要在熒光顯微鏡下觀察一下，判斷一 下細(xì)胞轉(zhuǎn)染的效率，也就是轉(zhuǎn)染成功的答：細(xì)胞的比例，再根據(jù)情況選用或高或 低的濃度！轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞的比例越高，則加入的