流式細胞儀操作規(guī)程-SOP

1、流式細胞儀操作規(guī)程目錄1:淋巴細胞亞群測定及絕對計數2：活化淋巴細胞亞群、記憶T及純真T的檢測3： HLA-B27 測定4： CD55 / CD59 測定5：干細胞檢測和絕對計數6：白血病免疫分型測定7：淋巴細胞T細胞亞群細胞內因子IFN- V /IL-4測定38：細胞周期分析9：活化血小板檢測10：血小板抗體測定11：紅細胞抗體測定12：粒細胞抗體測定淋巴細胞亞群測定（流式細胞儀）醫(yī)院檢驗科操作規(guī)程文件號：200年月日起實施第1版（共3頁）本規(guī)程每2年復審一次復審日期：年月日復審人：規(guī)程編寫者：審批者：批準日期：年月_日文件分發(fā)部門和/或個人 院檔案室保管者：檢驗科主任：檢驗科實驗室：淋巴細

2、胞亞群測定方法流式細胞儀（BeckmanCoulter, 貝克曼庫 爾特）原理：雙/三色/四色直接免疫熒光法。熒光素標記的各種單克隆抗體加入到全血中， 與白細胞膜上相應的抗原結合，經過溶血、洗滌（和固定）等步驟后，在流式 細胞儀上進行分析，從而得到淋巴細胞亞群的百分數，加入Flow-Count即可 得出絕對計數。淋巴細胞表面抗原分布如下：T淋巴細胞：CD3+； B淋巴細胞: CD3-, CD19+；輔助性T淋巴細胞：CD3+CD4+；抑制性T淋巴細胞：CD3+CD8+； NK細胞：CD3-CD16+56+等。根據淋巴細胞膜上CD分子表達的不同，流式細胞 儀可以分辨出淋巴細胞及其各種不同的亞群，

3、利用計算機軟件計算出淋巴細胞 亞群的百分數，加入 Flow-Count 組會自動得岀絕對計數。標本采集與處理受檢者的準備檢查對象生活飲食處于日常狀態(tài)。采集部位靜脈采血抗凝劑EDTA或肝素抗凝血要求 1.樣本量lmlo2. 樣本應在采集后6小時內處理，冷凍或溶血的標本不能用。3. 樣本白細胞計數應在之間。若X109/L,樣本需要稀釋，用PBS稀釋；若X107L,應分離單個核細胞。試劑品牌劑型 規(guī)格 貯存貝克曼庫爾特成分1：單克隆抗體液體28C（CD45/4/8/3CD45/56/19/3CD4/8/3 同型對照 IgGl/IgGl/IgGlCD3/19CD3/16+56CD19-PC5Flow-

4、Count熒光微球2：全血溶血試劑（Q-Prep）液體A：甲酸液體70ML室溫B：碳酸鈉等液體32ML室溫C：多聚甲醛液體14ML室溫(Opt訂yse C 液體室溫3：鞘液液體20L室溫4：清洗液液體5L室溫5：熒光微球 液體10ML2-8GC （Flow-Check）儀器BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra樣本制備：1）按照要求，分別向已編好號的試管中加入10/20 ul單克隆抗體和同型對照2）分別向試管中加入混勻的100ul抗凝血。3）混勻，避光，室溫孵育20-30分鐘4）溶血：a. OptiLyse C（按說明書步驟溶血）b.使用COULTER QPRE

5、P制備系統開機一-顯示READY燈亮一-選擇35SEC燈亮一-開門-一放入試管 關門一-自動進行溶血-一顯示READY燈亮-一開門-一取出試管 -一再進行下一個樣品測定。（*溶血前確認A/B/C管路充滿并能打出液體）5）上機測樣（可根據樣本情況選擇洗或不洗上樣）6）需要做絕對計數的指標，在相應管中加入與血樣等量的Flow-Count （務必做 到三同：同槍，同人，同種方法加Flow-Count, 而且加完即上機）報告結果報告百分數（和絕對值）操作性能精密度批內五次重復CV2%參考值（百分數（絕對值）CD3+CD4+ CD8+NK（175-567）Th/Ts臨床意義、B淋巴細胞亞群是重要的免疫狀

6、態(tài)檢測指標，在腫瘤、免疫缺陷、病毒感染, 自身免疫性疾病、創(chuàng)傷、急性感染、多臟器功能衰竭、器官移植等具有臨床 診斷、病情判斷、治療等價值。臨床常用Th/Ts比值來判斷病人的免疫狀況。Th/Ts比值升高：表示免疫功能亢進：見于自身免疫性疾病，如SLE、類風濕 性關節(jié)炎、自身免疫性溶血性貧血、重癥肌無力以及HBsAg+乙肝等。Th/Ts比值減低：表示免疫功能下降：艾滋病、病毒感染、腫瘤病人、慢活肝 和活動性肝硬化、再生障礙性貧血、粒細胞減少患者。2： NK細胞主要破壞各種腫瘤細胞和感染某些病毒、細菌的細胞，所以在抗腫瘤和 防御疾病中起主要作用。NK活性減低主要見于各種惡性腫瘤、自身免疫性疾病、 病

7、毒感染、應用免疫抑制劑，疲勞綜合征病人等，NK活性隨年齡增長而減退。NK細胞也參與第二型超敏反應和移植物抗宿反應，白介素-2治療后；外周血NK 細胞增加。出淞(protocol)1榛鄰舞I7W8BSC?5if e匸二“ r o -r I-占八:.4，: p(g|i 1 X RSLP; K|動 dtfS Y | Ddeaai Cawxnjatn |F55-(1(Og仏昶riiaaoA(Qx/x)n oxfeG&e*|U3&zJr SeupWr QiKUONPr “43*盯血Q5/如 WV* DuTJTMn 創(chuàng)徒 EGJSrF100SS卯rncc*rfCfFFCOF心xr*1KaFBmmWbx I

8、USF$FUFU點擊-TTrFi4$c4 何何5|3SLnzJOamrmaF5Lri Lr AFC Loa PE LoaPCS Log FRRN到匚,PJprr)xhn甲 G*4 UOFiwkttOJb lOTvwtj(號 Z95HV申 save)2. aWFMUu$ei.n1c1. :!2 :reWFUlcU U9IC5、盧W fU1 Lc9*t2UoUl3111111114；11叫吟FfTCPC5V7:1:1:11 =1:1-12=314e5K結果|F1A)2 Cdc CO3 CCM LMD FL LOOI爐12SOTCO3 GM IMO FL1 IOGF121D62 CSS|F 1 (4

9、| 2 Color CD3 COl9tr4D FIH LOGfL2 IOG此圖為CD45圈門如果做絕對計數，則tPn 鄧)032 ADCQ Q以 口 v.-t _F 匸ill i ：1 |3丄 :ndfrwPe：e.| x |gd i h呂c?邁.引農g*亠對Kbrfa Edt 皿iMft Tc4i Pfau : AmM rt=e4A(Z f WrS *ytcvetv tlWuiyusik 產KOI WO Z如S5如P ZcMjrPRO 3ct*3rP5S5-chP 3ctlxSY5出 dJ cc*FS-SSlJ afcrSSHP 血MN飾“比 ACCF2tFUHT( ACcrztri2Ftr

10、 ArcrztrhM-5*.ACCFZYw/y.jr, 心 F3t3SsttH 心:FHRgPRDTOCOL1PRO Pl=4lGaiLMDFi.iQ0 ICO選中cell/ul即可活化淋巴細胞亞群、記憶T及純真T的測定方法流式細胞儀(BeckmanCoulter, 貝克曼庫爾特)原理：雙/三色直接免疫熒光法。熒光素標記的各種單克隆抗體加入到全血中，與白 細胞膜上相應的抗原結合，經過溶血、洗滌(和固定)等步驟后，在流式細胞 儀上進行分析，從而得到相應各亞群的百分數。活化淋巴細胞表面抗原為 CD3+/CD25+和 CD3+/HLA-DR+。CD3+/CD45RO+ 是記憶型 T 細胞。CD3+/

11、CD45RA+ 是純真型T細胞。標本采集與處理受檢者的準備檢查對象生活飲食處于日常狀態(tài)。采集部位靜脈采血抗凝劑EDTA或肝素抗凝血要求 1.樣本量lmlo2. 樣本應在采集后6小時內處理，冷凍或溶血的標本不能用。3. 樣本白細胞計數應在之間。若X109/Lt樣本需要稀釋，用PBS稀釋；若X107L,應分離單個核細胞。試劑劑型 規(guī)格 貯存貝克曼庫爾特成分1:單克隆抗體液體28 C(CD3/HLA-DR CD3-FITCCD25-PC5CD45RA-PECD45R0-PE2：全血溶血試劑(Q-Prep) A：甲酸 B：碳酸鈉等 C：多聚甲醛(Optilyse C 液體3:鞘液 液體 4：清洗液液體

12、 5：熒光微球液體CD4-PC5) 液體20L5L10ML體體體液液液室溫室溫室溫2-8C (Flow-Check)儀器BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra樣本制備：1）按照要求，分別向已編好號的試管中加入10/20 ul單克隆抗體和同型對照2）分別向試管中加入混勻的100ul抗凝血。3）混勻，避光，室溫孵育20-30分鐘4）溶血：a. OptiLyse C（按說明書步驟溶血）b.使用COULTER QPREP制備系統開機一-顯示READY燈亮一-選擇35SEC燈亮一-開門-一放入試管 關門一-自動進行溶血-一顯示READY燈亮-一開門-一取出試管 -一再進行

13、下一個樣品測定。（*溶血前確認A/B/C管路充滿并能打出液體）5）上機測樣（可根據樣本情況選擇洗或不洗上樣）報告結果報告百分數操作性能精密度 批內五次重復CV5-10%提示排斥、 持續(xù)增加提示應作病理活檢；CD3+/HLA-DR+增加5-10%但不伴CD25增加提示MCV感染。2.正常機體內各種T細胞之間以及與其他免疫細胞之間在數量上保持一定比例，如果它 們之間比例失調就會引起免疫功能親亂，將導致機體免疫力下降和感染性疾病、自身 免疫病、腫瘤等疾病的發(fā)生，檢測淋巴細胞各種亞群有助于疾病的診斷、預后和治療。 CD45RA. CD45R0均為T細胞的輔助分子，CD45RA+純真型T細胞當免疫力下降

14、時減少； CD45R0+記憶型T細胞對第二次抗原刺激極其敏感，通常在急性感染疾病中增加，在慢 性感染疾病中減少。方案（Protocol） 同淋巴細胞亞群檢測結果（Result）HLA-B27 測定方法流式細胞儀（BeckmanCouIter,貝克曼庫爾特）原理：雙色直接免疫熒光法。將HLA-B27-FITC/ HLA-B7-PE單克隆抗體加入到全血中, 與白細胞膜上相應的抗體結合，經過溶血、洗滌（和固定）等步驟后，在流式 細胞儀上進行分析，測定HLA-B7陰性而HLA-B27陽性細胞的平均熒光強度和 所占的百分比。標本采集與處理受檢者的準備檢查對象生活飲食處于日常狀態(tài)。采集部位靜脈采血抗凝劑E

15、DTA或肝素抗凝血要求 1.樣本量lmlo2. 樣本應在采集后6小時內處理，冷凍的標本不能用。3. 樣本白細胞計數應在之間。若Xl（y7L,樣本需要稀釋，用PBS稀釋；若xio7l,應分離單個核 細 胞。4. 溶血樣本不能用。試劑品牌 貝克曼庫爾特劑型規(guī)格貯存成分1:單克隆抗體液體1ML28 C（HLA-B27/HLA-B7 同型對照 IgGl / IgG2a ） 2：全血溶血試劑L L Lal 1A m 1A L 0 2 4 07 3 12L日皿日皿日血日皿日皿 室室室室室A：甲酸B：碳酸鈉等C：多聚甲醛3：鞘液4：清洗液5：熒光微球質控品BEKAMANCOULTER產品，未開瓶的試劑于2-

16、8C保存，可在有效期內保 持穩(wěn)定，稀釋的試劑于2-8可穩(wěn)定2周；每天校準一次：遇特殊情 況隨時進行校準。儀器BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra樣本制備：1）按照要求，分別向已編好號的試管中加入20 ul單克隆抗體和同型對照 （IgG2a-FITC/ IgGl-PE）2）分別向試管中加入混勻的100ul抗凝血。3）混勻，避光，室溫孵育20-30分鐘4）溶血：a. OptiLyse C（按說明書步驟溶血）b.使用COULTER QPREP制備系統開機一-顯示READY燈亮一-選擇35SEC燈亮-一開門一-放入試管 關門一-自動進行溶血一-顯示READY燈亮-一開

17、門-一取出試管 -一再進行下一個樣品測定。（*溶血前確認A/B/C管路充滿并能打出液體）5）洗、離心、上機測樣（備注：測B27 定要至少洗一遍方可上機檢測） 報告結果報告陰陽性操作性能精密度 批內五次重復CV90%。HLA復合體位于第6號染色體的短臂上，該區(qū)DNA片段長度約3000-4000KB, 占人體整個基因的1/3000, HLA-B27是HLA-1類基因中B位點上的一個等位基 因，與多種疾病具有相關性，尤其是強直性脊柱炎。HLA-B27基因屬于I型 MHC基因，所有有核細胞上均有表達，尤其是淋巴細胞表面含量豐富，人們發(fā) 現HLA-B27抗原表達與強直性脊柱炎有高度的相關性，超過90%的

18、強直性脊柱 炎患者HLA-B27抗原表達陽性，而正常人群中僅5-10%的認為陽性。由于強直 性脊柱炎癥狀與許多疾病相類似，臨床上難以確診，因此HLA-B27檢測在疾病 的診斷中具有重要意義,HLA-B27的檢測是該疾病診斷和鑒別診斷中的一個重 要指標。方案（Protocol）1選參數3 u I；FFOIOOXIPTOL他 ftegn.sLyomc2 LQM心廠Setup M曲 r 26F 廠鼬沁wQ*SUhiII g J 怙cif H 6S IP . p - - Ia . ：1 H- L I r 8 3 2T% g * | 葉eg expels*! AxmPm Inh 2 如 l)|k6g$w

19、cdN 創(chuàng)1191Z2Axqj 溥 s rofc 3ZJ片e“12JW0 IGXW.0 2*rFSS5“P2 ecto PM 3cc*xF5$-.HPJ c血乃畑2 4 *r FSS 沁仃 iccto 35XP 心 FNRetW 心 LZtrui 鬥K A1cM*r AAuICOcfT總霽 E2 s二15JZJQ 2 .4- f V： “ M I 41 II X |i三j(必3 2 S3 Q HJ 創(chuàng)刃&*trrwuirp瓦焉ioomris口 lAdi： I 1 F a j -r O J r.-工圧旺I Il x lie*2dI畫2 0X|包蚣力0 _j *-15JXJQ 33 | DrtKi

20、cw | Grrcctwian doion 他|1(Cw5wxfBtI1317.Z*O“5r SeG氏dr卻站* r ocomp r rxwqu：&S5s02如.用0 SctofFS-SSM.roO R3Nm-r.yor |F$Lr OewMa sTuTT7mFM (WIMDXcT 如 nd?FSLh 的5 FITS PgH*|rl ( MKC 勻心:FN3SyM 封 AX F ?R.t (HT0S1QSO 回心:FNfU(P6)5nfroRwtfCtcrer$MJ-5JIftt jnng Oto lCOe*t5IxpeXTADCRb C Z IME Tec*? CC 20/ 口血邊如H*sa

21、a 、二一聲 s.i ts 員 y o | 廠鍵入文件名，點擊Save2畫圖:et.nen 哄un I I - 律o時N Hi ICO結果L positive (+)(FTlKjyp 1B7 IMD - 5 5fl=SIF1IVM 慚丄MO FL1 LOG1023(F1(A| 187 LMD FL2L0018? LMD FL1 LOGUFL2 LOGB?B2?X-Mean=2. negative (-)(F1|A| 136丄 MD: FL1 LO&fFLZLOGX-Mean=|F1|A134.LMD : FL1 LOG/FL2 LOGX-Mean=CD55/CD59 測定方法流式細胞儀（Bec

22、kmanCouIter,貝克曼庫爾特）原理：雙色直接免疫熒光法。近年的研究表明，紅細胞和白細胞膜上CD55和CD59 分子的表達量和缺乏表達細胞的數量對PNH診斷和鑒別有重要意義。血細胞 （紅細胞和白細胞）通過膜上的抗原分子與熒光素標記的CD55或CD59的多克隆 抗體結合。用流式細胞儀檢測CD55或CD59表達陽性細胞百分數。標本采集與處理受檢者的準備檢查對象生活飲食處于日常狀態(tài)。采集部位靜脈采血抗凝劑EDTA或肝素抗凝血要求 1.樣本量lmlo2. 樣本應在采集后6小時內處理，冷凍的標本不能用。3. 溶血樣本不能用。試劑品牌貝克曼庫爾特劑型成分1:單克隆抗體 液體(CD59-FITC CD

23、55-PE2：全血溶血試劑A：甲酸B：碳酸鈉等C：多聚甲醛3:鞘液4：清洗液5：熒光微球規(guī)格 貯存1ML28 CL L L fn fn n13 IA 1A 0 2 47 3 1質控品BEKAMANCOULTER產品，未開瓶的試劑于2-8C保存，可在有效期內保 持穩(wěn)定，稀釋的試劑于2-81可穩(wěn)定2周；每天校準一次：遇特殊情 況隨時進行校準。儀器BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra樣本制備：（一）白細胞CD55 /CD59檢測1. 準備2支流式細胞儀專用管，分別標記。分別向二管中加入樣品lOOuU2. 溶血：a. OptiLyse C（按說明書步驟溶血）b.使用C

24、OULTER QPREP制備系統開機一-顯示READY燈亮-一選擇35SEC燈亮-開門-一放入試管 關門一-自動進行溶血一-顯示READY燈亮一-開門一-取出試管 -一再進行下一個樣品測定。（*溶血前確認A/B/C管路充滿并能打出液體）3. 離心后分別加入CD55/CD59 10ul和相應的同型對照10ulo避光20-30分鐘。4. 洗滌離心5. 上機測樣（二）紅細胞CD55 / CD59檢測1. 準備2支流式細胞儀專用管，分別標記2. 分別加入CD55 / CD59 10ul和相應的同型對照lOulo3. 向二管中加入1: 200稀釋的樣品lOOul （可根據紅細胞的數量調整），避 光20-

25、30分鐘。4. 洗滌離心。5. 混勻、上機測樣。報告結果報告百分數操作性能精密度 批內五次重復CV97%CD5997%PNH 的臨界值：RBC CD5995%WBC CD5990%PNH的診斷值：RBC CD5991%大部分80%中性粒細胞CD5984%臨床意義用于AA和PNH的診斷和分型診斷。PNH時CD55和CD59明顯減低和缺如。(Protocol)(同 HLA-B27)CH su.3$UnCO5$FITCd FM logJFL? Lc9廬 聲 i 供1111Wass=n)2-D3M I II I I t t 11 *1 I I Icws-peCDWFITC結果:normal山卩2拆g

26、RP8c55.LKD . PVT1 UriFS Uncflsu.1023$3 Lin06IO1io107C(W9(F1|E1 RPBcd5599 LMD PwW Log(F1|E| RFBcd5599.LMD PMT2 Lo.pMT3 leg97.saw0*COM103 10*CD33:abnormalIbgS MTIUnre Log=FUnsH PMT3log1010*10*CD5S-FfTC L0干細胞檢測和絕對計數方法流式細胞儀（BeckmanCoulter,貝克曼庫爾特）原理：雙色直接免疫熒光法。熒光素標記的各種單克隆抗體加入到全血中，與干細胞 膜上相應的抗原結合，經過溶血、洗滌（和固

27、定）等步驟后，在流式細胞儀上 進行分析，從而得到百分數，加入Flow-Count即可得出絕對計數。標本采集與處理受檢者的準備檢查對象生活飲食處于日常狀態(tài)。采集部位靜脈采血抗凝劑EDTA或肝素抗凝血要求 1.樣本量lmlo2. 樣本應在采集后6小時內處理，冷凍或溶血的標本不能用。3. 樣本白細胞計數應在之間。若X109/L,樣本需要稀釋，用PBS稀釋；若X107L,應分離單個核細胞。試劑品牌 貝克曼庫爾特成分1:單克隆抗體（CD34 No. IM1871劑型 規(guī)格液體CD45-PC5 1M2652貯存28 C儀器Flow-Count熒光微球2：全血溶血試劑（Q-Prep）液體A：甲酸液體70ML

28、室溫B：碳酸鈉等液體32ML室溫C：多聚甲醛液體14ML室溫(Optilyse C 液體室溫液洗光鞘清熒3 4 5體體體液液液20L室溫5L室溫10ML2-8C (Flow-Check)BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra樣本制備：1）按照要求，分別向已編好號的試管中加入10 U1單克隆抗體和同型對照2）分別向試管中加入混勻的100ul抗凝血。3）混勻，避光，室溫孵育20-30分鐘4）溶血：a. OptiLyse C（按說明書步驟溶血）b.使用COULTER QPREP制備系統開機一-顯示READY燈亮一-選擇35SEC燈亮一-開門-一放入試管 關門一-自動進

29、行溶血-一顯示READY燈亮-一開門-一取出試管 -一再進行下一個樣品測定。（*溶血前確認A/B/C管路充滿并能打出液體）5）需要做絕對計數時，在相應管中加入與血樣等量的Flow-Count （務必做到三 同：同槍，同人，同種方法加Flow-Count,而且加完即上機）6）上機測樣報告結果報告百分數（和絕對值）操作性能精密度 批內五次重復CV2%參考值（百分數（絕對值）CD34+/CD45+%臨床意義目前把CD34作為造血干細胞的主要標志，CD34陽性細胞計數作為造血干 細胞水平定量的檢測方法。方案（Protocol） 同淋巴細胞亞群檢測結果（Result）PMT1 lirUFS LinELS

30、5 LinCD34白血病免疫分型測定方法流式細胞儀（BeckmanCoulter, 貝克曼庫爾特）原理：雙色直接免疫熒光法。熒光素標記的各種單克隆抗體加入到全血中，與細胞膜 上或膜內相應的抗原結合，經過溶血、洗滌（和固定）等步驟后，在流式細胞 儀上進行分析，從而得到百分數。標本采集與處理受檢者的準備檢查對象生活飲食處于日常狀態(tài)。采集部位骨髓采血抗凝劑EDTA或肝素抗凝要求 1.樣本量lmlo2. 樣本應在采集后6小時內處理，冷凍或溶血的標本不能用。3. 樣本白細胞計數應在之間。若X109/L,樣本需要稀釋，用PBS稀釋；若X109/L,應分離單個核細胞。試劑品牌貝克曼庫爾特劑型 規(guī)格 貯存成分

31、1:單克隆抗體液體（CD34 No. IM1871CD45-PC5Flow-Count熒光微球2：全血溶血試劑（Q-Prep）28 CIM2652A：甲酸B：碳酸鈉等C：多聚甲醛(Optilyse C 液體3:鞘液液體20L4:清洗液液體5L5：熒光微球液體1OML體體體體 液液液液7 3室溫 室溫 室溫2-8C (Flow-Check)儀器BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra操作-樣本制備：細胞膜表面抗原1. 首先準備所需的管，并在管上標記上欲加入的抗體。2. 首先每管中加入5ul CD45-PC5抗體。3. 然后，按管上的標記，加入相應抗體各10ul（注意

32、：必須是FITC和PE標 記的抗體搭配）4. 各管中加入標本（骨髄或外周血）30100ul（根據細胞的多少決定），振蕩混勻，室溫避光2030分鐘。5. 溶血：a. OptiLyse C（按說明書步驟溶血）b.使用COULTER QPREP制備系統開機一-顯示READY燈亮-一選擇35SEC燈亮一-開門-一放入試管 關門一-自動進行溶血一-顯示READY燈亮一-開門-一取出試管 -一再進行下一個樣品測定。（*溶血前確認A/B/C管路充滿并能打出液體）細胞漿和核抗原1. 準備所需的管，并在管上標記上欲加入的抗體，其中一管是同型對照。2. 首先每管中加入標本（骨髓或外周血）100ul（根據細胞的多少

33、決定）， 5ulCD45-PC5抗體。室溫避光20分鐘。3. 每管中加入固定液100ul,劇烈振蕩混勻，室溫避光15分鐘。4. 各管中加入PBS4ml o5. 300g離心5分鐘后，棄去上清液,振蕩混勻。（1500r/min*5min）6. 各管中加入透膜劑lOOul,輕輕混勻，室溫避光5分鐘。7. 加抗體，陰性對照管中加入10ul,其余各管加入相應抗體各10ul,室溫避光15分鐘。8. 各管中加入4mlPBS,振蕩混勻。9. 300g離心5分鐘后，棄去上清液。10. 各管中加入PBS500ul,振蕩混勻。11. 上機測樣報告結果（報告百分數操作性能精密度批內五次重復CV2%參考值CD34+5

34、%MP0+5%粒系20%淋系30%臨床意義用于血液病的診斷和分型診斷方案（Protocol）T細胞亞群細胞內因子IFN- Y /IL-4檢測方法流式細胞儀（BeckmanCoulter,貝克曼庫爾特）原理：直接免疫熒光法。肝素鈉抗凝全血在PMA, Ionomycin和Monensin存在丁短期 培養(yǎng)（輔助性T細胞通過細胞因子IFN-y. IL-4的產生分為Thl、Th2兩個亞 群。淋巴細胞活化以后才分泌細胞因子，且迅速分泌到細胞外。因此，利用刺 激劑PMA+Ionomycin體外激活淋巴細胞，然后用蛋白轉運抑制劑Monensin阻 止細胞因子分泌到細胞外，使細胞因子在細胞內滯留到一定的量），然

35、后進行 細胞膜表面抗原和細胞內細胞因子染色，使用流式細胞儀對CD4+細胞內的 IFN-Y和IL-4進行測定。標本采集與處理受檢者的準備檢查對象生活飲食處于日常狀態(tài)。采集部位靜脈采血抗凝劑肝素抗凝血要求 1.樣本量至少lmk2. 樣本應在采集后6小時內處理，冷凍的標本不能用。3. 樣本白細胞計數應在之間。若X1（T/L,樣本需要稀釋，用PBS稀釋；若X109/L,應分離單個核 細 胞。4. 溶血樣本不能用。試劑淋巴細胞培養(yǎng)體系(自配)成分：剌激素PMA、離子霉素、莫能霉素、小牛血清、1640液。 選白美國SIGMA公司。單克隆抗體(BeckmanCoulter公司)CD4-PC5. IL-4-P

36、E. IFN-Y -FITC。質控品BEKAMANCOULTER產品，未開瓶的試劑于2-8C保存，可在有效期內保 持穩(wěn)定，稀釋的試劑于2-81可穩(wěn)定2周；每天校準一次：遇特殊情 況隨時進行校準。儀器BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra操作：細胞培養(yǎng)與染色取200ul抗凝血加入10ul CD4-PC5單抗，室溫避光孵育30分鐘，RPMI1640 洗滌一次，將細胞加入培養(yǎng)體系中，5 % CO, 37工孵育18小時，取出后以PBS 洗一次。用專用細胞內因子試劑進行細胞固定、透膜。將細胞分成兩管，其一 為測定管加入10ul抗人IL-4-PE和IFN-Y-FITC,另一

37、管加入同型對照，室溫 避光20分鐘，PBS洗滌一次，待測。流式細胞儀測定打開流式細胞儀及氫激光光源(488nm)預熱20min,同時儀器自動初始化； 用標準熒光微球校正光路和流路，然后依次檢測標本，每份標本檢測50000以 上細胞，在前向散射光(FS)和測向散射光(SSC)散點圖中圈定淋巴細胞群，然 后分析CD4陽性細胞中IL-4-PE和IFN-Y-FITC的表達。淋巴細胞在FS / SSC散點圖中位置，即A門內細胞；A門內CD4陽性細胞，即B門內細胞； B門內TH細胞亞群分布：1區(qū)數值-一Th 1細胞(%)4區(qū)數值一-Th 2細胞(%)2區(qū)數值一-ThO細胞 (%)報告結果報告百分數操作性能

38、精密度批內五次重復CV2%正常參考值Thl(IFN-Y)： %Th2(IL-4)： %ThO : %臨床意義淋巴細胞均分泌多種細胞因子:Thl細胞主要分泌IL-2,IL-12,IFN-v和TNF-b /a等，Th2細胞主要分泌IL-4. IL-5. IL-6, IFM-Y為Thl最特異分泌的細 胞因子，IL-4為Th2最特異分泌的細胞因子，所以可根據分泌的細胞因子來 區(qū)分Thl與Th20 Thl為IFN-Y+, Th2為IL-4+。靜息狀態(tài)（人的正常生理狀 態(tài)、即未受到任何刺激下ThO分化為Thl和Th2的能力非常弱，在外周血中僅 含有極少量的Thl和Th2細胞，這時我們所能檢測的胞內的IFN

39、-Y和IL-4 也微乎其微。當Th細胞受到外界因素，如刺激素、病原體等刺激，其中ThO 即會向Thl或Th2大量分化，此時我們檢測到的IFN-y和IL-4也較多。本實 驗的檢測實際上是檢測Th細胞對刺激素刺激的反應能力。方案(Protocol)纟鄉(xiāng) liaFS UnOTFia logeoA0B01(K31 1 11 1 1 11 I 1 1 1 1 1 11 io1w*to1iceSS UnCDO心(ARND 司 FLZLoRFU Log一匕工石一IL9PE10?細胞周期分析方法流式細胞儀（BeckmanCoulter,貝克曼庫爾特）原理：利用特殊的熒光染料（PI、EB、A0等）與細胞內DNA

40、堿基結合，被熒光染料染 色的細胞在激光照射下發(fā)射出熒光，熒光強度與DNA含量成正比。流式細胞儀 通過測定細胞的熒光強度推算出細胞的DMA含量標本采集與處理檢測對象 實體（腫瘤）組織、灌洗液、石蠟塊、培養(yǎng)細胞 要求 1.實體（腫瘤）組織、灌洗液和培養(yǎng)細胞如果不能立即做應用 冷乙醇固定，一2（TC可保存2-3個月，一7CTC可保存半年以 上。2. 樣本計數應在x 107ml試劑品牌劑型規(guī)格貯存貝克曼庫爾特成分1： DNA-Prep試劑系統液體28C()(包括 DNA-Prep LPR 和DNA-Prep 染料） 室溫 室溫2：鞘液3：清洗液液體 液體20L5L4：熒光微球液體10ML2-8C (F

41、low-Check)儀器BeckmanCoulter EPICS XL/FC500/Altra樣本制備：灌洗液或培養(yǎng)細胞1. PBS洗，稀釋為X 107ml,取lOOul,加入DNA-Prep LPR 10秒后加入 DNA-Prep染料1ml,室溫避光15分鐘。2. 過300目濾網，上機檢測。實體（腫瘤）組織1. 單細胞懸液制備：將固定或新鮮的組織放在120目不銹鋼網上，下置一平 皿，用眼科剪刀將組織剪碎，用眼科輟子輕輕搓組織塊，邊搓邊用生理鹽 水沖洗，直至將組織搓完為止。（如果是淋巴瘤只需用生理鹽水沖即可）。 將平皿中的混懸液用300目銅網過濾去除細胞團塊，收集細胞懸液，以500 800轉離

42、心沉淀2分鐘。2. 染色：同上3.,上機檢測石蠟塊1. 脫蠟水化：石蠟塊切成50um厚，3-5片，放入二甲苯中室溫放置24小時, 更換二甲苯室溫再置24小時。取出加無水乙醇10分鐘，依次加95%乙醇、 70%乙醇、50%乙醇及雙蒸水各10分鐘。2. 單細胞懸液制備及染色：同上3. 上機檢測報告結果報告各期的百分數操作性能精密度批內五次重復CV 詔H|jiII丨 |3 Lillig III會切I Xl和卿聞Qm moi c 葉Z|Uri I C*3*:0g CcnwMn |zJ廠 $4*PCd* r QWWZBF r 9 ”?x?Q 伽 沖|woEaanxe;Jcoslr f$snrpe&:兀A

43、uPomet Sectionp r：r r0HectT!F$SSR.1DaXdPi旳“：Rin廠TheRetoaMeoPgrtimLn Leg PoN p rOF.FL1 IFL2ThvnrraRJZ&國 pORMNirreiarft |FS Lfi 3Crogl |Hcb弘988皿FSb-.SSLr ESLn巫 Rxu 由N G如 LMOfilF?fw actyjrng 0te|1CO/ut P (3 母 H- ir- -； IZ! ffi LJ 11J : |p r 0 |j J Il 廠41 II 1 X |LcmzJ 1功吉刁遼HJ F |S八 on x4r* ronMoilwpcl2A(X：H Az 土i RcaACEWt