T∕CALAS 25-2017 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 小鼠肝炎病毒PCR檢測(cè)方法 實(shí)施指南

1、第二十五章T/CALAS 25-2017實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 小鼠肝炎病毒PCR檢測(cè)方法實(shí)施指南第一節(jié)工作簡(jiǎn)況根據(jù)中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)會(huì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)化專業(yè)委員會(huì)的下達(dá)的2016年團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)制（修） 訂計(jì)劃，由廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所和中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所共同負(fù)責(zé)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物小鼠肝炎病毒PCR檢測(cè)方法起草工作。該項(xiàng)目由全國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù) 委員會(huì)（SAC/TC281）技術(shù)審查，由中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)會(huì)歸口管理。本標(biāo)準(zhǔn)的編制工作是按照中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GBZT1.1 2009標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則 第1部分“標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫規(guī)則”的要求進(jìn)行編寫的。本標(biāo)準(zhǔn)是在國(guó)家科技支撐計(jì)劃“實(shí) 驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)關(guān)鍵技術(shù)研究”（項(xiàng)目

2、編號(hào)2013BAK11B01）和廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目“廣東 省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)”（項(xiàng)目編號(hào)2011B040200010）課題基礎(chǔ)上制定而成的，在制定過(guò) 程中參考了國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)方法的敏感性、特異性、重復(fù)性等進(jìn)行了研究，并對(duì)所建 立的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行了應(yīng)用研究，建立了可行、穩(wěn)定、特異的小鼠肝炎病毒PCR檢測(cè)方法。第二節(jié)工作過(guò)程本標(biāo)準(zhǔn)由中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)會(huì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)化專業(yè)委員會(huì)提出，廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所 和中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所按照?qǐng)F(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)研制要求和編寫工作的程序，組成了由 單位專家和專業(yè)技術(shù)人員參加的編寫小組，制定了編寫方案，并就編寫工作進(jìn)行了任務(wù)分 工。編制小組根據(jù)任務(wù)分工進(jìn)行了資料收

3、集和調(diào)查研究工作，在國(guó)家科技支撐計(jì)劃“實(shí)驗(yàn) 動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)關(guān)鍵技術(shù)研究”（項(xiàng)目編號(hào)2013BAK11B01）和廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目“廣東 省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)”（項(xiàng)目編號(hào)2011B040200010）課題研究基礎(chǔ)上，組織編寫小鼠 肝炎病毒PCR檢測(cè)方法技術(shù)資料，于2016年4月完成了標(biāo)準(zhǔn)草案的起草工作。標(biāo)準(zhǔn)草案 首先征求中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)會(huì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)化專業(yè)委員會(huì)的意見，2016年10月在南寧召開 團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)征求意見會(huì)議，參會(huì)專家對(duì)標(biāo)準(zhǔn)稿提出了系列修訂建議和意見。根據(jù)提出的意見 編制組對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 小鼠肝炎病毒PCR檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)草案進(jìn)行修改。結(jié)合調(diào)研、試 驗(yàn)驗(yàn)證，形成本標(biāo)準(zhǔn)征求意見稿。2016年11月至

4、12月，標(biāo)準(zhǔn)征求意見稿在中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)會(huì)網(wǎng)站公開征求意見，共 收集意見或建議9個(gè)，編制組根據(jù)專家提出的修改意見和建議，采納9個(gè)，未采納0個(gè)。 經(jīng)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 小鼠肝炎病毒PCR檢測(cè)方法團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)整理修改后形成標(biāo)準(zhǔn)送審稿、 醐國(guó)醐獲系列標(biāo)象：標(biāo)準(zhǔn)送審稿編制說(shuō)明和征求意見匯總處理表。2017年2月21日，全國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)在北京召開了標(biāo)準(zhǔn)送審稿專家審 查會(huì)。會(huì)議由全國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)的委員組成審查組，認(rèn)真討說(shuō)了標(biāo)準(zhǔn)送審稿 編制說(shuō)明、征求意見匯總處理表，提出了修改意見和建議。與會(huì)專家認(rèn)為本標(biāo)準(zhǔn)填補(bǔ)了小 鼠肝炎病毒分子檢測(cè)方法空白，是國(guó)標(biāo)的有力補(bǔ)充，一致同意通過(guò)審查。會(huì)后，編制組根 據(jù)與

5、會(huì)專家提出的修改意見，經(jīng)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 小鼠肝炎病毒PCR檢測(cè)方法團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn) 修改完善后形成標(biāo)準(zhǔn)報(bào)批稿、標(biāo)準(zhǔn)報(bào)批稿編制說(shuō)明和征求意見處理匯總表。2017年5月，本標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)會(huì)第六屆理事會(huì)常務(wù)理事會(huì)第八次會(huì)議審議 通過(guò)，批準(zhǔn)發(fā)布，于2017年5月19日起正式實(shí)施。第三節(jié)編寫背景小鼠肝炎病毒（murine hepatitis virus，MHV ）屬于冠狀病毒科成員，是一類RNA病毒, 最早于1949年發(fā)現(xiàn)，此后研究者們先后從小鼠和新生乳鼠中分離到MHV。根據(jù)其組織 嗜性的不同，可將其分為呼吸株（Respiratiory MHV strain）和嗜腸株（Enterotropic MHV str

6、ain）兩型。MHV帶毒小鼠分布于全世界，正常情況下呈隱性感染，只在應(yīng)激因素激發(fā) 下才成為致死性疾病，表現(xiàn)為肝炎、腦炎和腸炎。感染取決于毒株、宿主的年齡和感染途 徑。自然感染限制在嚙齒動(dòng)物。MHV不僅嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)小鼠質(zhì)量，還對(duì)科學(xué)研究工作造 成潛在干擾，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，是國(guó)標(biāo)中SPF級(jí)小鼠需要排除的病原體, 快速準(zhǔn)確地檢測(cè)MHV是有效防制讀病的前提。目前，國(guó)內(nèi)MHV感染診斷方法主要是針 對(duì)抗體檢測(cè)的血清學(xué)檢測(cè)方法如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、免疫酶試驗(yàn)（IEA）和免疫 熒光試驗(yàn)（IFA）等，但是這些方法不能應(yīng)用于免疫功能低下或免疫缺陷小鼠如SCID小 鼠和裸小鼠等的檢測(cè)，因?yàn)?/p>

7、它們不能產(chǎn)生正常的抗體反應(yīng)，而且，血清抗體檢測(cè)有一定局 限性，一般只有活體動(dòng)物才能采集血清用于檢測(cè)，對(duì)病死動(dòng)物和一些動(dòng)物源性的生物制品 （如動(dòng)物細(xì)胞，及其他生物材料）檢測(cè)造成限制?？乖瓩z測(cè)方面，常規(guī)病毒分離鑒定方法 既復(fù)雜又煩瑣，不利于日常檢測(cè)。隨著分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的各種分子生物學(xué)診斷技術(shù)成為 MHV病毒感染診斷的重要手段。PCR病原檢測(cè)方法具有特異性強(qiáng)、敏感度高、診斷快速 等傳統(tǒng)診斷方法所無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn)。美國(guó)和歐盟許多實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室都推薦采用 PCR技術(shù)作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病原的檢測(cè)方法。國(guó)內(nèi)一些實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢測(cè)機(jī)構(gòu)也開展了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 病原PCR檢測(cè)技術(shù)研究，增加實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病

8、毒分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)方法主要應(yīng)用于無(wú)血清 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物樣本的快速檢測(cè)是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量控制必不可少的方法。廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所自 2011年起進(jìn)行小鼠肝炎病毒熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法研究，通過(guò)大量臨床樣本試驗(yàn)證明 建立的方法敏感高、特異強(qiáng)、重復(fù)性好。第四節(jié)編制原則本標(biāo)準(zhǔn)的編制主要遵循以下原則：一是科學(xué)性原則。在尊重科學(xué)、親身實(shí)踐、調(diào)查研第二十五章 T/CALAS252017實(shí)驗(yàn)動(dòng)物小鼠賴醺霧究的基礎(chǔ)上，制定本標(biāo)準(zhǔn)。二是可操作性原則。本標(biāo)準(zhǔn)無(wú)論是從樣品采集、處理、RNA 抽提、PCR反應(yīng)，均操作簡(jiǎn)單，僅需4小時(shí)既可完成。具有可操作性和實(shí)用性。三是協(xié)調(diào) 性原則。以切實(shí)提高我國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物小鼠肝炎病毒檢測(cè)技

9、術(shù)水平為核心，符合我國(guó)現(xiàn)行有關(guān) 法律、法規(guī)和相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)要求。第五節(jié)內(nèi)容解讀本標(biāo)準(zhǔn)由范圍、規(guī)范性引用文件、縮略語(yǔ)、檢測(cè)方法原理、主要設(shè)備和材料、試劑、 檢測(cè)方法、結(jié)果判定、檢測(cè)過(guò)程中防止交叉污染的措施、附錄共十章構(gòu)成?，F(xiàn)將實(shí)驗(yàn)動(dòng) 物小鼠肝炎病毒PCR檢測(cè)方法主要技術(shù)內(nèi)容確定說(shuō)明如下：一、本標(biāo)準(zhǔn)范圍的確定本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物小鼠肝炎病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法。本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定適用于 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及其產(chǎn)品、細(xì)菌培養(yǎng)物、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境和動(dòng)物源性生物制品中小鼠肝炎病毒的檢 測(cè)。現(xiàn)行的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)抗體檢測(cè)的適用范圍存在一定局限，而本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的熒光 RT-PCR檢測(cè)方法適用范圍廣泛，可以適用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及產(chǎn)品、

10、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物接種物和環(huán)境等 樣本的檢測(cè)。二、規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注明日期的引用文件，僅注曰期的版本 適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。 GB 19489實(shí)驗(yàn)室 生物安全通用要求三、術(shù)語(yǔ)、定義和縮略語(yǔ)(-)術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適合于本標(biāo)準(zhǔn)。1. 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) polymerase chain reaction, PCR體外酶催化合成特異DNA片段的方法，模板DNA先經(jīng)高溫變性成為單鏈，在DNA 聚合酶作用和適宜的反應(yīng)條件下，根據(jù)模板序列設(shè)計(jì)的兩條引物分別與模板DNA兩條鏈 上相應(yīng)的一段互補(bǔ)序列發(fā)生退火而相互結(jié)合

11、，接著在DNA聚合酶的作用下以四種dNTP 為底物，使引物得以延伸，然后不斷重復(fù)變性、退火和延伸這一循環(huán)，使欲擴(kuò)增的基因片 段以幾何倍數(shù)擴(kuò)增。2. 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR以RNA為模板，采用O ligo(dT)、隨機(jī)引物或特異性引物，RNA在逆轉(zhuǎn)錄酶和適宜 反應(yīng)條件下，被逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,然后再以cDNA作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。3. 實(shí)時(shí)熒光逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)real-time RT-PCR,實(shí)時(shí)熒光RT-PCR實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法是在常規(guī)RT-PCR的基礎(chǔ)上，在反應(yīng)體系中

12、加人特異性熒光探 針，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)檢測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，通過(guò)檢測(cè)每次循環(huán)中的熒光發(fā)射信號(hào),酮畫動(dòng)物檢測(cè)細(xì)列標(biāo)準(zhǔn)間接反映了 PCR擴(kuò)增的目標(biāo)基因的量，最后通過(guò)擴(kuò)增曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定性或定量 分析。4. Ct 值 cycle threshold實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)中每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。(二) 縮略語(yǔ)下列縮略語(yǔ)適用于本標(biāo)準(zhǔn)。CPE細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect)DEPC 焦碳酸二乙醋(diethyl pyrocarbonate)DNA脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid)MHV小鼠肝炎病毒(murine hepatitis

13、 virus)PBS 磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline )RNA核糖核酸(ribonucleic acid)四、檢測(cè)方法原理簡(jiǎn)要介紹了標(biāo)準(zhǔn)中采用的技術(shù)方法原理。根據(jù)小鼠肝炎病毒保守序列M蛋白基因， 設(shè)計(jì)合成一對(duì)特異性引物和一條特異性探針，探針兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)吿熒光基團(tuán)和一 個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被悴滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)， 7酶的53外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和悴滅熒光基團(tuán)分離，悴滅 作用消失，熒光信號(hào)產(chǎn)生并被檢測(cè)儀器接受，隨著PCR反應(yīng)的循環(huán)進(jìn)行，PCR產(chǎn)物與熒 光信號(hào)的增長(zhǎng)呈對(duì)應(yīng)關(guān)系。因此，可以通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)對(duì)

14、核酸模板進(jìn)行檢測(cè)。五、主要設(shè)備和材料規(guī)定了檢測(cè)方法所需要的設(shè)備和材料。六、試劑規(guī)定了檢測(cè)方法所需要的試劑。(1) 滅菌PBS。配制方法在標(biāo)準(zhǔn)附錄中給出。(2) 無(wú)RNase去離子水：經(jīng)DEPC (焦炭酸乙二酯)處理的去離子水或商品無(wú)RNase 水。配制方法在標(biāo)準(zhǔn)附錄中給出。(3 ) RNA 抽提試劑 TRIzol ( Life technologies 公司，Cat.No. 15596-026 )或其他等效 產(chǎn)品。RNA抽提試劑給出了具體的信息，目的是為了方便標(biāo)準(zhǔn)的使用者，并不表示對(duì)該 產(chǎn)品的認(rèn)可。如果其他等效產(chǎn)品具有相同的效果，則可以使用這些等效產(chǎn)品。(4) 無(wú)水乙醇。(5) 75%乙醇(無(wú)

15、RNase去離子水配制)。(6) 三氯甲烷(氯仿)。(7) 異丙醇。(8 )實(shí)時(shí)熒光 R.T-PCR 試劑：One Step Primerscript RT-PCR Kit (Perfect Realtime) (Takara公司，Cat.No.RR064A)或其他等效產(chǎn)品。實(shí)時(shí)熒光RT-PCR試劑均給出了具體的第二十五章T/CALAS25-2017實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 小鼠肝炎病毒PCR檢卿友信息，目的是為了方便標(biāo)準(zhǔn)的使用者，并不表示對(duì)該產(chǎn)品的認(rèn)可。如果其他等效產(chǎn)品具有 相同的效果，則可以使用這些等效產(chǎn)品。（9）引物和探針：根據(jù)表1的序列合成引物和探針，引物和探針加無(wú)RNase去離子 水配制成10岬ol

16、/L儲(chǔ)備液，-2orw。表1實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)引物和探針引物和探針名稱引物和探針序列U-3i）產(chǎn)物大小（bp）正向引物GGAACTTCTCGTTGGGCATTATACT反向引物ACCACAAGAITATCATTTTCACAACATA108探針FAM-ACATGCIACGGCTCGTGTAACCGAACTGT-BHQ-1注：探針也可選用具有與FAM和BHQ-1熒光基團(tuán)相同檢測(cè)效果的其他合適的熒光報(bào)吿基團(tuán)和熒光悴滅基團(tuán) 組合。引物和探針設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank中收錄的MHV-1毒株（GenBank登錄號(hào)為FJ647223 ） 序列為模板，利用Primer Express3.0軟件（Applie

17、d Biosystems公司）設(shè)計(jì)一套針對(duì)病毒 M蛋白基因的熒光定量PCR引物和探針，從NCBI下載小鼠肝炎病毒的核酸全序列共 23條，用MAGE4+0軟件進(jìn)行序列比對(duì)分析，保證引物和探針序列的通用性（圖1 ）。gi|2641127|gb|AFO29240.11 House hepat gi|Sl551240|gb|AY7Oa211.lT_MUEine_hepgi|7l69340|gb|AF20S06.liwurinehepa gi|625159|gb|AF201929.irHurine3hepagi1226693919fgbIFJ334311 Murine he gi|226693969|g

18、b|FJ98496.1 Murinehe gi |225403280lgb| FJM722. 1Murine co gi |225403270|gb| FJM722S. 11 Murine co gi|5633l97!2|refIAC_000192.1I Murine_ gi|96298l2|ref|NC 001846.11 Murine he giDgO7O6907|gb|J2l73803.1i2Murine-he gi|298l99?02|gb|GU593319.11 Murine he gi!2933304221制IAB551247.lT Mucine h qin76935l|gb|AF

19、20807 . li Eutine hepagin739S93|gb|AF207902.1l_Murine_hepagilZ25403292|gb|FJ647227.1Murine_cogi1225403260 IgbIFJ647224.1 gi1225403250 Igb|FJ647223.il gi22S403238IgbI FJG47222.il gi1225403227|gbIFJ647221.11 gi|2254032l7lqb|F Reverse Primer (10p.mol/L) lpL、Probe (lOgmol/L) 2nL, RoxlpL、模板RNA lOxL,用無(wú)RNa

20、se去離子水補(bǔ)足到反應(yīng)總體積50卟。結(jié)果均 可見陽(yáng)性擴(kuò)增曲線，但考慮到使引物擴(kuò)增有更好的特異性和縮短反應(yīng)時(shí)間，最后確定擴(kuò)增 程序?yàn)椋?2r 5min, 95T 30s, 95r5s60r 34s, 40 次循環(huán)。(2) 最佳引物濃度的確定應(yīng)用以上擴(kuò)增程序，先固定探針終濃度為200nmol/L，MHV上下游引物濃度在 200nmol/L、250nmol/L、300nmol/L 350nmol/L、400nmol/L 之間選擇，通過(guò)比較 Ct 值和 熒光強(qiáng)度增加值(絕對(duì)熒光強(qiáng)度與背景熒光強(qiáng)度的差值，ARn)來(lái)判斷優(yōu)化結(jié)果。最佳引 物濃度的確定以Ct值最小，擴(kuò)增曲線熒光強(qiáng)度增加值最大所對(duì)應(yīng)的引物濃度

21、為最佳濃度 (圖2)。最終確定MHV上下游引物終濃度400nmol/L。Delta Rn vs Cyclk Plate V Spectra 7 C“Donen弋 yTZTTTTtion Plot Standard CurvWellSample NameDetectorTaskCtStdDevCtA610pmo1MHV-wUnknown16.34540.191A710pmolMHV-wUnknown16.07530.191B815pmo1MHV-wUnknown16.170.797B7ISpmolMHV-WUnknown1729660.797C620pmolMHV-wUnknown16.0195

22、0.00122C720pmolMHV-WUnknown16,01780.00122D625pmolMHV-wUnknown16.07110,0255D725pmolMHV-wUnknown16.0350.0255E630pmolMHV-wUnknown16.07930.0607E7JOpmolMHV-wUnknown16,16510-0607圖2 MHV引物優(yōu)化擴(kuò)増曲線圖引物MHV-F、MHV-R各lOnmol溶于1000卟 純水中，配制成終濃度為lOpmol/gL （ 10pmol/L,每反應(yīng)加人lgL）（3）最佳探針濃度的確定根據(jù)選擇好的最佳MHV上下游引物終濃度400nmol/L,進(jìn)一步

23、進(jìn)行TaqMan探針濃 度的確定，在 1 OOnmol/L、200nmol/L、250nmol/L 300nmol/L、350nmol/L、400nmol/L之 間選擇。以Ct值最小，擴(kuò)增曲線熒光強(qiáng)度增加值最大所對(duì)應(yīng)的探針濃度為最佳娥度，見 圖3。最終確定MHV探針終濃度400nmol/L。2. 不同試劑的測(cè)試本標(biāo)準(zhǔn)方法主要采用 One Step PrimerscriptTM RT-PCR Kit （Perfect Realtime） （Takara 公司，Cat.No.RR064A）,除此以外，還選用了多種試劑按優(yōu)化好的引物和探針濃度進(jìn) 行了測(cè)試，即按上下游引物終濃度400nmol/L，探針

24、終濃度400nmol/L，反應(yīng)總體積為 50iL的情況下，模板RNA量為lOptL。不同試劑選用不同的反轉(zhuǎn)錄和酶激活條件及 PCR條件，40次循環(huán)。結(jié)果所有試劑均可得到很好的擴(kuò)增結(jié)果。這些試劑包括：Ag-Path- IDTM One step RT-PCR Kit （美國(guó) Ambion 公司 產(chǎn)品 Cat#AM1005 ），Quanti Fast Probe QPCR Kits （ QIAGEN 產(chǎn)品，貨號(hào) 204454 ）。八、結(jié)果判定（-）結(jié)果分析和條件設(shè)定直接讀取檢測(cè)結(jié)果，基線和閾值設(shè)定原則根據(jù)儀器的噪聲情況進(jìn)行調(diào)整，以閾值線剛 好超過(guò)正常陰性樣品擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)為準(zhǔn)。第二十五章T/CA

25、LAS252017實(shí)驗(yàn)動(dòng)物小鼠肝炎觀5! Elate 7 Spectra,Uomoonent y Amnliiicatio: i 尸lot ystandard uu.WellSample NameDetectorTaskCtStdDevCtA8SpmolMHV-wUnknown1673650J97A9SpmolMHV-wUnknown17.10460.197B810pmotMHV-wUnknown16.26440.0243B9IQpmolMHVwUnknown16.220.0243C8ISpmolMHV-wUnknown15.67170.2010915pmo1MHV-wUnknown15.94

26、610.2010$20prnolMHV-WUnknown15.6450.246D92OpmolMHV-wUnknown15.7S60.246E825pnxlMHV-wUnknown15.65620.0919E925pmolMHV-wUnknown15.73950.0919F830pmolMHV-wUnknown15.84340.429F930pmolMHV-wUnknown16.4S010.429圖3 IVfHV探針優(yōu)化擴(kuò)增曲線圖 弓iw MHV-P lOnmol溶于1000|iL純水中，配制成終濃度為1 Opmol/pL （10pmol/L,每反應(yīng)加人lpL）（二）質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)1. 空白對(duì)照無(wú)C

27、t值，并且無(wú)熒光擴(kuò)增曲線，一直為水平線。2. 陰性對(duì)照無(wú)Ct值，并且無(wú)莢光擴(kuò)增曲線，一直為水平線。3. 陽(yáng)性對(duì)照Ct值應(yīng)35,并且有明顯的熒光擴(kuò)增曲線，則表明反應(yīng)體系運(yùn)行正常， 否則此次試驗(yàn)無(wú)效，需重新進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增。（三）結(jié)果判定1. 若待檢測(cè)樣品無(wú)熒光擴(kuò)增曲線，則判定樣品未檢出小鼠肝炎病毒。2. 若待檢測(cè)樣品有熒光擴(kuò)增曲線，且Ct值應(yīng)暮35時(shí)，則判斷樣品中檢出小鼠肝炎病毒。3. 若待檢測(cè)樣品Ct值介于35和40之間時(shí)，應(yīng)重新進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)。重 新檢測(cè)后，若Ct值身40時(shí)，則判定樣品未檢出小鼠肝炎病毒。重新檢測(cè)后的Ct值仍介 于35和40之間，貝_定樣品檢出小鼠肝炎病毒

28、。其中CUT OFF值的確定依據(jù)以下試驗(yàn)確定：對(duì)最低檢測(cè)限稀釋度為lOcopies/iL MHV-RNA標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行4次重復(fù)檢測(cè)，計(jì)算其Ct 值均值和標(biāo)準(zhǔn)差，并對(duì)90份正常動(dòng)物組織和盲腸內(nèi)容物樣本進(jìn)行檢測(cè)分析其結(jié)果。結(jié)合 以上結(jié)果綜合分析實(shí)時(shí)熒光PCR方法的CUT OFF值。實(shí)時(shí)熒光PCR方法最低檢測(cè)限實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，稀釋lcopies/gL MHV-RNA標(biāo)準(zhǔn)品有 熒光信號(hào)，但無(wú)標(biāo)準(zhǔn)的“S”形熒光信號(hào)曲線產(chǎn)生。將稀釋至10copies/L MHV-RNA標(biāo) 準(zhǔn)品，重復(fù)檢測(cè)4次，通過(guò)計(jì)算Ct值的差異來(lái)驗(yàn)證方法的重現(xiàn)性。稀釋至1 Ocopies/uL第二十五章T/CALAS252017實(shí)驗(yàn)動(dòng)物小鼠肝

29、炎曬MHV-RNA標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值分別為：35,23、35.29、36.37、37.84, Ct值平均值為36.18,標(biāo) 準(zhǔn)差為1.22 （圖4）。以平均值+3xSD的公式計(jì)算陽(yáng)性樣品Ct值的參考范圍，結(jié)果MHV 陽(yáng)性樣品Ct值范圍應(yīng)為 39.85,取整數(shù)為40。90份陰性樣本均無(wú)熒光信號(hào)。綜合以 上實(shí)驗(yàn)結(jié)果最終確定CUT OFF值為40。5 3PQ圖4實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法重復(fù)4次檢測(cè)稀釋至lOcopies/pLMHV-RNA的反應(yīng)曲線 橫坐標(biāo)為實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)的Ct值，縱坐標(biāo)為熒光信號(hào)強(qiáng)度，4條曲線代表稀釋至Wcopies/pL MHV-RNA分別在4個(gè)反應(yīng)孔的檢測(cè)結(jié)果九、檢測(cè)過(guò)程中防止

30、交叉污染的措施給出了檢測(cè)過(guò)程中如何防止交叉污染的措施，具體按照GB/T 19495.2中的要求執(zhí)行。 十、附錄A本標(biāo)準(zhǔn)附錄為規(guī)范性附錄，給出了 PBS和無(wú)RNase去離子水的配制方法。第六節(jié)分析報(bào)告一、材料與方法（一）病毒、菌株、載體和臨床樣本小鼠肝炎病毒（MHV, ATCCVR-246 k小鼠腦脊髓炎病毒（TMEV，ATCC VR-995 仙臺(tái)病毒（SV，ATCCVR-105 小鼠肺炎病毒（PVM, ATCC VR-25 ）、呼腸孤病毒ID型 （Reo-3, ATCCVR-232X購(gòu)自美國(guó)典型微生物菌種保藏中心，小鼠出血熱病毒（HV）抗 原為浙江天元生物藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)的雙價(jià)腎綜合征出血

31、熱（漢灘型和漢城型）滅 活疫苗，淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒（LCMV）核酸由中國(guó)食品藥品檢定研究院惠贈(zèng)、 MNVGuangzhou/K162/09/CHN毒株由本實(shí)驗(yàn)室分離保存，BHK細(xì)胞（ATCCCCL-10）購(gòu) 自美國(guó)典型微生物菌種保藏中心。pGEM-T easy克隆載體購(gòu)自promega公司，大腸桿菌 E. colics a購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司（Takara公司）。臨床樣本包括：來(lái)源于 2012-2014年本實(shí)驗(yàn)室收到廣東省送檢的SPF級(jí)活體小鼠或小鼠糞便123份。（二）引物設(shè)計(jì)合成引物和探針序列見表1。引物和探針由Invitrogem （廣州）公司合成。（三）病毒和樣品核酸提

32、取病毒樣品RNA的抽提按Trizol （Invitrogen公司，美國(guó)）操作說(shuō)明書進(jìn)行，盲腸內(nèi)容 物和糞便樣品按照下面的方法預(yù)處理，在裝有樣本的離心管中加人適量滅菌的PBS,漩渦 混勻，將懸液12 000r/min離心lOmin,取上清液通過(guò)0.22|im濾膜（Pall公司，美國(guó) 過(guò)濾， 取濾液進(jìn)行RNA抽提。（四）MHV-RNA標(biāo)準(zhǔn)品的制備以提取的 MHV RNA 為模板，用 PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2 試劑盒進(jìn)行 RT-PCR,反應(yīng)體系為：Enzyme Mix2nL，2 x Buffer 25 L,上游引物 MHV-F （lOpmol/L）

33、2.5L,下游引物 MHV-R （lOpmol/L ） 2.5）aL, RNA 5|iL,加 RNase Free dH2O 至 50jaL。 反應(yīng)條件：50%： 30min, 94X： 2min, 一個(gè)循環(huán) 9430s、55C 30s、72X： lmin,共 35 個(gè) 循環(huán)，最后72T延伸10 min。反應(yīng)得到目的大小片段后，用膠回收試劑盒回收目的片段， 將回收的目的片段連接至pGEM-T easy載體，并轉(zhuǎn)化至DH5a感受態(tài)細(xì)胞中。用含有 Amp的LB瓊脂平板篩選陽(yáng)性克隆，用PCR鑒定陽(yáng)性克隆菌。陽(yáng)性克隆菌（pGEM-MHV） 送英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司進(jìn)行測(cè)序，pGEM-MHV菌中含

34、有的PCR產(chǎn)物大小 為 108bp。將pGEM-MHV質(zhì)粒，37C Sal I單酶切4h,使質(zhì)粒線性化，瓊脂糖凝膠電泳及試 劑盒回收純化質(zhì)粒DNA線性化產(chǎn)物，用于體外轉(zhuǎn)錄，按T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒RibomaxTM Large Scale RNA Production Systems （ Promega 公司）說(shuō)明加人反應(yīng)試劑 37%；作用 2h,然 后加DNase I酶1卟，37T：消化轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中未轉(zhuǎn)錄的DNA 15min, 70T滅活DNase I酶 15mm,用QIAamp Viral RNA Mini Kit試劑盒（Qiagen公司）進(jìn)行RNA提取。得到體 外轉(zhuǎn)錄的MHV-RNA，用微量紫

35、外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度，根據(jù)MHV轉(zhuǎn)錄RNA產(chǎn) 物的大小計(jì)算質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)錄的RNA拷貝數(shù)。按照下面的公式計(jì)算RNA拷貝數(shù)?？截悢?shù) （copies/gL） =6.022x 1023 （copies/mol） x RNA 濃度（g/L） / 質(zhì)量 MW （g/mol）0 其中， MW=RNA堿基數(shù)x 340 daltons/堿基，RNA堿基數(shù)=載體序列堿基數(shù)+插入序列堿基數(shù)0 根據(jù)計(jì)算得到的MHV-RNA的濃度用無(wú)RNase水調(diào)整到1 x 10copies/gL。-80t保存?zhèn)溆?。（五）特異性試?yàn)采用建立的MHV實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法對(duì)MHV、TMEV、MNV、SV、PVM、Reo- 3、HV

36、和LCMV的RNA進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證該方法的特異性。（六）定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及敏感性試驗(yàn)將MHV-RNA標(biāo)準(zhǔn)品用Easy dilution （Takara公司）做10倍系列稀釋，得到1 x 1091 x 10copies4iL系列標(biāo)準(zhǔn)模板。利用優(yōu)化后的反應(yīng)體系和條件測(cè)定各稀釋度的Ct 值，以Ct值為縱坐標(biāo)，以起始模板濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)淮曲線。（七）重復(fù)性試驗(yàn)對(duì) 3 份 MHV-RNA 標(biāo)準(zhǔn)品（lx 105copies/gL、1 x 103copies/pL、2 x lOopies/nL）在 同一次反應(yīng)中進(jìn)行5次重復(fù)測(cè)定，對(duì)各稀釋度的Ct值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)算每個(gè)樣品各反應(yīng)管 之間的批內(nèi)變異系數(shù)（

37、CV%）；對(duì)上述樣品分別進(jìn)行5次測(cè)定，計(jì)算同一樣品每次測(cè)定結(jié)_ I欄辦賴韓果之間的批間變異系數(shù)（CV%）。（八）臨床樣本的檢測(cè)1. 人工感染試驗(yàn)將含有MHV病毒的“臟墊料”作為感染源置于ICR小鼠籠盒中，模擬自然感染狀態(tài)。 每籠飼養(yǎng)5只，按品種分別固定放置于小鼠飼養(yǎng)間內(nèi)中間籠架的底層位置，每周1次固定 時(shí)間更換包括哨兵鼠在內(nèi)的飼養(yǎng)鼠墊料。分別在實(shí)驗(yàn)第2、4、8、14、21、28、35、42、 56和120天各剖殺動(dòng)物5只，采集血液、盲腸內(nèi)容物、糞便、肝臟以及肺臟檢測(cè)抗原抗 體分布情況。2. 其他臨床樣本檢測(cè)利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)收集到的123份臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)，每次反應(yīng)同時(shí)設(shè) 置陽(yáng)性對(duì)照

38、和陰性對(duì)照。二、結(jié)果123456 M2000bplOOObp750bp500bp250bplOObp圖S MHV RT-PCR電泳圖M： DNAMarker DL2000 ; 26 泳道：MHV 重組 質(zhì)粒；1泳道：無(wú)模板對(duì)照（一）MHV質(zhì)粒的制備以用RT-PCR擴(kuò)增MHV得到大小約108bp 的特異片段，與pGEM-T載體連接構(gòu)建重組陽(yáng) 性質(zhì)粒，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，條帶大小 與預(yù)期結(jié)果相符（圖5 ）。（二）特異性試驗(yàn)圖6 MHV熒光定量RT-PCR特異性檢測(cè)結(jié)果采用建立的熒光定量PCR方法對(duì)MHV、 TMEV、MNV、SV、PVM、Reo-3、HV 和 LCMV的RNA進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果除

39、MHV為陽(yáng)性 外，其他病毒均為陰性，表明建立的方法具有良 好的特異性（圖6）。第二十五章T/CALAS 25-2017實(shí)驗(yàn)動(dòng)物小鼠肝炎病番沈只檢測(cè)方秦（三）定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及敏感性試驗(yàn)將 MHV-RNA 用 Easy dilution （Takara 公司）做 10 倍系列稀釋，得到 1 x 1091 x 10copies小L系列標(biāo)準(zhǔn)模板。利用優(yōu)化后的反應(yīng)體系和條件測(cè)定各稀釋度的Ct值，以 Ct值為縱坐標(biāo)，以起始模板濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果見圖7,可見 各梯度之間間隔的Ct值基本相等，無(wú)模板對(duì)照（no template control, NTC ）沒(méi)有熒光 擴(kuò)增曲線為陰性結(jié)果。

40、以標(biāo)準(zhǔn)品稀釋拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以臨界環(huán)數(shù)（threshold cycle, Ct）為縱坐標(biāo)建立熒光實(shí)時(shí)定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)品在1 x 108copies/gL- 1 x lOcopies小L之間具有良好的線性關(guān)系，結(jié)果見圖8。其線性回歸方程為Ct=-3.24xlg （拷貝數(shù)）+37.92,標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率為-3.20,根據(jù)公式計(jì)算得擴(kuò)增效率E=10712-l=1.054,圖7 10倍系列稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的熒光定量擴(kuò)增曲線1-9： 1 x 109copies/jxL 至 1 x lOkopies/pL標(biāo)準(zhǔn)品，10： 1 x 10copies/|jL標(biāo)準(zhǔn)品和無(wú)模板對(duì)照5 5Standard Cu

41、reve圖8 10倍系列稀釋標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線即擴(kuò)增效率為105.4%,相關(guān)系數(shù)R2=0.9980,說(shuō)明PCR擴(kuò)增該標(biāo)準(zhǔn)品的效率較高，線性 關(guān)系良好。標(biāo)準(zhǔn)品1 x 10copies/nL無(wú)擴(kuò)增曲線，故本方法檢測(cè)的靈敏度為lOcopies/L。（四）重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果通過(guò)對(duì) 1 x 105copies小L、1 x 103copies/jxL、2 x lOcopies/L 3 個(gè)稀釋度 RNA 進(jìn)行重 復(fù)性檢測(cè)，批內(nèi)及批間重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)均小于2% （表4），表明建立熒光定量RT- PCR方法重復(fù)性好，方法穩(wěn)定可靠。表4 MHV熒光定量RT-PCR批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果樣本（c叩ies/pL

42、）-Ct值-Ct平均值標(biāo)準(zhǔn)差SD變異系數(shù)CV（%12345批內(nèi)2x 10133.1534.0534.2234.1633.7933.870,441.29lxio330.6831.1631.2331.0731.3631.100.260.831x10s20.6321.0821.5421.232L152L130.331.55批間2x10*33.2734.2833.8834.5234.3534.060.501.471 x 101312130.5831.653L3331.8931.330.501.591x10s21.0220.7821.3320.8421.322L060.261.23（五）熒光定量PCR在

43、臨床樣本檢測(cè)中的應(yīng)用1.熒光定量RT-PCR在MHV人工感染樣本檢測(cè)中的應(yīng)用（1）血清抗體陽(yáng)性檢出率實(shí)驗(yàn)開始第2天和第4天顯示抗體陽(yáng)性檢出率為0,第8天開始，抗體檢出陽(yáng)性，陽(yáng) 性率為5/5,直至第8周，實(shí)驗(yàn)結(jié)束抗體陽(yáng)性率仍為5/5。結(jié)果見表5。表5小鼠肝炎病毒抗體陽(yáng)性率時(shí)間2d4d8d14d21d28d35d42d56d84d陽(yáng)性率0/50/55/55/55/55/55/55/55/55/5（2）各檢測(cè)樣本抗原陽(yáng)性檢出率應(yīng)用熒光定量RT-PCR方法對(duì)盲腸內(nèi)容物、糞便、肝臟以及肺臟進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明 （表6）:在肺臟、肝臟、盲腸和糞便四個(gè)檢測(cè)樣本中，肺臟中早檢檢出小鼠肝炎病毒，檢 出時(shí)間為實(shí)驗(yàn)開

44、始的第2天，但檢出率較低，為1/5;隨后，第4天，盲腸、糞便和肝臟 也檢出小鼠肝炎病毒，檢出率肝臟為3/5,其他臟器均為5/5,因此，在首次檢出時(shí)間上， 肺臟作為檢測(cè)樣本不具備明顯優(yōu)勢(shì)。從樣本帶毒的持續(xù)性來(lái)看，肝臟排毒時(shí)間稍短，第8 周陽(yáng)性檢出率已降為0/5,但肺臟、盲腸和糞便均可檢出小鼠肝炎病毒。與血清學(xué)檢測(cè)比 較，PCR檢測(cè)可以檢測(cè)病毒早期感染，而且，在MHV檢測(cè)中，盲腸內(nèi)容物/糞便應(yīng)該是 最佳的檢測(cè)樣本。第二十五章 T/CALAS252017實(shí)驗(yàn)動(dòng)物小鼠肝炎病毒PCR檢測(cè)方法、g表6 MHV熒光定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果實(shí)驗(yàn)開始時(shí)間肺臟肝臟盲腸糞便2d1/50/50/50/54d5/53/

45、55/55/58d5/51/55/55/514d3/54/55/55/521d1/51/53/54/528d1/51/55/52/535d1/54/54/51/542d2/51/54/51/556d1/50/55/53/584d0/50/50/50/52.熒光定量RT-PCR在臨床樣本檢測(cè)中的應(yīng)用應(yīng)用熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法對(duì)2012-2014年送檢的123份SPF級(jí)小鼠盲腸內(nèi)容物 進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果檢出5份陽(yáng)性，陽(yáng)性率為4.1%。采用測(cè)序方法對(duì)陽(yáng)性樣本進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證 （圖9 ）。進(jìn)一步驗(yàn)證了建立的檢測(cè)方法正確有效。AlignmentsGenEJank Graphics Dislanee lie

46、e of resists0Description0 Mufin e Fie ostiti s Mai g strain S/323 9.1! co m pi 今tfqe no m e O Murine Fiepstitis wiais slfsin compi&ie oenom Mouse hep3titis virus nuaeocosi n.mhv 幻 rna. compile cds Murine cofonavirus strahi JHM WU, comping Murine coionavirus straincomcdtie tfenoms hludne cofonavirus MHysIHM LA, comoi&l