輸血科操作規(guī)程

1、目 錄 1、輸血前檢測(cè)實(shí)驗(yàn)程序 2、改良低離子聚凝胺法實(shí)驗(yàn)操作規(guī)程 3、abo 血型鑒定 4、rh（d）血型鑒定 5、抗體篩選和鑒定試驗(yàn) 輸血前檢測(cè)實(shí)驗(yàn)程序1、實(shí)驗(yàn)要求 血清和血漿都可以用于交叉實(shí)驗(yàn)和抗體檢測(cè)，最好是血清標(biāo)本，標(biāo)本使用限制在 3 天內(nèi)，含有肝素等抗凝標(biāo)本可以用凝血酶或硫酸魚精蛋白處理使其凝集析出血清。允許通過(guò)靜脈輸液口采集標(biāo)本，但必須丟棄受殘留靜脈輸液影響的 5ml標(biāo)本。一般不允許使用溶血標(biāo)本，對(duì)急性溶血性貧血和燒傷病人的溶血標(biāo)本，在實(shí)驗(yàn)前后必須做溶血程度的比較。標(biāo)本和輸血申請(qǐng)單上的所有資料必須填寫清楚并完全符合，否則應(yīng)重抽標(biāo)本。對(duì)所有用過(guò)的獻(xiàn)血員和受血者標(biāo)本必須在 1-6冰箱

2、至少保存 7 天，所有實(shí)驗(yàn)都必須保證觀察和記錄同時(shí)進(jìn)行，且記錄和資料都必須至少保存 5 年。 2、血型檢測(cè) 要求完成病人 abo 正反定型、rh（d）。 3、交叉試驗(yàn) 3.1 受血者交叉配血時(shí)所用的標(biāo)本必須是輸血前 3 天之內(nèi)的。3.2 配血時(shí)要逐項(xiàng)核對(duì)輸血申請(qǐng)單、受血者和供血者血樣，復(fù)查受血者和供血者abo 血型（正、反定型），并常規(guī)檢查患者 rh（d）血型（急診搶救患者緊急輸血時(shí) rh（d）檢查除外），正確無(wú)誤時(shí)可進(jìn)行交叉配血。 3.3 凡是輸注全血、濃縮紅細(xì)胞、紅細(xì)胞懸液、洗滌紅細(xì)胞、冰凍紅細(xì)胞、濃縮紅細(xì)胞、手工分離濃縮血小板等患者，應(yīng)該進(jìn)行交叉配血試驗(yàn)。機(jī)器單采濃縮血小板、冷沉淀、新鮮

3、血漿應(yīng)與 abo 血型同型輸注。3.4 按全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程要求完成凝聚胺交叉試驗(yàn)和檢測(cè)不完全抗體的交叉試驗(yàn)（聚凝胺法、抗人球蛋白法） 。除緊急輸血和自身輸血外，所有輸入紅細(xì)胞的其他制品均要求做血交叉試驗(yàn)。 3.5 另外必須開(kāi)展的試驗(yàn)有抗人球蛋白試驗(yàn)，抗體篩選實(shí)驗(yàn)。 改良低離子聚凝胺法實(shí)驗(yàn)操作規(guī)程1、目的：減少交叉配血試驗(yàn)的假陽(yáng)性。 2、適用范圍：交叉配血、血型鑒定、抗體篩檢血型血清學(xué)試驗(yàn)。 3、試劑來(lái)源：(臺(tái)資)珠海貝索生物技術(shù)有限公司 4、采集與處理： 4.1 靜脈采血 3-4ml，并觀察是否溶血、乳糜血，如有此現(xiàn)象應(yīng)再留標(biāo)本并做記錄。 4.2 檢查留樣試管、標(biāo)簽、標(biāo)號(hào)、姓名、血型是否齊

4、全，如有遺漏應(yīng)拒收。 4.3 將血標(biāo)本試管放 37水浴中 10 分鐘，離心。 5、標(biāo)準(zhǔn)操作： 5.1 主（次）管加入受（供）血者血清 2 滴，加供（受）血者 4%紅細(xì)胞鹽水懸液 1 滴。 5.2 各管加 lim0.8ml，混勻，靜置 1 分鐘，各管加 polybrene reagent 1 滴，混勻，3000轉(zhuǎn)/分離心 15 秒，倒出上清液（殘留約 0.1ml），輕搖，肉眼可見(jiàn)明顯的凝集狀（如無(wú)凝集須重做），加假凝集清除液 1 滴于管底，輕搖，凝集 1 分鐘內(nèi)消失呈均勻混懸液，為陰性，凝集 1 分鐘內(nèi)不能被消除，即為陽(yáng)性。 5、 結(jié)論： 陽(yáng)性表示受（供）血者血清中含供（受）者紅細(xì)胞血型 ag

5、相應(yīng)的 ab（igg、igm），供受血者不相容，陰性表示供受血者相容。 6、 注意事項(xiàng)： 6.1 操作者須嚴(yán)格按照操作說(shuō)明進(jìn)行試驗(yàn)，紅細(xì)胞濃度、血清滴量、反應(yīng)時(shí)間、離心速度等均可影響試驗(yàn)結(jié)果。 6.2 若為弱凝集結(jié)果，本試劑盒按下述試驗(yàn)操作方法，還可進(jìn)一步提高試驗(yàn)靈敏度。試驗(yàn)操作方法如下： 6.2.1 檢測(cè)管中加試驗(yàn)血清 2 滴，4%紅細(xì)胞鹽水懸液 1 滴。 6.2.2 加 lim0.8ml，混勻，靜置 1 分鐘，各管加polybrene 2 滴混勻，3000 轉(zhuǎn)/分離心 15 秒，倒出上清液（殘留約 01ml） ，輕搖，肉眼可見(jiàn)明顯的凝集狀（如無(wú)凝集須重做） ，加假凝集清除液 1 滴于管底，

6、輕搖，凝集 1 分鐘內(nèi)消失呈均勻混懸液，為陰性，凝集1分鐘內(nèi)不能被消除，即為陽(yáng)性。 6.3 檢測(cè)標(biāo)本應(yīng)為非抗凝血，如標(biāo)本中含抗凝成分的含量過(guò)高明顯干擾凝集反應(yīng)，可適當(dāng)調(diào)加 promoter 的滴量，以中和抗凝成分的干擾。 6.4 試驗(yàn)溫度以 20-30為宜，若為寒冷凝集，37水浴5分鐘，在此溫下觀察，凝集消失，說(shuō)明冷凝集素存在。 6.5 肉眼直觀判斷的結(jié)果應(yīng)確保與顯微鏡下觀察結(jié)果一致，直觀不能明確判斷的可疑結(jié)果須鏡檢，鏡下：陰性結(jié)果應(yīng)該是單個(gè) rbc 均勻分布，有 rbc 凝集狀散在的即為弱陽(yáng)性。 6.6 試驗(yàn)質(zhì)量檢驗(yàn)：取自身血清與自身紅細(xì)胞用本試劑盒試驗(yàn)方法作自身陰性對(duì)照試驗(yàn)，取 igg 抗

7、 d 血清與 rhd（+）rbc 用本試劑盒試驗(yàn)方法作陽(yáng)性對(duì)照實(shí)驗(yàn)，對(duì)照實(shí)驗(yàn)符合，試劑有效。 6.7 疑難結(jié)果以抗人球蛋白實(shí)驗(yàn)（agt）作最終判斷試驗(yàn)，試驗(yàn)操作參照經(jīng)典agt（在agt中，加入本試劑盒中的lim0.8ml 37孵育時(shí)間可縮短至 10 分鐘）。 6.8 本試劑盒適宜大多數(shù)血型抗體的檢測(cè)，但對(duì) kell 血型系統(tǒng)抗體（主要存在白種人群）檢測(cè)效果較差，由于我國(guó)黃種人群中 kell 血型系統(tǒng)抗體陽(yáng)性者罕見(jiàn)，因此適合在國(guó)內(nèi)推廣。可補(bǔ)充抗人球蛋白試驗(yàn)，以提高對(duì) kell 血型系統(tǒng)抗體的檢出率。abo 血型鑒定1、測(cè)定原理 根據(jù)紅細(xì)胞上有或無(wú) a 抗原或和 b 抗原，將血型分為 a 型、b

8、型、ab 型及o 型 4 種?？衫眉t細(xì)胞凝集試驗(yàn)，通過(guò)正、反定型準(zhǔn)確鑒定 abo 血型。所謂正定型，是用已知抗a 和抗b 分型血清來(lái)測(cè)定紅細(xì)胞上有無(wú)相應(yīng)的 a 抗原或和 b 抗原；所謂反定型，是用已知 a 細(xì)胞和 b 細(xì)胞來(lái)測(cè)定血清中有無(wú)相應(yīng)的抗a或和抗b。 2、標(biāo)本種類及收集要求 2.1 受檢者血清； 2.2 枸緣酸鈉抗凝血或未稍取血，受檢者血液制成 5 紅細(xì)胞鹽水懸液使用。 2.3 標(biāo)本出現(xiàn)中度溶血者，為不合格標(biāo)本，不能用于檢測(cè)。 3、操作步驟 3.1、試管法 3.1.1 取潔凈小試管(內(nèi)徑 10mm60mm)3 支，分別標(biāo)明抗a、抗b 和抗a十 b，用滴管分別加抗a、抗b 和抗a 十

9、b 分型血清各 l 滴（約 50 ul）于試管底部，再以滴管分別加入受檢者 5紅細(xì)胞鹽水懸液 1 滴，混和。 3.1.2 另取潔凈小試管(內(nèi)徑 10mm60mm)3 支，分別標(biāo)明 a、b 和 o 細(xì)胞。用滴管分別加入受檢者血清 l 滴于試管底部，再分別以滴管加入 a、b和o型5試劑紅細(xì)胞懸 液 l 滴，混和。 3.1.3 立即以 1000rmin 離心 3 min。 3.1.4 將試管輕輕搖動(dòng)，使沉于管底的紅細(xì)胞浮起，先以內(nèi)眼觀察有無(wú)凝集(或溶血)現(xiàn)象。如內(nèi)眼不見(jiàn)凝集，應(yīng)將反應(yīng)物倒于玻片上，再以低倍鏡檢查。 3.1.5 觀察結(jié)果時(shí)既要看有無(wú)凝集，更要注意凝集強(qiáng)度，此有助于 a、b 亞型、類 b

10、 或 cisab 的發(fā)現(xiàn)。 3.1.6 凝集強(qiáng)度判斷標(biāo)準(zhǔn) 4+ 紅細(xì)胞凝集成一大塊，血清清晰透明。 3+ 紅細(xì)胞凝集成數(shù)小塊，血清尚清晰。 2+ 紅細(xì)胞凝塊分散成許多小塊，見(jiàn)到游離紅細(xì)胞。 1+ 肉眼可見(jiàn)大顆粒，周圍有較多游離紅細(xì)胞。 鏡下可見(jiàn)數(shù)個(gè)紅細(xì)胞凝集在一起，周圍有很多游離紅細(xì)胞。 mf 混合凝集外觀(mixed field)是指鏡下可見(jiàn)少數(shù)紅細(xì)胞凝集，而極大多數(shù)紅細(xì)胞仍呈分散分布。 - 表示陰性，鏡下未見(jiàn)凝集，紅細(xì)胞均勻分布。 3.2 玻片法 3.2.1 取清潔玻片 1 張(或白瓷板 1 塊)，用蠟筆劃成方格，標(biāo)明抗-a、抗-b和抗-a 十 b，分別用滴管滴加抗-a、抗-b 和抗-a

11、十 b 分型血清 l 滴于標(biāo)明的方格內(nèi)，再各加受檢者 2紅細(xì)胞懸液 1 滴，混和。 3.2.2 另取潔凈玻片一張(或白瓷板 1 塊)，用蠟筆劃成方格，標(biāo)明 a 細(xì)胞、b細(xì)胞和 o 細(xì)胞，用滴管各加受檢者血清 1 滴，再分別用滴管滴加 a、b和o型試劑紅細(xì)胞懸液 1 滴。 3.2.3 將玻片(或白瓷板)不斷輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)，使血清與細(xì)胞充分混勻，連續(xù)約 15 min，先以肉眼觀察有無(wú)凝集(或溶血)反應(yīng)；再在低倍鏡下觀察結(jié)果。 4、結(jié)果判定 abo 血型正反定型結(jié)果分型血清+受檢者紅細(xì)胞 受檢者血型 受檢者血清+試劑紅細(xì)胞抗-a 抗-b 抗-a 十 b a 細(xì)胞 b 細(xì)胞 o 細(xì)胞+ - + a - +

12、- + + b + - - - - o + + -+ + + ab - - - 注：+為凝集；-為不凝集。 5、注意事項(xiàng)： 5.1 分型血清必須為批批檢試劑，且在有效期內(nèi)使用；質(zhì)量性能符合要求。試劑開(kāi)封后必須貼上開(kāi)封日期、開(kāi)封人標(biāo)簽，用畢后應(yīng)放置冰箱保存，以免細(xì)菌污染。試劑開(kāi)封后有效期為一周。 5.2 試劑紅細(xì)胞以 3 個(gè)健康者同型新鮮紅細(xì)胞混和，用生理鹽水洗滌 1 次，以除卻存在于血清中的抗體及可溶性抗原?；蚴褂煤细竦纳唐吩\斷紅細(xì)胞。試劑紅細(xì)胞有效期：自制的為 15 天，商品的為試劑有效期。試劑開(kāi)封后必須貼上開(kāi)封日期、開(kāi)封人標(biāo)簽，用畢后應(yīng)放置冰箱保存，以免細(xì)菌污染。試劑開(kāi)封后有效期為一周。

13、5.3 生理鹽水啟用后，有效期為二周。 5.4 所有試劑在開(kāi)封或使用時(shí)，必須檢查是否有變質(zhì)；凡可疑者，必須更換新的試劑進(jìn)行檢測(cè)工作。 5.5 試管、滴管和玻片必須清潔干燥，防止溶血。 5.6 操作方法應(yīng)按規(guī)定，一般應(yīng)先加血清，然后再加紅細(xì)胞懸液，以便容易核實(shí)是否漏加血清。 5.7 按理 igm 抗-a 和抗-b 與相應(yīng)紅細(xì)胞的反應(yīng)溫度以 4為最強(qiáng)，但為了防止冷凝集現(xiàn)象的干擾，一般仍在室溫(2024)內(nèi)進(jìn)行試驗(yàn)，37可使反應(yīng)減弱。 5.8 離心時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短，速度不宜過(guò)快或過(guò)慢，以防假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果。 5.9 觀察時(shí)應(yīng)注意紅細(xì)胞呈特異性凝集、繼發(fā)性凝固以及緡錢狀排列的區(qū)別。 5.10 判斷

14、結(jié)果后應(yīng)仔細(xì)核對(duì)、記錄，避免筆誤。 5.11 對(duì)于可能存在不完全抗原的時(shí)候，應(yīng)在各反應(yīng)方加入凝聚胺試劑，以檢驗(yàn)不完全抗原的存在。 512 對(duì)于可疑結(jié)果，必須更換所用的試劑，重新檢測(cè)。 5.13 5%紅細(xì)胞懸液的配制：用生理鹽水洗滌紅細(xì)胞 3 次。根據(jù)下表進(jìn)行紅細(xì)胞懸液的配制 懸液濃度（%） 壓積紅細(xì)胞（滴） 鹽水（滴）2 1 2ml(40)5 1 0.8ml(16)rh（d）血型鑒定1、實(shí)驗(yàn)原理 紅細(xì)胞與抗 d 抗體發(fā)生凝集反應(yīng)表明該細(xì)胞有 d 抗原，反之，無(wú)凝集現(xiàn)象表明試驗(yàn)的紅細(xì)胞缺少正常強(qiáng)度的 d 抗原。 2、標(biāo)本收集和制備 無(wú)菌操作收集血液標(biāo)本,收集后盡可能立即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。如果不能立即實(shí)驗(yàn)

15、,應(yīng)將樣品貯存于 2-8。收集在 acd、cpd、cpd2a 液中的血液標(biāo)本,不超過(guò) 21天仍可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，但是加 edta、肝素和凝集的血液標(biāo)本，實(shí)驗(yàn)應(yīng)在 2 天內(nèi)進(jìn)行。 3、儀器、試劑、校準(zhǔn)品、質(zhì)控品、培養(yǎng)基、以及其他所需物品： rhd(igm)血型定型試劑（單克隆抗體）：上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司，產(chǎn)品注冊(cè)號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字 s20060018,包裝、規(guī)格：每盒內(nèi)裝有 1 支試劑，10ml/支，儲(chǔ)存要求：存放 28，有效期內(nèi)使用。 4、操作步驟 4.1 玻片法：4.1.1 干凈玻片上加 1 滴抗 d。 4.1.2 再加入1滴4%-5%的被檢紅細(xì)胞懸液。該紅細(xì)胞懸液可以是鹽水懸液，也可以是懸浮于

16、自身血漿或血清中的紅細(xì)胞。 4.1.3 在圓形的玻片區(qū)域中混勻，前后緩慢搖晃玻片。2 分鐘左右肉眼判讀結(jié)果。不要將試劑的干燥與凝集相混淆。 4.1.4 如果是陰性，需要試管法重做一遍實(shí)驗(yàn)。 4.2 鹽水試管法 4.2.1 加一滴抗 d 試劑于預(yù)先標(biāo)記好的試管中 4.2.2 再加 1 滴約 3%5%紅細(xì)胞生理鹽水懸液于試管中。混勻。 4.2.3 離心，速度和時(shí)間可選擇以下二種之一： 轉(zhuǎn)速 1000rpm，時(shí)間1 分鐘或 3400rpm，時(shí)間 15 秒。 4.2.4 檢查是否溶血（溶血可能是陽(yáng)性結(jié)果，或者是細(xì)菌污染） ，然后輕輕搖晃，使細(xì)胞再懸浮起來(lái)。 4.2.5 觀察凝集狀況，并立即記錄結(jié)果。必

17、要時(shí)可借助顯微鏡。 4.2.6 若是陰性結(jié)果，需在 37孵育 15 分鐘-30 分鐘，然后再離心觀察結(jié)果。結(jié)果若呈陰性需進(jìn)一步確認(rèn)是否是弱 d。 5、參考值范圍 陽(yáng)性反應(yīng)：出現(xiàn)紅細(xì)胞凝集，為 rhd 陽(yáng)性。 陰性反應(yīng)：紅細(xì)胞不出現(xiàn)凝集，為 rhd 陰性。 6、 方法的局限性 本實(shí)驗(yàn)不能凝集categorydvi細(xì)胞，對(duì)于陰性和弱陽(yáng)性結(jié)果，按有關(guān)安全輸血規(guī)范進(jìn)行確認(rèn)實(shí)驗(yàn)，必要時(shí)送血型參比實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行確認(rèn)。 7、注意事項(xiàng)7.1 試劑含有 0.1%w/v 疊氮鈉，如果攝入會(huì)中毒。 7.2 試劑如出現(xiàn)混濁則不能使用，若開(kāi)瓶使用時(shí)間較長(zhǎng)后，最好用已知 rhd 陰性、rhd 陽(yáng)性紅細(xì)胞檢查結(jié)果是否符合，以防

18、制品污染、變質(zhì)失效，而造成錯(cuò)誤。及時(shí)貼上開(kāi)封時(shí)間標(biāo)簽，在效期內(nèi)使用。 7.3 由于人紅細(xì)胞的 d 抗原往往表現(xiàn)較弱，故必要時(shí)進(jìn)行顯微鏡鏡檢，以免錯(cuò)判結(jié)果，特別是陰性結(jié)果時(shí)。 7.4 rh 血型鑒定應(yīng)嚴(yán)格控制溫度與時(shí)間，因 rh 抗原、抗體及反應(yīng)凝塊比較脆弱，觀察反應(yīng)結(jié)果時(shí)，應(yīng)輕輕側(cè)動(dòng)試管，不可用力振搖。 7.5 對(duì)于結(jié)果可疑的，必須洗滌紅細(xì)胞后重新檢驗(yàn)。 抗體篩選和鑒定試驗(yàn)1、 原理 紅細(xì)胞血型抗體分子的物理特性與血清學(xué)的反應(yīng)性之間有著直接的關(guān)系。可分為 igm和 igg球蛋白抗體 igm 為天然抗體，在鹽水介質(zhì)中能直接凝集相應(yīng)的紅細(xì)胞，使之發(fā)生肉眼可見(jiàn)的凝集反應(yīng)。 igg為免疫抗體，常經(jīng)妊娠或輸血等免疫產(chǎn)生。在鹽水介質(zhì)中不能凝集而只能致敏抗原的紅細(xì)胞，且必須通過(guò)特定的方法使致敏紅細(xì)胞發(fā)生凝集。如牛血清白蛋白、酶、抗球蛋白、凝聚胺、凝膠（或玻璃）等方法。 2、 方法 待檢血清需要使用多種方法進(jìn)行鑒定。一般使用鹽水法、酶方法、抗球蛋白法、凝聚胺法或凝膠卡法檢測(cè)抗體。在檢測(cè)到弱抗體時(shí)，可以利用適當(dāng)增加血清的細(xì)胞比例、適當(dāng)增加孵育時(shí)間、加入低離子強(qiáng)度溶液增效劑或 peg 聚氧乙烯乙二醇等方法增加反應(yīng)的敏感性。不同的抗體在不同的方法和條件下可以有不同的表現(xiàn)。這些特性為判定抗體特異性提供了參考信息。 3、 試劑 3.1、 紅細(xì)胞：選