p53基因突變的檢測方法及臨床應(yīng)用

1、綜述與進展 文章編號 : 1001 2764x ( 2008 ) 03 20224203中圖分類號 : q754文獻標(biāo)識碼 : ap53基因突變的檢測方法及臨床應(yīng)用 3周衛(wèi)平 1 綜述 ,王惠民 2 ,賈春平 3 審校 ( 1. 通州市人民醫(yī)院檢驗科 ,江蘇南通 226300; 2. 南通大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗科 ,江蘇南 通 226001; 3. 中國科學(xué)院上海微系統(tǒng)與信息技術(shù)研究所 ,上海 200050 )關(guān)鍵詞 : p53基因 ;基因突變 ;腫瘤p53 基因與通常的抑癌基因不同 ,突變后具有癌基因作用 1 。它是迄今為止發(fā)現(xiàn)的與人類腫瘤相關(guān)性最高的基因 。 最初的研究 發(fā) 現(xiàn) , p53 突

2、變 后 其 表 達 的 核 蛋 白 功 能 喪 失 與l i2f raum en綜i 合征 (l fs) 相關(guān) 。l fs是一種家族性疾病 , 以 高發(fā)多種新生物為特征 。此病在有橫紋肌肉瘤家族史的兒 童中首次發(fā)現(xiàn) ,家族其他成員也高發(fā)乳腺癌 、腦癌 、骨肉瘤和 淋巴瘤等疾病 。這些患者在基因種系第 17 號染色體上常丟 失一個 p53 等位基因 ,并且在存留的等位基因上仍有一個點 突變 。p53基因敲除小鼠在出生時基本正常 ,但經(jīng)過短的潛 伏期后 ,易于發(fā)生各種各樣的腫瘤 2 ?，F(xiàn)查明 , p53 基因的 缺失和突變與腫瘤的發(fā)生 、發(fā)展及預(yù)后等密切相關(guān) 。人類 p53位于 17 p13 ,全

3、長 1620 kb,含有 11個外顯子 和 10個內(nèi)含子 ,分為野生型 、突變型及介于兩者之間的雜合 狀態(tài)等 3種類型 3 。野生型 p53轉(zhuǎn)錄 2. 8 kb的 mrna ,基因 編碼 393個氨基酸和 1 個分子量 53 000 的核內(nèi)磷質(zhì)蛋白 。 p53以四聚體的形式存在體內(nèi) ,有 4個主要功能區(qū) : n 端酸 性轉(zhuǎn)錄激活區(qū) ; 序列特異性結(jié)合區(qū) (核心區(qū) ) ; 寡聚區(qū) ; 羧基端區(qū) 。最常見的 p53突變?yōu)辄c突變 ,而點突變最常見的是單個 堿基替換 。p53 結(jié) 構(gòu) 上 有 5 個 進 化 上 的 高 度 保 守 區(qū) , 多 數(shù)p53基因突變是發(fā)生在這些保守區(qū)內(nèi)的 5 8 外顯子上

4、4 。 由于 p53 基因突變是人類多種惡性腫瘤最常見的基因改變 , 約有 50%以上的腫瘤患者發(fā)現(xiàn)有 p53突變 。因此如何準(zhǔn)確 、 快速 、方便地檢測 p53基因突變 ,對于確定腫瘤的病因 、判斷 預(yù)后以及治療方案的制定具有十分重要的意義 。1 p53基因未知點突變的檢測1. 1 傳統(tǒng)篩查法 核糖核酸酶切法 : 5 該法簡單 ,但需要特 異性探針 ,且只能檢測約 70 %的突變以及不能確定突變的準(zhǔn) 確 位 置 ?；?學(xué) 錯 配 裂 解 法 ( chem ica l m ism a tch c leavage, cmc) : 6 理論上 ,當(dāng)野生型和突變型同時被 標(biāo)記時可檢測100%的突變

5、,該法是目前檢測 dna 片段范圍最大的方法 。 但不能確定突變的具體位置 及性質(zhì) , 加之所 用化學(xué)物質(zhì)有 毒 ,以及對 1 /3的 t / g錯配堿基缺乏修飾活性 ,限制了該法 應(yīng)用 。變性梯度凝膠電泳 ( dena tu ring grad ien t ge l e lec trop ho2 ro sis, d gge) 7 : d gge同樣只能確定突變的存在 ,不能進行 突變位置和性質(zhì)的定量 。 pcr 2單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析法 ( sin2 gle2stranded confo rm a tion po lymo rp h ism , pcr 2sscp ) : 適 合 基 層單位大

6、批量樣本及未知的基因突變點檢測 。但同樣不能確定突變的具體位置及性質(zhì) 。 pcr 產(chǎn)物在 150200 bp 片段最合適 ,檢出率可達 90 % , 若超過 300 bp , 其敏感度隨 pcr 產(chǎn)物的長度增加而下降 。毛細管電泳 ( cap lilla ry e lec trop ho re2 sis, ce) 8 :完成一次電泳僅需幾十分鐘 ,電泳過程可用檢測 器自動采集數(shù)據(jù) ,無須染色 、照相 ,且具進樣量少等優(yōu)點 ,但 該法不能進行突變位置和性質(zhì)的測定 ,另外儀器投入費用和 耗材較貴 ,應(yīng)用受到限制 。1. 2 變性高效液相色譜 ( dena tu ring h igh p e rfo

7、 rm ance liqu id ch rom a tograp hy, dh plc) 原理是基于解鏈的和部分解鏈的 雙鏈 dna 在部分失活條件下具有不同的性質(zhì) 。由于雜合子 個體的 dna 經(jīng)擴增產(chǎn)生異源雙鏈 ,與完全匹配的同源雙鏈 的解鏈特征不同 ,在部分加熱變性下 ,異源雙鏈 dna 分子更 容易解鏈形成 y形結(jié)構(gòu) ,與固定相的結(jié)合能力下降 。當(dāng)流動 相中濃度加大時 ,異源雙鏈將先于同源雙鏈被洗脫下來 ,帶 有突變序列的樣品呈現(xiàn)出異源雙鏈與同源雙鏈混合的峰形 特征 ,而不含突變序列樣品只有同源雙鏈的峰形 。由此可檢 測出含有單個堿基的置換 、插入或缺失等突變 9 。 eva等依 據(jù)此

8、方法利用 wav etm dna 分析系統(tǒng) ,對乳腺癌 、卵巢癌等 p53突變進行了檢測 10 。dh plc 是一種快 速 、準(zhǔn)確的檢測方法 。但該法只能提供個體有無突變的信息 ,無法得出突變類型 。當(dāng)有多個片段需要檢測時 ,由于有多個解鏈溫度 ,需 要多步檢測 ,從而增加了工作強度 。1. 3 酵母中分離的等位基因功能分析技術(shù) ( func tiona l ana ly2 sis of sep a ra ted a lle le s in yea st , fa sa y) 其原理主要是基于 絕大多數(shù)的 p53 突變都會造成 p53 蛋白轉(zhuǎn)錄激活功能的喪 失 ,是一種在 rna 水平上檢測

9、 p53 突變的酵母基因工程技 術(shù) 。 fa sa y使用一個內(nèi)源 a de2 基因缺陷的釀酒酵母菌株 yig397,在它的染色體上整合了一個含有 p53 蛋白的結(jié)合位 點 ( r gc序 列 ) , r gc 啟 動 控 制 了 下 游 一 個 可 以 表 達 正 常 ad e2的報告 基 因 , 當(dāng) 轉(zhuǎn) 入 從 腫 瘤 組 織 樣 本 中 得 到 的 p53 cdna r t2pcr 產(chǎn)物和帶有缺口的酵母表達載體時 ,因為線 性表達載體含有 p53 cdna 上編碼 67 到 346 位氨基酸的缺 口 ,留有 p53 cdna 上編碼 1 266 和 347 2393 位氨基酸的同源 區(qū)

10、,從而 可以與 r t2pcr 產(chǎn)物的兩端同源序列發(fā)生同源 重 組 ,產(chǎn)生缺口修復(fù)的表達載體 。若該表達載體表達轉(zhuǎn)錄功能 正常的 p53蛋白 ,就會與宿主菌株染色體上的特異性序列結(jié) 合 ,激活下游報告基團 ad e2 的表達 , 從而在選擇性培養(yǎng)基 平板上形成白色大菌落 ,反之形成紅色小菌落 。通過紅色 /3基金項目 :國家 863 課題 ( 2006aa03 z334 ) ,南通市社會發(fā)展計劃 (指導(dǎo)性 )項目 ( s7926 ) 。作者簡介 :周衛(wèi)平 , 1973 年生 ,男 ,主管技師 ,在職碩士研究生 ,主要從事分子生物學(xué)方面的研究 。通訊作者 :王惠民 ,男 ,主任技師 , e2m

11、a il: n tfyjyykp ub. n t. jsinfo. ne t。225臨床檢驗雜志 2008年第 26卷第 3期 ch ine se jou rna l of c lin ica l l abo ra to ry sc ience, 2008 , vo l126, no13白色菌落的比例判斷 p53 基因的狀況 11212 。 fa sa y優(yōu)點是既能檢測 p53突變又能評價 p53 的轉(zhuǎn)錄激活功能 ,但亦存在 操作繁瑣 ,有時測定存在一定的紅色背景 。限制了其廣泛應(yīng)用 。2. 3 dna 直接測序法 ( d irec t sequenc ing , d s) 指用不對稱pcr

12、直接獲得測序單鏈 ,進行直接的序列分析而無須克隆到 測序載體上 ,一般采用 sange r的末端終止法 。由于四色熒光標(biāo)記的自動化測序儀的研制成功和運用 ,使得測序效率大大提高 ,同時也克服了同位素危害人體的缺點 。能確定突變的 部位及性質(zhì) ,是所有檢測方法中最靈敏的一種 ?？勺鳛橥蛔儥z測和診斷的參考方法 。但相比而言該法依然存在繁瑣 、費用高 、不能大批量篩查 、不適合臨床等缺點 。3 表達產(chǎn)物 ( p53蛋白 )檢測人體各種正常細胞中都有低含量的 p53 蛋白 ,這些低含 量的 p53蛋白容易水解 ,并且半衰期很短 ,僅 10 20 m in左右 ,一般難以檢測 。在生長旺盛的細胞中其含量

13、可增加 4 倍以上 ,而在轉(zhuǎn)化細胞或腫瘤細胞中 ,其含量可增加 100 倍以 上 ,且由于 p53基因突變導(dǎo)致的 p53 蛋白氨基酸序列或構(gòu)型發(fā)生變化 ,以及其他未知因素 ,導(dǎo)致 p53 蛋白不易水解 ,半衰期較長 ,在腫瘤細胞中堆積 。因此可以通過對 p53 蛋白的檢 測進行腫瘤的診斷和個體化治療方案的制定 。3. 1 免疫組織化學(xué)法 ( imm unoh ischem ica l sta in ing) 該法原理是應(yīng)用特異性抗體與 p53 蛋白產(chǎn)生抗原抗體反應(yīng) ,通過 一定的顯色方法后 ,根據(jù)顯色斑點的有無和強弱判斷 p53 蛋白的存在 ,從而間接判斷 p53基因點突變是否存在 。該法傳

14、統(tǒng) ,應(yīng)用較廣 ,但存在不同切片中組織塊的抗原修復(fù) 、抗體濃 度 、孵育溫度及時間等不同 ,造成不同批次染色的差異 ,進而導(dǎo)致判讀的不便 ,尚可能導(dǎo)致假陽性和假陰性的錯誤發(fā)生 。 另外不能大批量篩查樣本和術(shù)后動態(tài)觀察 。3. 2 組織微陣列技術(shù) ( tissue m ic roa rray) 又稱組織芯片 是隨著芯片技術(shù)發(fā)展而來的一種方法 ?？稍谝粡埐Ｆ嫌貌?同的方法一次性完成幾百乃至幾千的臨床組織樣本的基因表達產(chǎn)物的分析 ,可快捷 、經(jīng)濟 、大規(guī)模地篩查組織中基因結(jié) 構(gòu)的改變和表達的異常 。具有高通量 、微型化 、自動化 、成本 低 、防污染并可節(jié)約寶貴的病理標(biāo)本資源 。但組織芯片中的 少

15、量組織能否代表腫瘤全貌是仍需考慮的主要問題 。3. 3 流式細胞術(shù) ( flow cytom e try techn ique, fcm ) 首先將新 鮮腫瘤組織制成細胞數(shù)為 1 106 /m l的懸液 ,然后用抗 p53單克隆抗體對細胞進行免疫熒光染色 ,再通過流式細胞儀檢 測熒光 ,熒光強弱間接反映 p53 蛋白的濃度 。因需要昂貴的流式細胞儀 ,應(yīng)用受到限制 。3. 4 酶聯(lián)免疫吸附試驗 ( el isa ) 雙抗體夾心 el isa 法檢 測血清 p53 蛋白的基本原理是抗原抗體的特異性反應(yīng) ,洗脫掉未結(jié)合的部分 ,再通過最后的顯色來定性或半定量 p53 蛋 白 。具有較好的敏感性 、

16、重復(fù)性和穩(wěn)定性 ,但部分非癌癥患 者存在高滴度的抗 p53 抗體干擾 ,有特異性差 、容易出現(xiàn)假陽性和操作繁瑣等缺點 。4 p53檢測的臨床應(yīng)用4. 1 通過對基因及表達產(chǎn)物的檢測 ,可以對腫瘤作出早期 診斷和預(yù)測 。因為有的腫瘤患者在腫瘤發(fā)生時 、甚至腫瘤發(fā) 生之前就可能檢測到 p53 基因突變 。另外單獨以及聯(lián)合檢測其他標(biāo)志物可對腫瘤的發(fā)生 、發(fā)展 、預(yù)后及轉(zhuǎn)移作出預(yù)測 和判斷 。4. 2 近年來的研究表明 , p53基因的表達也影響腫瘤對放化( h igh re so lu tion m e lt, hrm ) 是國外1. 4 高分辨率熔解新近發(fā)展起來的 sn p及突變檢測工具 。此法不

17、受突變堿基位點和類型的限制 。其原理為不同的 dna 分子具有不同的 解鏈溫度 。根據(jù)解鏈溫度曲線與標(biāo)準(zhǔn)曲線的對照 ,判斷是否存在突變 。其方法為在作 pcr 前加入熒光染料 (一般為 lcgreen ) , 與 反 應(yīng) buffe r、引 物 、dn tp、酶 、模 板 等 混 合 。 lc green染料飽和加入且對 pcr 不會有任何抑制作用 ,擴增過 程中 lc green嵌入到 dna 雙鏈中 , pcr 結(jié)束后根據(jù)儀器的不同 ,選擇直接運行高分辨率熔解或轉(zhuǎn)入專作高分辨率熔解 的儀器 。隨著 dna 的解鏈 , lc green不斷釋放出來 ,此時儀器的光學(xué)檢測系統(tǒng)采集密集的熒光信號

18、變化并繪制熔解曲 線 ,根據(jù)曲線準(zhǔn)確區(qū)分野生型 、雜合突變 、純和突變 。m ichae l 等 13 采用此法通過 ro to r2gene6000儀對卵巢癌 、乳腺癌組織p53的外顯子 58進行了測定 ,并對可疑曲線樣本進行了測 序 ,證實了突變的存在 。顯示此法是一種簡單和快速的篩查 p53突變的高效技術(shù) 。該技術(shù)對儀器的要求較高 ,要求每個點在 0. 10. 3的溫度密度 ,很少有儀器能達到 ,限制了其應(yīng) 用 。另外此法只能檢測出突變 ,不能測出具體位置和類型 。2 已知點突變的 p53基因檢測2. 1 pcr 2限制性片段長度多態(tài)性分析法 ( re stric ted fragm e

19、n t length po lymo rp h ism , r fl p) 基本原理是特定的限制性核酸內(nèi)切酶具有識別并剪切特定的 dna 序列位點的能力 ,因此 特定的 dna 被限制性內(nèi)切酶水解后的片段長度發(fā)生變化 , 通過瓊脂糖凝膠電泳可反映 dna 特定區(qū)域的結(jié)構(gòu)改變 ,如點突變 、缺失 、插入和重排等 。 pcr 與 r fl p的聯(lián)合應(yīng)用 ,簡 化和加快了分析的過程 ,促進了該法的廣泛使用 。其優(yōu)點是操作簡便 ,僅為 pcr 加上限制酶 ;復(fù)現(xiàn)性良好 ,可檢出 1個堿 基之突變 。缺點是不能檢出 1 個堿基以外的突變 ,如需檢測 幾個堿基 ,則要由幾個檢測系統(tǒng)分別檢測 。另外相鄰并同

20、時 發(fā)生的點突變無法用此法檢測 。2. 2 寡核苷酸芯片技術(shù) ( o ligonuc leo tide m ic roa rray, om )是基因芯片技術(shù)的一種 14 。om 技術(shù)用于檢測基因突變的 基本原理是在玻璃 、硅等載體上 ,根據(jù)檢測需要 ,設(shè)計 、固定多個特異的寡核苷酸探針 。而后將大量經(jīng) pcr 擴增 , 體外轉(zhuǎn)錄等技術(shù)摻入熒光標(biāo)記分子的待測 dna 與之雜交 ,若兩 者存在至少一個堿基的差異時 ,即可產(chǎn)生雜交結(jié)果即熒光信 號值的差異 。以此來判斷待測樣品與芯片上的哪一個探針完全配對 。即可得出待測樣品特定位點的堿基序列 。從而 判斷是否存在突變及突變位點和 類型 。該法具 有

21、準(zhǔn) 確 、快速 、高效 和 高 通 量 地 分 析 生 物 基 因 信 息 的 優(yōu) 點 。m e red ith 等 15 利用 a ffym e trix公司的商品化的基因芯片對乳腺癌患 者的 p53 的外顯子 5 8 成功地進行了檢測 ,并發(fā)現(xiàn)了以前文獻未報道的新的 179、195、196 213、217、249、254、278、281 和 298突變位點 。a rthe r等 16 在對馬兜鈴酸和巴爾干腎病 的研究中采用 amp lich ip p53芯片對其外顯子 2 11 進行檢測 ,發(fā)現(xiàn) 19個堿 基 置 換 , 突 變 有 89%是 發(fā) 生 在 a t對 上 。78 %是 a t

22、ta 顛換 。該檢測需要昂貴的激光或 ccd 攝 像頭掃描儀讀取數(shù)據(jù) ,計算機圖像處理系統(tǒng)進行數(shù)據(jù)分析 ,療的敏感性 。p53基因可通過促進凋亡基因 bax和抑制凋亡基因 bc l22的轉(zhuǎn)錄 , 以增強腫瘤細胞對放化療的敏感性 17 。 p53除了具有抑制細胞周期進展 ,促進凋亡多種功能 ,甚至還 可能抑制 血 管 形 成 。而 多 種 抗 癌 化 療 藥 物 都 是 通 過 損 傷 dna 進而促發(fā)凋亡來達到治療效應(yīng)的 。故而 p53 功能滅活 不僅提示預(yù)后不良 ,還可導(dǎo)致對凋亡的抵抗 18219 。因此 ,對 p53的研究和檢測對臨床腫瘤個體化治療具有指導(dǎo)作用 。4. 3 通過對 p53

23、的研究 , 產(chǎn)生腫瘤治療新思路 在腫瘤 治療中誘導(dǎo)凋亡 。其方法為 導(dǎo)入野生型 p53,抑制腫瘤增 生 。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 p53基因動物模型已構(gòu)建成功 ,重組腺病毒 介導(dǎo)的 p53基因治療惡性腫瘤已廣泛開展 。 下調(diào)突變型p53、bc1 22的活性與表達 ,減弱其對細胞凋亡的抑制 。 抑癌基因引入瘤細胞 ,降低致瘤性 , 使腫瘤細胞逆轉(zhuǎn)為正常細 胞 。 引入某些細胞因子 ,抑制腫瘤惡性表型 ,使細胞喪失 致瘤性 。 應(yīng)用點突變技術(shù) ,使異常表達癌基因失活或修復(fù) 突變基因 。p53除了與腫瘤檢測和治療關(guān)系密切外 ,現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)其與 衰老亦有關(guān)系 。p53過度表達會引起細胞衰老 ,但具體分子 信號途徑尚不

24、清楚 。相信隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和對 p53 更 深入的研究 ,人類對 p53會有一個更為全新的認識 。 參考文獻 : 1 e liyahu d , dm icha lovitz d , e liyahu s, et a l. w ild2typ e p53 can inh ib it oncogene2m ed ia ted focu s fo rm a tion j . p roc n a t i a cad sc i u sa ,1989 , 86 ( 22 ) : 8763 28767. 2 donehowe r l a , h a rvey m , slagle b , et a l.

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