流式細(xì)胞術(shù)樣本制備.

1、樣本制備實(shí)例 :細(xì)胞表面蛋白熒光染色 (Immunofluorescence Staining原理:對(duì)細(xì)胞表面蛋白質(zhì)的染色可以分為直接染色 (DIF 和間接染色 (IIF 兩種。直接 染色是指用直接聯(lián)有熒光的抗體染色 ;而間接染色則是采用一級(jí)抗體和蛋白先結(jié)合 , 然后 再用帶有熒光的與一級(jí)抗體有親和力的二級(jí)抗體進(jìn)行染色。熒光染色的方法 在蛋白質(zhì)檢測(cè) 中使用非常普遍 ,因?yàn)橹灰捎煤线m的抗體 ,幾乎任意的蛋白都可以用 指定的熒光標(biāo)記。 但是由于各種蛋白表達(dá)的強(qiáng)度和熒光染料自身熒光強(qiáng)度不同 ,以 及臨近通道串色的問題 , 多色實(shí)驗(yàn)的基本原則是 :最強(qiáng)的染料配表達(dá)最弱的蛋白 ,最 弱的染料配表達(dá)最強(qiáng)

2、的蛋白 ; 如果使用染料的數(shù)量不大則應(yīng)盡量避免使用臨近通 道。還需要考慮染料之間的溢漏、以及 偶聯(lián)染料已降解的問題。現(xiàn)出現(xiàn)了 405nm 的激光激發(fā)的新型染料如 BV421、 BV605 等為多 色實(shí)驗(yàn)提供了更多的選擇空間。材料:?被檢測(cè)細(xì)胞?FACS Lysing Solution (細(xì)胞裂解液, 1倍或 10倍, 10倍的要先稀釋到 1倍后使 用?相應(yīng)的蛋白熒光染色抗體 (e.g. CD4 FITC, CD8 PE, CD3 APC步驟:1. 在 100 L外周血加入抗體 :a. 同型對(duì)照 :PB 100 L +Isotope FITC 20 L+Isotope PE 20 L+Isoto

3、pe APC 5 L b. 單陽管:PB 100 L +CD4 FITC 20 L+Isotope PE 20 L+Isotope APC 5 L c. 單陽管:PB 100 L +Isotope FITC 20 L+CD8 PE 20 L+ Isotope APC 5 L d. 單陽管:PB 100L +Isotope FITC 20 L+ Isotope PE 20 L+CD3 APC 5 Le. 樣品管:PB 100L +CD4 FITC 20 L+CD8 PE 20 L+CD3 APC 5 L2. 避光 15min3. 在每管中加入 2mL 裂解液 ,室溫下避光孵育 10min4. 將

4、裂解好的外周血離心 1200rpm , 5min ,去上清液5. 加入 2mL 鞘液,混勻6. 離心 1200rpm , 5min ,去上清液7. 加入 500 L鞘液,混勻8. 3小時(shí)內(nèi)上機(jī) (如果不能立刻上機(jī) , 2? C -8? C 避光保存樣本對(duì)照:a. 同型對(duì)照 (和使用的抗體同源、同亞型、同熒光標(biāo)記 :Isotope*3b. 單陽 CD4 加 Isotope PE & APCc. 單陽 CD8加 Isotope FITC & APCd. 單陽 CD3 加 Isotope FITC & PE細(xì)胞周期 (Cell Cycle原理:細(xì)胞在有絲分裂的過程中 ,核內(nèi)的 DNA 會(huì)進(jìn)行復(fù)制 ,

5、造成 DNA 含量的波動(dòng)。如 果把 處于 G0/1期的細(xì)胞的 DNA 含量看做 1倍的話,處于 G2/M 期的細(xì)胞的 DNA 含量則為 2倍。 熒光染料 propidium iodide (PI 是一種核染料。因?yàn)槊恳粋€(gè) PI 分子 只能插在兩組相鄰的 堿基對(duì)中 ,所以 PI 染料的熒光強(qiáng)度與被染的 DNA 的數(shù)量成正 比。根據(jù) PI 的這種特性 ,我 們常常用它來揭示細(xì)胞內(nèi) DNA 倍性的關(guān)系 ,從而推導(dǎo)出 細(xì)胞所處的周期。然而 ,流式細(xì)胞術(shù)只能檢測(cè)在某一時(shí)刻穿過激光的細(xì)胞的熒光強(qiáng)度 ,但無法直接 判斷 在這一時(shí)刻到底穿過了幾個(gè)細(xì)胞。如果有細(xì)胞粘在一起或是正巧同時(shí)穿過激 光 ,流式細(xì)胞 儀則

6、會(huì)讀取其整個(gè)熒光強(qiáng)度 ,從而導(dǎo)致對(duì)單個(gè)細(xì)胞 DNA 含量測(cè)定上的 誤差。為了解決這 個(gè)問題,我們常常做一張以 FL2-W 和 FL2-A 分別為橫縱坐標(biāo)的 散點(diǎn)圖。 FL2-W 指的是第二 通道（PI 里該細(xì)胞通過時(shí)的時(shí)間 ,而 FL2-A 指的是第二 通道里該細(xì)胞的總熒光強(qiáng)度。當(dāng) 細(xì)胞粘聯(lián)時(shí) ,期總體積與質(zhì)量變大 ,導(dǎo)致通過激光時(shí) 間變長(zhǎng),所以 FL2-W 的值會(huì)比單個(gè)細(xì) 胞大出很多。通過這種方式 ,我們可以將 FL2- W 比較統(tǒng)一 （小的細(xì)胞用門圈出 ,以排除 粘聯(lián)體 ,從而確保周期分析的準(zhǔn)確性 （如下圖 所示。然后我們就可以在 FL2-A 的直方圖 上直觀地對(duì)細(xì)胞倍性進(jìn)行分析了。材料:

7、?被檢測(cè)細(xì)胞? FACS Lysing Solution (細(xì)胞裂解液, 1倍或 10倍, 10倍的要先稀釋到 1倍后使 用?BD CycletestTM Plus DNA Reagent Kit (340242?Solution A (10mL 1 (Trypsin in Spermine Tetrahydrochloride Detergent Buffer?Solution B (8mL 1 (RNase A and trypsin Inhibitor in Spermine Buffer?Solution C (8mL 1 (Propidium Iodide (PI in Spermi

8、ne Buffer ?Buffer Solution (50mL 3 (DMSO in Sucrose-Sodium Citrate注意:Solution A, B, C 中含有 spermine tetrahydrochloride對(duì), 皮膚和粘膜有刺激 性;Solution C 中 PI 有毒 ,并具有潛在的致癌性 ;Buffer Solution 中含有 DMSO ,具有潛在的致畸性。操作時(shí)戴手套 ,注意避免眼睛 ,皮膚和衣服與以上試劑的接觸。Solution A 和 B 在室溫下使用 (20? C-25? C , Solution C 要在 2? C -8? C 下避 光保存。步驟:1

9、. 在 200 L外周血加入 2mL 裂解液,室溫下孵育 10min2. 將裂解好的外周血離心 1200rpm , 5min ,去上清液3. 加入 2mL 鞘液,混勻(如不含紅細(xì)胞樣本無需裂紅 ,從此步驟開始 ,取 106細(xì)胞4. 離心 1200rpm , 5min ,去上清液5. 加入 250L Solution A, 輕輕混勻(不要渦旋 ,室溫下 孵育 10min6. 加入 200L Solution B, 輕輕混勻(不要渦旋 ,室溫下 孵育 10min7. 加入 200 L Solution C,混勻,在冰上或者冰箱里避光孵育 10min8. 將樣本用 35-50 m的濾網(wǎng) (300目過

10、濾9. 3小時(shí)內(nèi)上機(jī) (如果不能立刻上機(jī) , 2? C -8? C 避光保存樣本對(duì)照:1內(nèi)參:樣本內(nèi)含有已知倍性的細(xì)胞亞群2 外參(optional : 同類已知倍性的細(xì)胞。細(xì)胞凋亡 (Apoptosis原理:細(xì)胞程序性死亡 /凋亡 (apoptosis 是機(jī)體移除不需要的細(xì)胞的一種常見的機(jī)制。 細(xì)胞凋亡早期的標(biāo)記之一是 PS (phosphatidylserine自 胞膜內(nèi)表面到外表面的轉(zhuǎn)移。 Annexin V (AV 和 PS 有很強(qiáng)的親和力 ,所以被熒光標(biāo)記后常常在流式中被用來檢測(cè) 外翻 的 PS 。在細(xì)胞凋亡后期 ,細(xì)胞膜常常會(huì)破裂。這種現(xiàn)象在流式中可以用 propidium iod

11、ide (PI 檢測(cè)。 PI 是一種核染料。當(dāng)細(xì)胞膜完整時(shí) , PI 無法穿透胞膜 ,故 無法對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行 染色。 AV 與 PI 共同使用時(shí) ,可以對(duì)細(xì)胞凋亡的各個(gè)時(shí)期進(jìn)行檢 測(cè):正常活細(xì)胞顯示 AV 和 PI 的共陰性;早凋細(xì)胞顯示 AV 陽性和 PI 陰性;晚凋細(xì)胞 則顯示 AV 和 PI 的雙陽性。然而,可以被 AV 和 PI 共同染色的細(xì)胞并不一定處于凋亡晚期。壞死的細(xì)胞在 晚期也會(huì)被 AV 和 PI 共同染色。所以要想做到對(duì)細(xì)胞凋亡精確的檢測(cè)則需要對(duì)整 個(gè)凋亡過程進(jìn)行監(jiān)測(cè) , 即 AV 陰性 & PI 陰性 AV 陽性 & PI 陰性 AV 陽性 & PI 陽性。材料:?被檢測(cè)細(xì)胞

12、?BD PharmingenTM FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I (556547?10X Annexin V Binding Buffer (50mL 1 51-66121E ?FITC Annexin V (AV(0.5mL 1 51-65874X ?Propidium Iodide (PI Staining Solution (2.0mL-66211E 1 51注意: PI 有毒,并具有潛在的致癌性。操作時(shí)注意安全 ,要戴手套。步驟:1. 將 10倍的 Annexin V Binding Buffer 稀釋為 1倍 (將 1容積的 Buff

13、er 加到 9容積的蒸餾水中2. 用冷 PBS 把細(xì)胞溶液清洗 2次(離心1200rpm/5min 去 上清液 +2mLPBS 混勻 離心 1200rpm/5min 去 上清液 +2mL PBS 混勻離心 1200rpm/5min 去 上清液3. 將清洗好的細(xì)胞加入 1倍 Annexin V Binding Buffer 中(終濃度 106細(xì)胞 /mL4. 在 5mL 的流式管中加入 100 L步驟 3的細(xì)胞溶液(應(yīng)含 105細(xì)胞5. 在每一管樣本溶液中加入 5L的 FITC Annexin V 和 5L的 PI6. 將溶液輕輕地震蕩后 ,避光在室溫下 (25? C 孵育 15min7. 加入

14、 400 L 1倍 Annexin V Binding Buffer8. 在 1小時(shí)內(nèi)上機(jī)對(duì)照:1. 未染色細(xì)胞 （全陰2. 單染 FITC Annexin V3. 單染 PI4. 正常細(xì)胞（未經(jīng)凋亡藥物處理加 AV 和 PI6-C TBNK 檢測(cè)原理:人類的淋巴細(xì)胞按照表面抗原的表達(dá)可以被分成三大類 :T 細(xì)胞（CD3+, B 細(xì)胞 （CD19+和 NK 細(xì)胞（Natural Killer 自然殺手 （CD16+CD56+。這些淋巴細(xì)胞表面還會(huì) 表達(dá)一些其他的抗原。根據(jù)這些抗原的表達(dá) ,我們可以做出對(duì)某些疾病的檢測(cè)和診 斷。例 如:CD3+CD4+ 淋巴細(xì)胞的比例和絕對(duì)數(shù)量是檢測(cè) HIV 階

15、段的重要指標(biāo) （隨 著 HIV 的加重, 患者血液中 CD3+CD4+淋巴細(xì)胞的數(shù)量會(huì)逐漸減少 ; CD3+CD4+淋 巴細(xì)胞的比例和絕對(duì)數(shù) 量以及 T 細(xì)胞和 B 細(xì)胞的總量也常常是診斷其他免疫缺失 疾病和自免疫疾病的依據(jù) ;表達(dá) CD3-CD16+/CD56+的 NK 細(xì)胞往往對(duì)某些腫瘤細(xì)胞 和被病毒感染的細(xì)胞有殺傷力 ,所以其 數(shù)量是個(gè)體對(duì)該癥狀抵抗力的量化表達(dá)。BD MultitestTM 6-color TBNK 試劑是為 BD FACSCantoTM 和 BD FACSCantoTM II 設(shè)計(jì)的專 門測(cè)量 T , B 和 NK 細(xì)胞比例與總數(shù) , T 細(xì)胞 CD4 和 CD8亞群

16、的試劑。 （各類細(xì)胞絕對(duì)數(shù) 的統(tǒng)計(jì)需使用 BD Trucount的計(jì)數(shù)管。材料:?外周血?BD MultitestTM 6-color TBNK Reagent with BD Trucount Tubes (337166 或 ?BDMultitestTM 6-color TBNK Reagent without BD Trucount Tubes (644611o CD3 FITC (T 細(xì)胞檢測(cè)o CD16 & CD56 PE (NK 細(xì)胞檢測(cè)o CD45 PerCP-Cy5.5 （淋巴細(xì)胞分群o CD4 PE-Cy7 (T 助細(xì)胞檢測(cè)o CD19 APC (B 細(xì)胞檢測(cè)o CD8 APC

17、-Cy7 ( 細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞亞群檢測(cè)注意 :試劑中含有疊氮化鈉作為防腐劑 ,請(qǐng)勿吞食。步驟:1. 把 50 L外周血加入上樣管中。 (可以使用一般的流式管 ,也可以是Trucount 管子。如果使用 Trucount 的管子 ,則要確保底部的微粒的完整性。 使 用 Trucount 可以算比例和絕對(duì)計(jì)數(shù) ,使用一般流式管只能算比例2. 在樣本中加入 20 L BD MultitestTM 6-color TBNK 試劑,用移液槍混勻。3. 避光在室溫下孵育 15min 。4. 避免直射光,在樣本中加入 450 L一倍的 FACS lysing solution(裂解液, 混 勻。5. 避光

18、在室溫下孵育 15min 。6. 6小時(shí) (避光室溫內(nèi)上機(jī)。注意:上機(jī)前 FACSCano 或 FACSCantoII 要先用 BD FACS 7-color setup beads(335775調(diào)質(zhì)控。檢測(cè)結(jié)果實(shí)例 :1N8_L04yui :w JololV* lw jcajMQSJIOG? s 30_fei _ss 運(yùn)殺i# US55 s 總S=EOEada.1tEra-lgQn EUEX 塔“aBnE 3IWP 0 xqes * JmAHs二$* s 囂kllmokuyhl *0Er 43i3 war s #fanWE Es.ri- 尊 fs科m8S s- 1- 0k-fttoo-713

19、 peulfr-imeb.ZN JQ-EJIaBAI 2- S5HWwzBl b-sJ I s e M p4aQcrodB PSUU5 QM _ra _B eirp 亠口 Q-OE3Ai3K1JUoO0aO5HI5T2e黑g&1ire8.林 a7E掃Vir7.ILs 二 孚 s0 # STSX 8nJ Jo-HBD MultitestTM IMK 試劑是為 BD FACSCaliburTM , BD FACSCantoTM 和 BDFACSCanto TM II 設(shè)計(jì)的專門測(cè)量 T , B 和 NK 細(xì)胞比例與總數(shù)的試劑。 (各類 細(xì)胞絕對(duì)數(shù)的統(tǒng) 計(jì)需使用 BD Trucount 的計(jì)數(shù)管。材

20、料:?外周血?BD MultitestTM 4-color TBNK Reagent with BD Trucount Tubes (340504o BD Multitest? CD3 FITC / CD8 PE / CD45 PerCP / CD4 APC reagento BD Multitest CD3 FITC / CD16 PE + CD56 PE / CD45 PerCP / CD19 APC reagent o BD FACS? Lysing Solutiono BD Trucount? tubes或?BD MultitestTM 4-color TBNK Reagent wit

21、hout BD Trucount Tubes (340503o BD Multitest? CD3 FITC / CD8 PE / CD45 PerCP / CD4 APC reagento BD Multitest CD3 FITC / CD16 PE + CD56 PE / CD45 PerCP / CD19 APC reagent oB D FACS? Lysing Solution注意 :試劑中含有疊氮化鈉作為防腐劑 ,請(qǐng)勿吞食。步驟:1. 每一管病人的樣品準(zhǔn)備兩個(gè)空的流式管 ,標(biāo)記為 A 和 B 。2. 在 A 和 B 管中各加入 50 L外周血。 （可以使用一般的流式管 ,也可以是

22、Trucount 管子。如果使用 Trucount 的管子 ,則要確保底部的微粒的完整性。使 用 Trucount 可以算比例和絕對(duì)計(jì)數(shù) ,使用一般流式管只能算比例3. 在 A 樣本管中加入 10 L BD MultitestTM CD3/CD8/CD45/CD4 試劑,用移液 槍混 勻。4. 在 B 樣本管中加入 10 L BD MultitestTM CD3/CD16+CD56/CD45/CD19 試 劑 ,用移 液槍混勻。5. 避光在室溫下孵育 15min 。6. 避免直射光,在樣本中加入 450 L一倍的 FACS lysing solution(裂解液,混勻。7. 避光在室溫下孵育

23、15min 。8. 6小時(shí) (避光室溫內(nèi)上機(jī)。注意:上機(jī)前 FACSCano 或 FACSCantoII 要先用 BD FACS 7-color setup beads (335775 調(diào)質(zhì)控。 Calibur 要用 BD Calibrite3 和 APC beads(340486, 340487調(diào) 質(zhì) 控。HLA-B27 檢測(cè)原理:HLA-B27 是 MHC class I 的一種。 HLA-B27 抗原的表達(dá)與強(qiáng)直性脊柱炎以及 其他一些 免疫性風(fēng)濕病有很強(qiáng)的關(guān)聯(lián)。 90%的強(qiáng)直性脊柱炎病人表達(dá) HLA-B27 而 正常人中只有 8%表 達(dá)。BD HLA-B27 Kit ( 可以對(duì)裂紅后的全血中的 HLA