腦立清片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的修訂實(shí)驗

1、腦立清片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的修訂實(shí)驗中級質(zhì)量工程師論文第三篇摘要：目的 對腦立清片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行增修提高。方法 對腦立清片中牛膝、珍珠母和清半夏進(jìn)行顯微鑒定， 對赭石、磁石進(jìn)行了理化鑒別， 建立了腦立清片中牛膝、豬膽汁及冰片的薄層色譜鑒別方法， 采用原子吸收分光光度法測定腦立清片中的鐵含量， 采用氣相色譜法測定腦立清片中冰片和薄荷腦的含量。結(jié)果 顯微鑒別操作簡單， 效果佳， 理化鑒別反應(yīng)專屬性強(qiáng)。薄層色譜中特征斑點(diǎn)清晰， 分離度好。薄荷腦和龍腦分別在0.059 80.997 0和0.061 61.028 0 mg·m L-1線性關(guān)系良好， 平均回收率分別為102.70%和101.40%,

2、RSD分別為1.26%和0.92%.采用原子吸收分光光度法測定鐵含量在0.510.0 mg·m L-1的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好， 平均回收率為100.83%, RSD為1.46%.結(jié)論該方法專屬性強(qiáng)， 穩(wěn)定性好， 重復(fù)性好， 能夠有效評價與控制腦立清片的質(zhì)量。關(guān)鍵詞：腦立清片； 色譜法， 薄層； 色譜法， 氣相； 分光光度法， 原子吸收； 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；腦立清片由薄荷腦、冰片、磁石、赭石、珍珠母、牛膝等十余味中藥材組成，具有平肝潛陽、醒腦安神之功效，用于頭暈?zāi)垦！⒍Q口苦、心煩難寐及高血壓，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)收載于衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑 （第十九冊） 1.腦立清片為國家醫(yī)保目錄品種，現(xiàn)行質(zhì)

3、量標(biāo)準(zhǔn)中僅收載了處方、制法、性狀、顯微鑒別及薄層鑒別等項目，難以有效控制藥品質(zhì)量及用藥安全性。近年來，隨著中藥制劑研究的不斷深入以及藥物分析技術(shù)的快速發(fā)展，對中成藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制訂也提出更高的要求。腦立清片全國共有3家生產(chǎn)企業(yè)，3個批準(zhǔn)文號，筆者對其中2家生產(chǎn)企業(yè)的6批腦立清樣品進(jìn)行研究，增加了牛膝的顯微鑒別、磁石、赭石的理化鑒別，增加了牛膝、豬膽汁的薄層鑒別，采用氣相色譜法對薄荷腦、冰片的含量進(jìn)行了測定，并采用原子吸收分光光度法測定了制劑中鐵的含量，修訂后的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)可對腦立清片進(jìn)行準(zhǔn)確的定性和定量測定，能夠有效評價與控制其質(zhì)量。1 儀器與試藥1.1 儀器奧林巴斯BX53顯微照相系統(tǒng)；Agile

4、nt7890A氣相色譜儀及FID檢測器；TAS-986原子吸收分光光度計 （北京普析通用儀器有限責(zé)任公司） ;XP205電子天平梅特勒-托尼多儀器 （上海） 有限公司，感量：0.01 mg;Agilent HP-INNOWax （30.0 mm×250 mm, 0.25 mm） 彈性石英毛細(xì)管柱。1.2 試藥齊墩果酸對照品 （批號：110709-200304） 、豬去氧膽酸對照品 （批號：0087-9708） 、薄荷腦對照品 （批號：0728-200006） 、龍腦對照品 （批號：110881-200706,含量：99.2%） 均來自中國食品藥品檢定研究院；鐵元素標(biāo)準(zhǔn)溶液 （100

5、0 mg·m L-1,中國計量科學(xué)院國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心） ;其余所有試劑均為分析純或優(yōu)級純；6批腦立清片樣品分別來源于A （批號：091104, 101104, 100803） 及B （批號：10515, 100506, 100803） 兩家生產(chǎn)企業(yè)。2 方法與結(jié)果2.1 顯微特征鑒別取腦立清樣品研細(xì)，置顯微鏡下觀察 （圖1） ,草酸鈣砂晶充塞于薄壁細(xì)胞中 （牛膝） .不規(guī)則碎塊，表面多不整齊，呈明顯的顆粒性 （珍珠母） .草酸鈣針晶束存在于橢圓形黏液細(xì)胞中或隨處散在 （清半夏） .2.2 理化鑒別取腦立清樣品適量，研細(xì)，取約1 g,用水淘洗，可得少量棕褐色沉淀。取沉淀，加鹽酸

6、2 m L,振搖，濾過，取濾液，加硫氰酸銨試液2滴，即顯血紅色。取缺赭石、磁石的陰性樣品，同法處理，結(jié)果不顯血紅色。2.3 薄層色譜鑒別2.3.1 牛膝的鑒別（1） 溶液制備。取腦立清樣品適量，研細(xì)，取約5 g,加乙醇30 m L,加熱回流40 min,放冷，濾過，取濾液15 m L,加鹽酸1 m L,加熱回流1 h,放泠，加水20 m L,用石油醚 （6090） 15 m L振搖提取4次，提取液蒸干，殘渣加乙醇1 m L使溶解，作為供試品溶液。按處方中比例制備缺牛膝的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液。取齊墩果酸對照品，加乙醇制成每毫升含1 mg的溶液，作為對照品溶液。（2） 色

7、譜條件。照薄層色譜法 （中華人民共和國藥典2015年版四部通則05025） 實(shí)驗，吸取供試品溶液和陰性對照溶液各10μL,對照品溶液3μL,分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層預(yù)制板上，以三氯甲烷-甲醇 （401） 為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，于105加熱至斑點(diǎn)顯色清晰2,3,4.（3） 鑒別結(jié)果。供試品溶液、陰性對照溶液及對照品溶液在上述色譜條件下進(jìn)行薄層色譜鑒別，結(jié)果見圖2.可見，在與對照品色譜相應(yīng)位置上，供試品色譜中顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對照無干擾。2.3.2 豬膽汁的鑒別（1） 溶液制備。取腦立清樣品適量，研細(xì)，取約5 g,加甲醇40 m L,加熱回流2 h,濾過

8、，濾液蒸干，殘渣加10%氫氧化鈉溶液10 m L,在120加熱4 h,放冷，加水30 m L充分溶解，濾過，濾液加鹽酸調(diào)節(jié)pH值至23,搖勻，用乙酸乙酯振搖提取4次，每次15 m L,合并提取液，蒸干，殘渣加乙醇2 m L使溶解，作為供試品溶液。按處方中比例制備缺豬膽汁的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液。另取豬去氧膽酸對照品，加乙醇制成每毫升含1 mg的溶液，作為對照品溶液。（2） 色譜條件。按照薄層色譜法 （中華人民共和國藥典2015年版四部通則05025） 實(shí)驗，吸取上述兩種溶液各5μL,分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以異辛烷-乙醚-正丁醇-冰醋酸-水 （105351）

9、的上層溶液為展開劑 （臨用新配） ,展開，取出，晾干，噴以10%磷鉬酸乙醇溶液，于105加熱至斑點(diǎn)顯色清晰6.（3） 鑒別結(jié)果。供試品溶液、陰性對照溶液及對照品溶液在上述色譜條件下進(jìn)行薄層色譜鑒別，結(jié)果見圖3.可見，在與對照品色譜相應(yīng)位置上，供試品色譜中顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對照無干擾。圖1 腦立清片顯微圖 （15×20）圖2 牛膝的薄層色譜圖圖3 豬膽汁的薄層色譜圖2.4 含量測定2.4.1 薄荷腦和龍腦的含量測定（1） 色譜條件。Agilent HP-INNOWax （30.0 mm×250 mm, 0.25μm） 彈性石英毛細(xì)管柱，氮?dú)?（N2） 為載氣，流

10、速：1.0 m L·min-1,進(jìn)樣量：2μL,柱溫160；理論板數(shù)以龍腦和薄荷腦峰計算均不低于10 000.與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的分離度1.57,8,9,10,11,12,13,14,15.（2） 溶液的制備。對照品溶液：取水楊酸甲酯適量，精密稱定，加無水乙醇制成每毫升含約10 mg的溶液，作為內(nèi)標(biāo)溶液；另取龍腦對照品約10 mg、薄荷腦對照品約10 mg置10 m L量瓶中，加無水乙醇溶解后稀釋至刻度；再精密吸取2 m L,置10 m L量瓶中，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液1 m L,用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得龍腦和薄荷腦對照品溶液。供試品溶液：取本品20片，精密稱定，研細(xì)，混勻，取約

11、2 g,精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加入無水乙醇25 m L,稱定質(zhì)量，加熱回流30 min,取出放冷，再稱定質(zhì)量，用無水乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液5 m L,置10 m L量瓶中，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液1 m L,用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得。陰性對照溶液：按照腦立清片的處方比例分別制備缺冰片和薄荷腦的陰性樣品，照供試品溶液的制備方法，制成陰性對照溶液。（3） 專屬性實(shí)驗。精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液及陰性對照溶液，注入氣相色譜儀分析 （圖4） ,結(jié)果表明陰性樣品無干擾，樣品與內(nèi)標(biāo)之間無干擾。（4） 線性關(guān)系考察。精密稱取水楊酸甲酯0.531 4 g,置于50 m L

12、量瓶中加適量無水乙醇溶解后，用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為內(nèi)標(biāo)溶液。另精密稱取龍腦對照品51.81 mg、薄荷腦對照品49.85 mg,置25 m L量瓶中，加無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻；分別精密吸取此對照品溶液0.3, 1.0, 2.0, 3.0, 5.0 m L,置10 m L量瓶中，再精密吸取上述內(nèi)標(biāo)溶液1 m L,分別加入量瓶中，加無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別吸取上述5種系列對照品溶液各2μL,注入氣相色譜儀，以濃度 （X） 為橫坐標(biāo)，以對照品與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)水楊酸甲酯的峰面積之比 （Y） 為縱坐標(biāo)，進(jìn)行回歸，回歸方程為：薄荷腦：Y=1.537X+0.000 7, r=0

13、.999 9和龍腦：Y=1.574 5X+0.010 8, r=0.999 9.結(jié)果表明，龍腦對照品在0.061 61.028 0 mg·m L-1;薄荷腦對照品在0.059 80.997 0 mg·m L-1的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。（5） 重復(fù)性實(shí)驗。精密稱取樣品6份 （批號：100515） ,按;項下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測定，結(jié)果樣品中龍腦和薄荷腦的含量分別為每片2.06和1.06 mg, RSD分別為1.88%和2.35%.圖4 腦立清片氣相色譜圖A.對照品+內(nèi)標(biāo)；B.供試品+內(nèi)標(biāo)；C.缺冰片的陰性對照+內(nèi)標(biāo)；D.缺薄荷腦的陰性對照+內(nèi)標(biāo)；

14、1.薄荷腦；2.龍腦；3.內(nèi)標(biāo) （水楊酸甲酯） .A.reference and internal standard;B.sample and internal standard;C.negative control without borneol and internal standard;D.negative control without menthol and internal standard;1.menthol;2.borneol;3.internal standard （methyl acetylsalicylate） .（6） 回收率實(shí)驗。精密稱取6份已測定含量的樣品各1 g

15、（批號：100515;含量：龍腦4.10 mg·g-1,薄荷腦2.10 mg·g-1） ,精密加入混合對照溶液 （龍腦：2.086 mg·m L-1、薄荷腦：1.052 mg·m L-1） 2 m L,按;項下方法制備供試品溶液，測定含量，計算加樣回收率，結(jié)果見表1, 2.龍腦和薄荷腦的平均回收率分別為101.40%和102.70%,RSD分別為0.92%和1.26%.（7） 穩(wěn)定性實(shí)驗。精密吸取供試品溶液 （批號：100515） 2μL,于0, 2, 4, 6, 8, 12 h進(jìn)樣分析，記錄峰面積，計算龍腦、薄荷腦與

16、內(nèi)標(biāo)物的峰面積比，其RSD分別為1.59%和0.41%,說明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定性良好。表1 腦立清片中龍腦和薄荷腦回收率測定結(jié)果表2 樣品的含量測定結(jié)果（8） 樣品的測定。取6批樣品，按;項下方法制備供試品溶液，精密吸取2μL注入氣相色譜儀，記錄峰面積，計算含量，結(jié)果見表磁石、赭石中鐵含量的測定（1） 測定條件。波長：248.3 nm;狹縫：0.2 nm;燈電流：3.0 m A;光源為鐵空心陰極燈。采用空氣-乙炔火焰；空氣流量：7.0 L·min-1;乙炔流量：1.7 L·min-116,17,18,19,20.（2） 溶液的

17、制備。對照品溶液的制備：精密量取鐵元素標(biāo)準(zhǔn)液 （中國計量科學(xué)院國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心，含量：1000μg·m L-1） ,配制成0.5, 1.0, 2.0, 5.0及10.0 g·m L-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液。供試品溶液的制備：取本品20片，研細(xì)，混勻，取約0.1 g,精密稱定，置凱氏燒瓶中，加硝酸-高氯酸 （41） 15 m L,混勻，瓶口加以小漏斗，浸泡過夜。置電熱板上加熱消解，保持微沸，若變棕黑色，再加硝酸-高氯酸 （41） 混合溶液適量，持續(xù)加熱至溶液澄明后升高溫度，繼續(xù)加熱至冒濃煙，直至白煙散盡，消解液呈無色透明或略帶黃色，放冷，轉(zhuǎn)入50 m L量瓶中，用2%

18、硝酸溶液洗滌容器，洗液合并于量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，即得。同法同時制備試劑空白溶液。（3） 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。取2.4.2 （2） ;項下的鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣，采用火焰法測定，以吸光度 （A） 為縱坐標(biāo)，濃度 （C） 為橫坐標(biāo)，計算回歸方程：A=0.009 7C-0.0386, r=0.999 48.結(jié)果表明，鐵檢測濃度在0.510.0μg·m L-1范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。（4） 重復(fù)性實(shí)驗。精密稱取樣品6份 （批號：100521） ,按2.4.2 （2） ;項下方法制備供試品溶液并測定，結(jié)果樣品總鐵含量為每片11.42 mg, RSD為3.41%,表明本方法重復(fù)性

19、良好。（5） 回收率實(shí)驗。精密稱取稱取6份已測定含量的樣品各0.05 g （含量：23.45 mg·g-1） ,分別精密加入鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液 （1000 mg·m L-1） 1 m L,按2.4.2 （2） ;項下方法制備樣品并測定，計算加樣回收率，結(jié)果表明，平均加樣回收率為100.83%,RSD為1.46% （表3） .表3 鐵回收率測定結(jié)果（6） 樣品的測定。取6批樣品，按2.4.2 （2） ;項下方法制備供試品溶液，測定，計算含量，結(jié)果見表4.表4 樣品的含量測定結(jié)果3 討論本實(shí)驗對腦立清片的顯微鑒別、理化鑒別及薄層色譜鑒別方法均進(jìn)行了增修，增加了冰片和薄荷腦的氣相

20、色譜定量測定方法，并采用原子吸收分光光度法對本制劑中總鐵含量進(jìn)行了測定，從而科學(xué)、有效地評價制劑的質(zhì)量。3.1 供試品的制備方法3.1.1 冰片和薄荷腦含量測定中供試品溶液的制備實(shí)驗過程中分別對提取溶劑及提取方法進(jìn)行考察，采用甲醇、乙醇、乙酸乙酯3種提取溶劑，超聲和回流2種提取方法測定樣品中龍腦及薄荷腦的含量，結(jié)果表明，回流提取的樣品中這2種成分含量較高；在此對回流時間進(jìn)行了考察，最終選取回流提取30 min制備供試品溶液。3.1.2 鐵含量測定中供試品溶液的制備分別比較了濕法消解及微波消解兩種方法，經(jīng)方法對比分析，因樣品中礦物藥比較多，濕法消解過程中為非密閉式消解，方便調(diào)整酸液的用量，故最終

21、采用濕法消解進(jìn)行樣品前處理。同時在消解過程中比較了硝酸、硝酸-高氯酸 （91） 及硝酸-高氯酸 （41） 等消解液，最終采用硝酸-高氯酸 （41） 混合液進(jìn)行濕法消解。3.2 含量測定限度的制定3.2.1 冰片和薄荷腦含量測定限度值的制定腦立清片中冰片及薄荷腦均為原料直接投料，理論轉(zhuǎn)移率應(yīng)接近90%,但按處方量計算樣品中龍腦和樟腦的平均轉(zhuǎn)移率僅為52.8%和21.0%,分析原因可能是因為冰片和薄荷腦均有揮發(fā)性，如貯藏保管不當(dāng)易造成損失。根據(jù)上述實(shí)驗結(jié)果，考慮到生產(chǎn)實(shí)際、冰片和薄荷腦藥材的質(zhì)量差異、貯存條件等的影響，并結(jié)合腦立清膠囊標(biāo)準(zhǔn)中的含量限度值，暫定本品每片含冰片 （以龍腦計） 為不得少于

22、1.45 mg,含薄荷腦不得少于1.05 mg.3.2.2冰片和薄荷腦含量測定限度值的制定本法制劑中所用的磁石及赭石含有鐵，中華人民共和國藥典2015年版一部中規(guī)定磁石的含量以鐵計算不得少于50.0%,赭石的含量以鐵計算不得少于45.0%.本實(shí)驗同樣采用原子吸收分光光度法對原藥材中的鐵含量進(jìn)行了測定，根據(jù)藥材中鐵含量的測定結(jié)果計算制劑中的平均轉(zhuǎn)移率為52.21%.根據(jù)平均轉(zhuǎn)移率，以合格藥材投料，按處方量計算制劑中的鐵含量理論值為每片16.81 mg,故最終將其限度值規(guī)定為每片16.8 mg.3.3 制劑質(zhì)量評價結(jié)果按擬定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)對收集的樣品進(jìn)行測定，結(jié)果顯示A廠家的3批樣品鐵含量均不合格，即

23、磁石、赭石含量不合格，提示部分生產(chǎn)企業(yè)樣品原料質(zhì)量較差；B廠家的3批樣品中1批龍腦含量不合格，1批在限度邊緣，因為龍腦為原料藥直接投料，提示該企業(yè)的樣品在生產(chǎn)和貯存過程中龍腦揮發(fā)而導(dǎo)致含量偏低，可能需要改進(jìn)生產(chǎn)工藝及包裝材料，減少揮發(fā)性成分在生產(chǎn)和貯存過程的損耗。參考文獻(xiàn)1 國家藥典委員會。衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑 （第十九冊） M.北京：人民衛(wèi)生出版社， 1998:164.2 劉皈陽， 何世榮， 黎春彤， 等。腎復(fù)康膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究J.中國藥師， 2016, 19 （1） :61-64.3 陳震堯， 陳金英， 姚偉生， 等。烏芪舒筋通絡(luò)片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究J.中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)， 2017,

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