高效液相色譜法測定奶粉中三聚氰胺的含量

1、 畢業(yè)論文 論文題目：高效液相色譜法測定奶粉中三聚氰胺的含量 所在學(xué)院： 食品工程分院 專業(yè)班級： 學(xué) 生： 指導(dǎo)教師： 二0一五年四月目 錄題目摘要及關(guān)鍵詞1 前言11.1 三聚氰胺11.1.1 三聚氰胺的毒性11.1.2 人體對三聚氰胺耐受標(biāo)準(zhǔn)11.1.3 三聚氰胺為何用于摻假 21.2 相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)及檢測方法22.實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c實(shí)驗(yàn)原理32.1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?2.2 實(shí)驗(yàn)原理33 設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)具體材料和方法的操作步驟33.1 試劑與材料33.2 儀器和設(shè)備33.3 樣品處理33.3.1 提取33.3.2 凈化33.4 高效液相色譜測定43.4.1 HPLC條件43.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制43.4.3 定

2、量測定53.4.4 結(jié)果計(jì)算54.實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析判定54.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果54.2 結(jié)果分析判定55 結(jié)論5參考文獻(xiàn)7致謝8高效液相色譜法測定奶粉中三聚氰胺的含量摘 要：三聚氰胺是一種低毒的化工原料。動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，其在動物體內(nèi)代謝很快且不會存留，主要影響泌尿系統(tǒng)。乳制品中添加三聚氰胺會使得食品的蛋白質(zhì)測試含量偏高，從而使劣質(zhì)食品通過食品檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)的測試。就送檢的奶粉樣品，采用高效液相色譜法（HPLC）測定其中三聚氰胺的含量。關(guān)鍵詞：三聚氰胺；食品質(zhì)量與安全；奶粉；標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)；高效液相色譜；檢測Determine the melamine contents in milk powder by HPL

3、CAbstract：The melamine is one kind of low-toxin industrial chemicals. Animal experiments show that its metabolism in animals is quick and would not persist. Adding melamine in dairy products will cause the result of protein contents testing to be higher,by which those inferior goods can pass tests o

4、perated by Food Inspection Service.This thesis is about a determination of melamine contents by HPLC in milk power samples.Key words: melamine；Food Quality and Safety；milk；criterion HPLC；test 1 前言進(jìn)入新世紀(jì)以來，我國的奶業(yè)發(fā)展連年創(chuàng)造輝煌，無論是奶牛存欄頭數(shù)還是總產(chǎn)奶量都在以驚人的速度增長。在2000年至2007年期間，全國的奶牛存欄量增長了1.5倍，牛奶產(chǎn)量增長了3.3倍。然而，當(dāng)時間的指針指向20

5、08年9月11日的那一刻，也就是從三鹿集團(tuán)正是向社會承認(rèn)三聚氰胺問題奶粉的那一刻起，使一個原本健康的朝陽產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)瞬間成為一個“病?；颊摺保瑯I(yè)界多年創(chuàng)造的輝煌已成為歷史?！叭矍璋纺谭邸笔录挥嘘P(guān)媒體披露后，全社會為之震動，有人稱之為“奶業(yè)地震”，更有甚者稱之為食品行業(yè)的“9. 11”。1.1 三聚氰胺三聚氰胺（英文名Melamine），是一種三嗪類含氮雜環(huán)有機(jī)化合物，重要的氮雜環(huán)有機(jī)化工原料。簡稱三胺，又叫2 ,4 ,6- 三氨基-1,3,5-三嗪、1,3,5-三嗪-2,4,6-三胺、2,4,6-三氨基脲、蜜胺、三聚氰酰胺、氰脲三酰胺。三聚氰胺性狀為純白色單斜棱晶體，無味，密度1.573gcm3

6、 (16)。常壓熔點(diǎn)354（分解）；快速加熱升華，升華溫度300。溶于熱水，水溶性 3 G/L (20 C)，微溶于冷水，極微溶于熱乙醇，不溶于醚、苯和四氯化碳，可溶于甲醇、甲醛、乙酸、熱乙二醇、甘油、吡啶等。低毒。在一般情況下較穩(wěn)定，但在高溫下可能會分解放出氰化物，分解時同時放出不支持燃燒的氮?dú)?，因此可作阻燃劑。三聚氰胺是一種用途廣泛的基本有機(jī)化工中間產(chǎn)品，最主要的用途是作為生產(chǎn)三聚氰胺甲醛樹脂（MF）的原料。三聚氰胺還可以作阻燃劑、減水劑、甲醛清潔劑等。該樹脂硬度比 1脲醛樹脂高，不易燃，耐水、耐熱、耐老化、耐電弧、耐化學(xué)腐蝕、有良好的絕緣性能、光澤度和機(jī)械強(qiáng)度，廣泛運(yùn)用于木材、塑料、涂料

7、、造紙、紡織、皮革、電氣、醫(yī)藥等行業(yè)。1.1.1 三聚氰胺的毒性目前三聚氰胺被認(rèn)為毒性輕微，大鼠口服的半數(shù)致死量大于3克/公斤體重。據(jù)1945年的一個實(shí)驗(yàn)報(bào)道：將大劑量的三聚氰胺飼喂給大鼠、兔和狗后沒有觀察到明顯的中毒現(xiàn)象。動物長期攝入三聚氰胺會造成生殖、泌尿系統(tǒng)的損害，膀胱、腎部結(jié)石，并可進(jìn)一步誘發(fā)膀胱癌。1994年國際化學(xué)品安全規(guī)劃署和歐洲聯(lián)盟委員會合編的國際化學(xué)品安全手冊第三卷和國際化學(xué)品安全卡片也只說明：長期或反復(fù)大量攝入三聚氰胺可能對腎與膀胱產(chǎn)生影響，導(dǎo)致產(chǎn)生結(jié)石。1.1.2 人體對三聚氰胺耐受標(biāo)準(zhǔn)三聚氰胺是一種低毒的化工原料。動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，其在動物體內(nèi)代謝很快且不會存留，主要影

8、響泌尿系統(tǒng)。三聚氰胺量劑和臨床疾病之間存在明顯的量效關(guān)系。三聚氰胺在嬰兒 體內(nèi)最大耐受量為每公斤奶粉15毫克。專家對受污染嬰幼兒配方奶粉進(jìn)行的風(fēng)險(xiǎn)評估顯示，以體重7公斤的嬰兒為例，假設(shè)每日攝入奶粉150克，其安全預(yù)值即最大耐受量為15毫克/公斤奶粉。根據(jù)美國食物及藥物管理局的標(biāo)準(zhǔn)，三聚氰胺每日可容忍攝入量為每日0.63毫克/公斤體重。1.1.3 三聚氰胺為何用于摻假蛋白質(zhì)主要由氨基酸組成。在當(dāng)前的食品檢測當(dāng)中，蛋白質(zhì)的檢測通常是測出食品中的含氮量，推算其中的蛋白質(zhì)含量。這種測定蛋白質(zhì)含量的方法稱為“凱氏定氮法”。蛋白質(zhì)平均含氮量為16左右，而三聚氰胺的含氮量為66左右。因此，添加三聚氰胺會使得

9、食品的蛋白質(zhì)測試含量偏高，從而使劣質(zhì)食品通過食品檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)的測試。據(jù)估算在植物蛋白粉和飼料中使測試蛋白質(zhì)含量增加一個百分點(diǎn)，用三聚氰胺的花費(fèi)只有真實(shí)蛋白原料的1/5。三聚氰胺作為一種白色結(jié)晶粉末，沒有什么氣味和味道，所以摻雜后不易被發(fā)現(xiàn)。加之目前我國食品和飼料當(dāng)中蛋白質(zhì)含量檢測最主要辦法即為來自上述的“凱氏定氮法”，此法只能測出含氮量，并不能區(qū)別飼料中有無合規(guī)添加劑或違規(guī)化學(xué)物質(zhì)，由此，價廉且容易獲得的三聚氰胺便可以堂而皇之地代替了真正的蛋白質(zhì)而混入嬰幼兒食用的配方奶粉之中。然而，三聚氫胺本身幾乎沒有任何營養(yǎng)價值，并不能真正替代蛋白質(zhì)，添加之后，只能造成蛋白質(zhì)含量提高的假象，奶粉當(dāng)中的營養(yǎng)物質(zhì)含

10、量必然大大低于正常值。利用食品和飼料工業(yè)蛋白質(zhì)含量測試方法的缺陷，三聚氰胺也常被不法商人用作食品添加劑，以提升食品檢測中的蛋白質(zhì)含量指標(biāo)，因此三聚氰胺也被人稱為“蛋白精”。國家質(zhì)檢總局緊急在全國開展了嬰幼兒奶粉三聚氰胺含量專項(xiàng)檢查。此次專項(xiàng)檢查對其余109家企業(yè)進(jìn)行了排查，共檢驗(yàn)了這些企業(yè)的491批次產(chǎn)品。階段性檢查結(jié)果顯示，有22家嬰幼兒奶粉生產(chǎn)企業(yè)的69批次產(chǎn)品檢出了含量不同的三聚氰胺。1.2 相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)及檢測方法針對以上事實(shí)及造成的危害，國家有關(guān)部門衛(wèi)生部、質(zhì)檢總局、農(nóng)業(yè)部、工商總局等及時作出應(yīng)對措施，由中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)院、中國疾病預(yù)防控制中心、國家食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)中心、國家乳制品質(zhì)量

11、監(jiān)督檢驗(yàn)中心等單位起草并通過對原料乳、乳制品及含乳制品中三聚氰胺含量的檢測發(fā)布國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 22388-2008。本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了原料乳、乳制品及含乳制品中三聚氰胺的檢測方法，即高效液相色譜法（HPLC）、液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法（LC-MS/MS）和氣相色譜聯(lián)用法包括氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS），氣相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法（GC-MS/MS）。三者均適用于原料乳、乳制品及含乳制品中三聚氰胺的定量測定。其中，后兩者還同時適用于原料乳、乳制品及含乳制品中三聚氰胺定性確證。其定量限分別為高效液相色譜法（HPLC）2mg/kg，液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法（LC-MS/MS）0.01mg/kg, 氣相色譜-質(zhì)

12、譜法（GC-MS）0.05mg/kg，氣相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法（GC-MS/MS）0.05mg/kg。就送檢的奶粉樣品，采用高效液相色譜法（HPLC）測定其中三聚氰胺的含量，其具體過程如下：2.實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c實(shí)驗(yàn)原理 2.1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康臏y定奶粉樣品中三聚氰胺的含量。2.2 實(shí)驗(yàn)原理試樣用三氯乙酸溶液-乙腈提取，經(jīng)陽離子交換固相萃取柱凈化后，用高效液相色譜測定，外標(biāo)法定量。3 設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)具體材料和方法的操作步驟3.1 試劑與材料除非另有說明，所有試劑均為分析純，水為GB/T 6682規(guī)定的一級水。 試劑與材料如下：（1）甲醇：色譜純。（2）乙腈：色譜純。（3）氨水：含量為25%28%。（4）三氯乙酸。（5

13、）檸檬酸。（6） 庚烷磺酸鈉：色譜純。（7） 甲醇水溶液：準(zhǔn)確量取50mL甲醇和50mL水，混勻后備用。（8）三氯乙酸水溶液（1%）：準(zhǔn)確稱取10g三氯乙酸于1L容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，混勻后備用。（9）氨化甲醇溶液（5%）：準(zhǔn)確量取5mL氨水和95mL甲醇，混勻后備用。（10） 離子對試劑緩沖液：準(zhǔn)確稱取2.10g檸檬酸和2.16g庚烷磺酸鈉，加入約980mL水溶解，調(diào)節(jié)PH至3.0后，定容至1L備用。（11）三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品：CAS 108-78-01，純度大于99.0%。（12） 三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲備液：準(zhǔn)確稱取100mg（精確到0.1mg）三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品于100mL容量瓶中，用甲醇水

14、溶液溶解并定容至刻度，配制成濃度為1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于4避光保存。（13） 陽離子交換固相萃取柱：混合型陽離子交換固相萃取柱，基質(zhì)為苯磺酸化的聚苯乙烯-二乙烯基苯高聚物，60mg，3mL。使用前用3mL甲醇、5mL水活化。（14） 定性濾紙。（15 ）微孔濾膜：0.2m，有機(jī)相。（16） 氮?dú)猓杭兌?9.999%。3.2 儀器和設(shè)備 儀器和設(shè)備如下：（1）高效液相色譜（HPLC）儀：配有紫外檢測器或二極管陣列檢測器。（）分析天平：感量為0.0001g和0.01g。（）離心機(jī)：轉(zhuǎn)速不低于4000 r/min。（4）超聲波水浴。（5 ）固相萃取裝置。（6 ）氮?dú)獯蹈蓛x。（7 ）渦旋混合器。

15、（8）具塞塑料離心管：50mL。3.3 樣品處理3.3.1 提取稱取2g（精確至0.01g）試樣于50mL具塞塑料離心管中，加入15mL三氯乙酸溶液和5mL乙腈，超聲提取10min后，以不低于4000 r/min轉(zhuǎn)速離心10min。上清液經(jīng)三氯乙酸溶液潤濕的濾紙過濾后，用三氯乙酸溶液定容至25mL，移取5mL，加入5mL水混勻后做待凈化液。3.3.2 凈化用3mL甲醇，5mL水淋洗固相萃取柱（3.1.13），將3.3.1中的待凈化液轉(zhuǎn)移至萃取柱中。依次用3mL水和3mL甲醇洗滌，抽至近干后，用6mL氨化甲醇溶液（3.1.9）洗脫。整個固相萃取過程流速不超過1mL/min。洗脫液于50下用氮?dú)猓?/p>

16、3.1.16）吹干，殘留物（相 4當(dāng)于0.4g樣品）用1mL流動相定容，渦旋混合1min，過微孔濾膜（3.1.15）后，用HPLC儀測定。3.4 高效液相色譜測定3.4.1 HPLC條件 儀器型號：Alliance 2695 。 環(huán)境條件： 溫度：22 。 相對濕度：38%RH 。 色譜柱：C18 ，250mm4.6mm（i.d.），5m。 流動相：離子對試劑緩沖液（3.1.10）-乙腈（90+10，體積比），混勻。 流速：1.0mL/min。 柱溫：40 。 波長：240nm。 檢測器：PDA。 進(jìn)樣量：10L。3.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制參照GB/T 22388-2008，用流動相將三聚氰胺

17、標(biāo)準(zhǔn)儲備液逐級稀釋得到的濃度為0.8、2.0、20.0、40.0、80.0g/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，濃度由低到高進(jìn)樣檢測，以峰面積-濃度作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程?；|(zhì)匹配加標(biāo)三聚氰胺的樣品HPLC色譜圖參見下圖三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖圖基質(zhì)匹配加標(biāo)三聚氰胺的樣品色譜圖figure A With respect to matrix matching melamine samples by HPLC chromatograms3.4.3 定量測定待測樣液中三聚氰胺的響應(yīng)值應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)，超過線性范圍則應(yīng)稀釋后再進(jìn)樣分析。3.4.4 結(jié)果計(jì)算液相色譜測定三聚氰胺數(shù)據(jù)記錄4.實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析判定4.1

18、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果在符合要求的條件及規(guī)范的操作步驟的前提下，經(jīng)檢驗(yàn)該樣品的三聚氰胺含量為6.90mg/kg。4.2 結(jié)果分析判定根據(jù)GB/T 22388-2008規(guī)定，該樣品三聚氰胺含量6.90mg/kg，大于規(guī)定的2mg/kg，產(chǎn)品不合格。5 結(jié)論檢測是手段，乳制品的質(zhì)量安全才是最終的目的。一旦發(fā)生食品質(zhì)量安全事故，首先受到傷害的是消費(fèi)者。在受到傷害的情況下，消費(fèi)者對食品質(zhì)量安全事故做出的第一反應(yīng)就是拒絕繼續(xù)消費(fèi)問題產(chǎn)品。于是就造成了一系列的食品質(zhì)量安全“傷害效應(yīng)”，表現(xiàn)為對消費(fèi)者產(chǎn)生的傷害效應(yīng)、對加工企業(yè)和奶站產(chǎn)生的傷害效應(yīng)和對廣大奶農(nóng)產(chǎn)生了傷害效應(yīng)?！叭矍璋纺谭邸笔录l(fā)生后，由于一些西方媒體的渲染，引起了部分國外消費(fèi)者對中國食品的恐慌。然而，要恢復(fù)我國食品行業(yè)在國際上的地位和影響，需要漫長的時間和更加艱辛的努力?？傮w上看，我國奶業(yè)在農(nóng)業(yè)中依然是一個發(fā)展相對滯后的產(chǎn)業(yè)，牛奶的人均占有量和消費(fèi)量都顯著低于世界平均水平，與發(fā)達(dá)國家的差距更大。要縮小我國奶業(yè)與世界及發(fā)達(dá)國家的差距，今后的道路還很漫長，任務(wù)還相當(dāng)艱巨，需要以科學(xué)發(fā)展觀為指導(dǎo)，把我國奶業(yè)引向健康發(fā)展之路。當(dāng)前我國奶業(yè)所面臨的體制、機(jī)制以及技術(shù)層面的問題有許多，需要長期努力逐步加以解決。從長遠(yuǎn)發(fā)展戰(zhàn)略的高度出發(fā)，對今后如何提高我國奶業(yè)