高效液相色譜分析.ppt

1、LOGO 基本概念與特點基本概念與特點 概念：高效液相色譜法(HPLC)是在20世紀60年代末，以經(jīng) 典液相色譜為基礎(chǔ)，引入了氣相色譜的理論，在技術(shù)上采 用了高效固定相、高壓輸液系統(tǒng)和高靈敏度的在線檢測器， 從而發(fā)展起來的一種新型分離分析技術(shù)。隨著科學和技術(shù) 的不斷改進與發(fā)展，目前已成為應(yīng)用極為重要、廣泛的分 離分析手段. 特點特點：分離效率高、：分離效率高、分析速度快分析速度快、應(yīng)用范圍廣應(yīng)用范圍廣、操作自動操作自動 化化。 2 液相色譜流程與原理 基本原理：混合組分的樣品在色譜柱中，各組分由于在流 動相和固定相之間溶解、吸附、滲透或離子交換等作用力 的不同，隨流動相在色譜柱中運行時，在兩相

2、間進行反復(fù) 多次分配過程，使得原來分配系數(shù)具有微小區(qū)別的各組分 ，產(chǎn)生了保留能力明顯差異的效果，進而各組分在柱中的 移動速度不同，經(jīng)過一定長度的色譜柱，彼此分離開來， 最后按一定順序流出。 3 色譜圖及相關(guān)名詞色譜圖及相關(guān)名詞 （一）色譜流出曲線色譜圖 色譜圖色譜圖是色譜柱流出物通過檢測器所產(chǎn)生的響應(yīng)信號對時間 或液體流出體積的曲線 。 色譜流出曲線色譜流出曲線是色譜基本參數(shù)的源流，而色譜基本參數(shù)又是 用來觀察色譜行為和研究色譜理論的重要指標。另外，還可 以直接利用色譜圖峰位置點（特征保留值）進行定性，根據(jù) 曲線上測得的峰高或峰面積進行定量。 4 （二）柱效能 色譜柱在色譜分離中由動力學因素所

3、決定的柱效能，通常 用塔板高度或塔板數(shù)表示。 塔板數(shù)： 塔板高度： 5 渦流擴散相渦流擴散相 分子擴散相分子擴散相 流動相線速度流動相線速度 傳質(zhì)阻力相傳質(zhì)阻力相 （三）分離度R 6 分離度的表達式：分離度的表達式： (2)(1) (2)(1) (2)(1) 1/2(2)1/2(1) 2() 2() 1.699() RR bb RR tt R WW tt YY tR(2), tR(1): 組分組分2和組分和組分1的保留時間的保留時間 Wb(2), Wb(1): 組分組分2和組分和組分1的峰底寬度的峰底寬度 7 R=1.5 完全分離完全分離 高效液相色譜系統(tǒng) （一） 高效液相色譜儀結(jié)構(gòu)流程 8

4、高壓泵高壓泵 色譜柱色譜柱 廢液廢液 檢測器檢測器 進樣器進樣器 儲液瓶儲液瓶 高壓輸液泵、高效分離柱、高靈敏度檢測器高壓輸液泵、高效分離柱、高靈敏度檢測器 （二） 高壓輸液系統(tǒng)（高壓泵） 高壓輸液泵是核心部件，要求：密封性好，輸出流量恒定， 壓力平穩(wěn)，可調(diào)范圍寬，便于迅速更換溶劑及耐腐蝕等。 高壓泵主要有恒流泵（往復(fù)泵）和恒壓泵（氣動泵）兩種。 恒流泵特點輸出流量保持恒定而與色譜柱引起阻力變化無 關(guān)。分為機械注射泵和機械往復(fù)泵(常用)兩種。 恒壓泵特點能保持輸出壓力恒定，但其流量則隨色譜系統(tǒng) 阻力而變化，故保留時間的重視性差。 9 10 電動機 偏心輪 柱塞 柱 球形單向閥 溶劑 圖10-7

5、 柱塞往復(fù)泵示意圖 （三）色譜柱 色譜柱是高效液相色譜分離過程的核心。一支穩(wěn)定、高效的 色譜柱對建立適用性強、重現(xiàn)性好的分析方法是必不可少的。 1.擔體 高效液相色譜的柱填料有離子交換樹脂、凝膠，較多的使用 硅膠微粒作為擔體。以下為幾種常用的微粒類型： (1) (1) 全多孔型擔體：全多孔型擔體：屬于顆粒均勻的多孔球體，很好的兼顧 了效能、樣品荷載量、耐久性等理想的性質(zhì)，所以最為常用。 (2) (2) 表層多孔型擔體（薄殼型微珠擔體）：表層多孔型擔體（薄殼型微珠擔體）： 它是直徑為 30 40 m 的實心核 ( 玻璃微珠 ) ，優(yōu)點優(yōu)點 是：是：孔穴淺（固定相僅為表面的一薄層），傳質(zhì)速度快，易

6、 于填充均勻，柱效高。這種擔體目前應(yīng)用較為普遍。 11 2.色譜柱 柱體為直型不銹鋼管，標準內(nèi)經(jīng)為4.6或3.9 mm，柱長1530 cm，填料 顆粒粒度510m。發(fā)展趨勢是減小填料粒度(35m)和柱經(jīng)以提高 柱效。 12 為保護色譜柱，為保護色譜柱， 通常在柱前加一支填料與色譜柱相同的保護柱。通常在柱前加一支填料與色譜柱相同的保護柱。 3.固定相 選擇固定相的一般標準還是以“相似相容”原理為基礎(chǔ)。 如果溶質(zhì)溶于烴類溶劑，表明是低極性化合物，這樣就可 以選擇非極性或亞極性固定相。 若樣品溶于極性溫和溶劑中，如醇類，則可選擇極性固定 相，也可以選擇非極性固定相。 13 4.流動相 14 液相色譜

7、的流動相又稱為淋洗液，洗脫劑。液相色譜的流動相又稱為淋洗液，洗脫劑。 流動相組成、極性改變，可顯著改變組分分離狀況，流動相組成、極性改變，可顯著改變組分分離狀況， 改變流動相的組成和極性（組成比例）是提高分離改變流動相的組成和極性（組成比例）是提高分離 度的有效手段度的有效手段。 常用溶劑：常用溶劑： 環(huán)己烷、己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸環(huán)己烷、己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸 乙酯、甲醇乙酯、甲醇 、乙腈、水等。、乙腈、水等。 15 正相液相色譜正相液相色譜 （正相柱）（正相柱） 固定相極性固定相極性 流動相極性流動相極性 反相液相色譜反相液相色譜 （反相柱）（反相柱） 固定相極性固定相極性 流動相

8、極性流動相極性 組分極性越大，保留組分極性越大，保留 時間越長；使用極性時間越長；使用極性 化合物的分離。化合物的分離。 組分極性越小，保留組分極性越小，保留 時間越長；適用非極時間越長；適用非極 性化合物的分離。性化合物的分離。 16 選擇流動相時應(yīng)注意的問題選擇流動相時應(yīng)注意的問題 1 1、盡量使用高純度試劑作流動相，防止微量雜質(zhì)、盡量使用高純度試劑作流動相，防止微量雜質(zhì) 長期累積損壞色譜柱和使檢測器噪聲增加。長期累積損壞色譜柱和使檢測器噪聲增加。 2 2、避免流動相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或、避免流動相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或 損壞柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶劑破壞損壞柱子

9、。如使固定液溶解流失；酸性溶劑破壞 氧化鋁固定相等。氧化鋁固定相等。 17 3 3、試樣在流動相中應(yīng)有適宜的溶解度，防止、試樣在流動相中應(yīng)有適宜的溶解度，防止 產(chǎn)生沉淀并在柱中沉積。產(chǎn)生沉淀并在柱中沉積。 4 4、流動相同時還應(yīng)滿足檢測器的要求。當使用、流動相同時還應(yīng)滿足檢測器的要求。當使用 紫外檢測器時，流動相不應(yīng)有紫外吸收。紫外檢測器時，流動相不應(yīng)有紫外吸收。 （四）檢測器 （一）、紫外檢測器（一）、紫外檢測器應(yīng)用最廣泛的檢測器應(yīng)用最廣泛的檢測器 18 基本原理：基本原理：試樣組分對特定波長的紫外光具有選擇試樣組分對特定波長的紫外光具有選擇 性的吸收，吸光度與試樣組分濃度之間的定量關(guān)系性的

10、吸收，吸光度與試樣組分濃度之間的定量關(guān)系 符合郎伯符合郎伯- -比耳定律。比耳定律。 優(yōu)點：優(yōu)點： 靈敏度高，線形范圍寬；靈敏度高，線形范圍寬； 死體積小；死體積??； 波長可選；波長可選； 對流速和溫度變化不對流速和溫度變化不 敏感；敏感； 可用于梯度洗脫?？捎糜谔荻认疵摗?缺點：缺點： 無紫外無紫外- -可見吸收組分不響應(yīng)；可見吸收組分不響應(yīng)； 流動相選擇受一定限制。流動相選擇受一定限制。 19 (a) 可變波長紫外檢測器可變波長紫外檢測器 (b) 二極管陣列檢測器二極管陣列檢測器 （二）、示差折光檢測器（二）、示差折光檢測器通用型檢測器通用型檢測器 20 每種物質(zhì)具有不同的折光指數(shù)每種物質(zhì)

11、具有不同的折光指數(shù)。 基本原理：基本原理：連續(xù)檢測參比池和樣品池中流動相之間連續(xù)檢測參比池和樣品池中流動相之間 的折光系數(shù)差值，該值與試樣池流動相中的組分濃的折光系數(shù)差值，該值與試樣池流動相中的組分濃 度成正比。度成正比。 生命科學中各類糖類化合物，沒有紫外吸收，生命科學中各類糖類化合物，沒有紫外吸收， 一般要用示差折光檢測器。一般要用示差折光檢測器。 21 缺點：缺點： 靈敏度低；靈敏度低； 對溫度敏感；對溫度敏感； 不能用于梯度洗脫。不能用于梯度洗脫。 （三）、熒光檢測器專用型檢測器 22 基本原理：基本原理：在一定的條件下，熒光強度與流動相中在一定的條件下，熒光強度與流動相中 的組分的濃

12、度成之比。的組分的濃度成之比。 對多環(huán)芳烴，維生素對多環(huán)芳烴，維生素B B、黃曲霉素、卟啉類化合物、黃曲霉素、卟啉類化合物、 農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類化合物等有響應(yīng)。農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類化合物等有響應(yīng)。 23 特點：特點： 高靈敏度；高靈敏度； 高選擇性；高選擇性； 可用于梯度洗脫?？捎糜谔荻认疵?。 定性與定量 （一）樣品預(yù)處理 1.固體樣品 固體樣品首先要進行均質(zhì)化，然后再采用如蒸餾、超臨 界萃取或超聲波萃取等技術(shù)進行樣品制備。 2.液體樣品 （二）定性與定量 參閱氣相色譜的定性與定量方法。 24 液-液萃取 固相萃取 凝膠過濾色譜 氣相色譜與高效液相色譜的比較 25 氣相色譜氣相色譜 高效液相色譜高效液相色譜 1.1.只能分析揮發(fā)性物質(zhì)，只能分析只能分析揮發(fā)性物質(zhì)，只能分析 20%20%的化合物的化合物 2.2.不能用于熱不穩(wěn)定物質(zhì)的分析不能用于熱不穩(wěn)定物質(zhì)的分析 3.3.用毛細管色譜可得到很高的柱效用毛細管色譜可得到很高的柱效 4.4.有很靈敏的檢測器如有很靈敏的檢測器如ECDECD和較靈和較靈 敏的通用檢測器（敏的通用檢測器（FIDFID和和TCDTCD） 5.5.流動相為氣體，無毒，易于處理流動相為氣體，無毒，易于處理 6.6.運行和操作容易運行和操作容易 7.7.