環(huán)孢素A、維拉帕米、川芎嗪對胃癌多藥耐藥細(xì)胞株SGC-790.

1、環(huán)孢素A、維拉帕米、川芎嗪對胃癌多藥耐藥細(xì)胞株SGC-7901/ADR逆轉(zhuǎn)作用的研究Know thyself.作者：張娟 侯培珍 趙永峰 李翠文 曹瑞珍 王睿琦 高麗君【摘要】目的：探討環(huán)抱素A(CsA、維拉帕米(VP、川芎嗪(TMP對胃癌多藥耐藥細(xì)胞株SGC-7901/ADR耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用。方法：采用四甲基偶 氮唑鹽(MTT)比色法觀察SGC-7901/ADR寸化療藥氟尿嘧啶(5-FU)的耐藥性， 選擇CsA VP TMP勺非細(xì)胞毒性劑量，并觀察其與 5-Fu聯(lián)合對SGC-7901/ADR 的逆轉(zhuǎn)作用。結(jié)果：SGC-7901/ADR寸化療藥5-FU具有耐藥性，相對耐藥性(RF) 為 97.

2、49 ; CsA 3.0mg/L、VP 10.0mg/L、TMP 300.0mg/L 以下為 SGC- 7901/ADR細(xì)胞的非細(xì)胞毒性劑量，除 CsA外, VP和TMF對SGC-7901/ADR勺逆 轉(zhuǎn)作用呈劑量依賴關(guān)系；300.0mg/L TMP較10.0mg/L VP逆轉(zhuǎn)作用強(qiáng)(P0.01)，使 SGC-7901/ADR相對耐藥性降至 12.89，將 5-FU IC50 由 13.001mg/L 下調(diào)到 1.542mg/L，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)是 8.43 倍。結(jié)論：SGC-7901/ADR寸 5-FU具有耐藥性，300.0mg/L TMP是 SGC-7901/ADF細(xì)胞多藥耐藥性最有效的 逆轉(zhuǎn)劑

3、() 。【關(guān)鍵詞】 胃癌；多藥耐藥；SGC-7901/ADR田胞；逆轉(zhuǎn)Abstract Objective:To investigate the reversal effect of Cyclosporin A (CsA), Verapamil (VP), and Tetramethylpyrazine (T MP) against the multi drug resistance (MDR) gastric cancer c ell line SGC-7901/ADR. Methods: MTT assay was used to assess the sensitiv ity of SG

4、C-7901/ADR cells to Fluorouracil (5-FU). CsA,VP,and TMP atnon-toxic doses were separatelyapplied togetherwith5-FU to examinepotentialreversal effectagainstSGC-7901/ADRcellsby each agent. Results:SGC-7901/ADRcellsare resistantto 5-FU withrelativeresistance(RF) of 97.49.Thenon-cytotoxicdoselimitsforCs

5、A, VP, andTMPare3.0mg/L, 10.0 mg/L,and300.0 mg/Lrespectively.BothVPandTMP butnot CsA exertdose-dependent reversaleffectagainstSGC-7901/ADRcellswith TMP at300.0 mg/Lexertingstronger reversal effect comparing with VP at 10.0mg/L(P0.01). At 300.0mg/L, TMP reduces the RF of SGC-7901/ADR cells to the val

6、ue of 12.89 and lowers the IC50 of 5-FU from13.001 mg/Lto1.542mg/L witha reversalfold of8.43.Conelusion:Multidrugresistaneeeell lineSGC-7901/ADRis resistantto5-FU whileTMP at 300.0mg/l isthe mosteffeetivereversalagent examined hereagainst SGC-7901/ADR eells.Key words Gastric Cancer； Multi drug resis

7、tance（MDR）； SGC-7901/ADR cell ； ReversalStill waters have deep bottoms.化療在胃癌綜合治療中發(fā)揮著重要作用，但往往因?yàn)槟[瘤細(xì)胞對化療藥物 產(chǎn)生了多藥耐藥性（multidrug resista nee , MDR而療效不佳1-2。解決 MDR主要方法：一是尋找對 MDR中瘤細(xì)胞有效的抗癌藥物，二是通過增加細(xì)胞 內(nèi)化療藥物濃度而逆轉(zhuǎn)MDR本試驗(yàn)旨在通過體外試驗(yàn)觀察逆轉(zhuǎn)劑 CsA VP TMP寸SGC-7901/ADR田胞耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用，為胃癌有效的化療提供理論依 據(jù)。1 材料與方法1.1 人胃癌細(xì)胞系人胃癌細(xì)胞株SGC-790

8、1耐阿霉素藥細(xì)胞株SGC-7901/AD韻由第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院消化研究所惠贈(zèng)。1.2 藥物、試劑及主要儀器TMP（北京永康藥業(yè)有限公司），CsA（瑞士 Sandoz公司），VP （上海禾豐制藥有限公司），5-Fu （南通精華制藥有限公司），阿霉素（ADM汕頭經(jīng)濟(jì)特區(qū)明治醫(yī)藥有限公司），RPMI1640（美國GIBCO公司），新生小牛血清（杭州四季青生物研究所），MTT DMS0胰蛋白酶（美國Sigma公司），倒置顯微鏡（重慶光學(xué)儀器廠），酶標(biāo)儀（美國 Biotek 公司）。1.3 方法1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)將SGC-7901細(xì)胞置于10%生小牛血清、100U/mL青霉素、100卩g/mL鏈霉素

9、的RPMI1640培養(yǎng)液中。SGC-7901/ADF細(xì)胞置于含 1.0卩g/mL ADM勺上述培養(yǎng)液中，37C、5%CO飽和濕度孵箱內(nèi)培養(yǎng)（醫(yī)藥學(xué)/ 臨床醫(yī)學(xué)論文）。SGC-7901/ADR田胞實(shí)驗(yàn)兩周前培養(yǎng)于不含 ADM勺培養(yǎng)液中。1.3.2 確定SGC-7901/ADR寸5-FU的耐藥性采用MTT法，取對數(shù)生長期的SGC-7901細(xì)胞和SGC-7901/ADF細(xì)胞，以5X 104密度接種于96孔板 上，培養(yǎng)24小時(shí)。實(shí)驗(yàn)孔加入不同濃度的 5-FU （10.0卩g/L105卩g/L ）（參 照臨床用量的血峰濃度設(shè)定實(shí)驗(yàn)藥物濃度）。每濃度設(shè) 5個(gè)平行孔，培養(yǎng) 48小 時(shí)，加入20卩L （5.0

10、g/L ） MTT 4小時(shí)后加入DMSO 150卩L,搖床搖勻，以酶 標(biāo)儀490nm波長測定各孔吸光度（A值）。計(jì)算不同濃度下細(xì)胞的存活率3 SR=（實(shí)驗(yàn)組A值/對照組A值）X 100%、半數(shù)抑制濃度IC50及相對耐藥 性4（RF=耐藥細(xì)胞株IC50/胃癌細(xì)胞株IC50）。Nightingales will not sing in a cage.1.3.3 確定CsA VP TMP勺非細(xì)胞毒性劑量方法同上，以SGC-7901細(xì)胞和SGC-7901/ADR田胞為靶細(xì)胞。設(shè)空白對照組、陰性對照組、CsA組(1.0mg/L、2.0mg/L、3.0mg/L、4.0mg/L、5.0mg/L)、VP組(5

11、.0mg/L、 10.0mg/L、20.0mg/L、40.0mg/L、80.0mg/L)、TMPfi(100.0mg/L、 200.0mg/L、 300.0mg/L、 400.0mg/L、 500.0mg/L) ，計(jì)算細(xì)胞在不同藥物濃度下 的 SR。1.3.4 觀察CsA VP TMP的逆轉(zhuǎn)作用采用MTT法，在SGC-7901細(xì)胞和SGC-7901/ADF細(xì)胞中加不同濃度 5-FU（10.0卩g/L105卩g/L ）、不同濃 度5-FU（10.0卩g/L105卩g/L）+非細(xì)胞毒性劑量的“逆轉(zhuǎn)劑”，計(jì)算藥物的 IC50及逆轉(zhuǎn)倍數(shù)RI（RI=單獨(dú)用藥IC50/聯(lián)合逆轉(zhuǎn)劑后IC50）。1.3.5

12、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行回歸分析、t檢驗(yàn)及方差分析，P 95%5時(shí)，確定為本實(shí)驗(yàn)采用的非細(xì)胞毒性劑量，即 CsA在3.0mg/L、VP在10.0mg/L、TMP在 300.0mg/L濃度以下。在此劑量范圍 內(nèi)各種藥物對SGC-7901細(xì)胞亦無明顯細(xì)胞毒性作用，見表 2、表3、表4。The farmers are the founders of civilization and prosperity.表2CsA在不同濃度下對SGC-7901/ADF細(xì)胞存活率的影響（略）表3VP在不同濃度下對SGC-7901/ADF細(xì)田胞存活率的影響（略）表4TMP在不同濃度下對SGC-790

13、1/ADF細(xì)田胞存活率的影響（略）2.3 觀察CsA VP TMP的逆轉(zhuǎn)作用在非細(xì)胞毒性劑量范圍內(nèi)，1.03.0mg/L CsA無逆轉(zhuǎn)作用，VP和TMP對SGC-7901/ADF細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)作用呈 劑量依賴關(guān)系（ RVP=0.999， P=0.001；RTMP=0.97，2 P=0.001）。300.0mg/L TMP較 10.0mg/L VP逆轉(zhuǎn)作用強(qiáng)（P0.01）。300.0mg/L TMP能 顯著增加SGC-7901/ADF細(xì)胞對5-FU的敏感性（P0.05）,使耐藥細(xì)胞相對耐藥性降至 12.89 , 5-FU IC50由 13.001 mg/L下調(diào)到1.542mg/L ,逆轉(zhuǎn)倍數(shù)為8.4

14、3倍，是有效的逆轉(zhuǎn)劑，見表 5、表 6、表 7。論文教育信息網(wǎng) Love makes obedience easy.表5CsA對SGC-7901/ADF細(xì)胞耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用（略）*與5-FU組比較P0.05Good counsel never comes too late.表6VP對SGC-7901/ADF細(xì)胞耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用（略）* 與 5-FU 組比較 P0.01表7TMP寸SGC-7901/ADF細(xì)胞耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用（略）* 與 5-FU 組比較 P0.01; 與 5-FU+VP1C組比較 P0.013 討論腫瘤產(chǎn)生MDF的主要機(jī)制是P糖蛋白（P glycoprotin ，P-gp）及多

15、藥耐 藥性相關(guān)蛋白（multidrugresisteneeassociated protein ，MRP 的過表達(dá)6 ，引起藥物外流及細(xì)胞內(nèi)藥物積蓄減少。胃癌多藥耐藥細(xì)胞系SGC-7901/ADR對阿霉素、長春新堿、絲裂霉素等多種藥物具有耐藥性7。本研究證實(shí)，SGC-7901/ADR田胞對5-FU同樣具有耐藥性，相對耐藥性為 97.49。鈣離子拮抗劑VP是第一個(gè)應(yīng)用于臨床的MDF逆轉(zhuǎn)劑，可與細(xì)胞膜上的P- gp結(jié)合，有效逆轉(zhuǎn)P-gp藥物泵的作用，還可在 mRN水平上抑制P-gp合成及 活性，使化療藥物在細(xì)胞內(nèi)濃度升高，細(xì)胞毒效應(yīng)增強(qiáng) 8 。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示， 5.0mg/L和10.0mg/L V

16、P均可增加SGC-7901/ADR田胞對5-Fu的敏感性且呈劑 量依賴關(guān)系。但在臨床實(shí)踐中，因其具有心臟毒性、神經(jīng)毒性、骨髓抑制而限 制了它的臨床應(yīng)用，故而逆轉(zhuǎn)作用不能充分發(fā)揮。TMP為中藥川芎的主要有效成分，屬酰胺類生物堿，目前認(rèn)為它是一種新型的鈣離子拮抗劑9。近年來發(fā)現(xiàn)，TMP可通過多種途徑對腫瘤起到治療和輔 助治療的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，100.0300.0mg/L TMP能增加SGC- 7901/ADR細(xì)胞對5-Fu的敏感性并呈劑量依賴關(guān)系，且 300.0mg/L TMP寸耐藥 細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)作用強(qiáng)于10.0mg/L VP （ P0.01）。根據(jù)體外實(shí)驗(yàn)抗癌藥物療效的 評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)10，將藥物

17、的IC50明顯下調(diào)10.0卩g/mL,說明藥物在體外的殺傷劑 量，對體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究有重要參考價(jià)值。TMP逆轉(zhuǎn)機(jī)理可能通過多靶點(diǎn)發(fā)揮作用11，機(jī)制包括：（1）具有鈣拮抗作用并降低谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST活性； 影響多藥耐藥相關(guān)基因（MDR1的表達(dá)及P-gp、MRP肺耐藥相關(guān)蛋白（LRP功能；（3）降低抗凋亡基因bcl-2與bcl-xl高表達(dá)等。CsA據(jù)報(bào)道也可逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性，但在本實(shí)驗(yàn)中并不能增加SGC-7901/ADR細(xì)胞對5-Fu的敏感性，與Jette12和郭和清等13的實(shí)驗(yàn)結(jié)論一 致。本實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)的現(xiàn)象可能與 CsA誘導(dǎo)P-gp表達(dá)有關(guān)。綜上所述，體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)TMP寸SGC-7901/

18、ADF細(xì)胞耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用最強(qiáng) P0.01 ），且不良反應(yīng)少，為胃癌的治療提供重要依據(jù)。參考文獻(xiàn)】1 Lopes EC，Scolnik M,Alvarez E,etcloporin-al.Modulatoractivityof psc833 and cyA in cincristinemurine leukemicand doxoubic in selected multidrugresistantcellsJ.LeuK Res,2001,25(1) ： 85-93.2 Shiraki N,Okamura K,TokunagaP-glycoprotein-mediated multidrug

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