11DNA組技術(shù)基本工具ppt課件

1、大俠 11 DNA重組技術(shù)的基本工具重組技術(shù)的基本工具 gene engineering 大俠大俠 基因拼接的理論基礎(chǔ)基因拼接的理論基礎(chǔ) vDNA是生物的主要遺傳物質(zhì)是生物的主要遺傳物質(zhì) vDNA的基本組成單位都是四種脫氧核苷酸的基本組成單位都是四種脫氧核苷酸 v雙鏈雙鏈DNA分子的空間結(jié)構(gòu)都是規(guī)則的雙螺旋分子的空間結(jié)構(gòu)都是規(guī)則的雙螺旋 結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu) 大俠大俠 外源基因在受體內(nèi)表達(dá)的理論基礎(chǔ)外源基因在受體內(nèi)表達(dá)的理論基礎(chǔ) v基因是控制生物性狀的獨(dú)立遺傳單位基因是控制生物性狀的獨(dú)立遺傳單位 v遺傳信息的傳遞都遵循中心法則闡述的信息遺傳信息的傳遞都遵循中心法則闡述的信息 流動方向流動方向 v生物界共用

2、一套遺傳密碼生物界共用一套遺傳密碼 大俠大俠 v基因拼接技術(shù)、基因拼接技術(shù)、 DNADNA重組技術(shù)重組技術(shù) v按照人們的愿望，進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計(jì)，并通過按照人們的愿望，進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計(jì)，并通過 體外體外DNADNA重組和轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物以新重組和轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物以新 的遺傳特性，從而創(chuàng)造出人類所需要的新的的遺傳特性，從而創(chuàng)造出人類所需要的新的 生物類型和生物產(chǎn)品。生物類型和生物產(chǎn)品。 v是在是在DNADNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)和施工的。分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)和施工的。 v定向地改變生物的遺傳性狀定向地改變生物的遺傳性狀 大俠大俠 v分子手術(shù)刀分子手術(shù)刀 v限制性核酸內(nèi)切酶限制酶）限制性核酸內(nèi)切

3、酶限制酶） v分子縫合針分子縫合針 vDNADNA連接酶連接酶 v分子運(yùn)輸車分子運(yùn)輸車 v基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體 大俠大俠 v識別雙鏈識別雙鏈DNADNA 分子的某種特分子的某種特 定核苷酸序列定核苷酸序列 大俠大俠 v作用機(jī)制作用機(jī)制: : 水解水解DNADNA分子的磷酸二酯鍵分子的磷酸二酯鍵 v概念概念: :生物體內(nèi)的一種酶，能將外來的生物體內(nèi)的一種酶，能將外來的DNADNA切切 斷，即能夠限制異源斷，即能夠限制異源DNADNA的侵入并使之失去活的侵入并使之失去活 力，但對自己的力，但對自己的DNADNA卻無損害作用，可以保護(hù)卻無損害作用，可以保護(hù) 原有的遺傳信息。原

4、有的遺傳信息。 切割作用是在切割作用是在DNADNA分子內(nèi)分子內(nèi) 部進(jìn)行的，故名限制性內(nèi)切酶。部進(jìn)行的，故名限制性內(nèi)切酶。 v分布：主要存在于微生物原核生物中，分布：主要存在于微生物原核生物中， 已從近已從近300300種不同微生物中分離出了約種不同微生物中分離出了約40004000種種 限制酶限制酶 大俠大俠 黏性末端黏性末端 G C T T A A A A T T C G G A A T T C C T T A A G 大多數(shù)限制酶識別的序列由大多數(shù)限制酶識別的序列由6 6個(gè)核苷酸組成，也有識個(gè)核苷酸組成，也有識 別別4 4、5 5或或8 8個(gè)核苷酸個(gè)核苷酸 中軸線中軸線 EcoR 大俠大

5、俠 平平(頭頭)末端末端 C C C G G G G G G C C C C C C G G G G G G C C C Sma 中軸線兩側(cè)中軸線兩側(cè) 的的DNADNA上的堿上的堿 基是反向?qū)欠聪驅(qū)?稱重復(fù)排列稱重復(fù)排列 的的 大俠大俠 將將2 2條條DNADNA片段連接成新的片段連接成新的DNADNA分子，恢復(fù)被限分子，恢復(fù)被限 制酶切開的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵制酶切開的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵 Ecoli DNAEcoli DNA連接酶連接酶 來源：來源：T4T4噬菌體噬菌體 連接黏性末端和平末端效率低）連接黏性末端和平末端效率低） 來源：大腸桿菌來源：大腸桿菌 作用特點(diǎn)：只連接

6、黏性末端作用特點(diǎn)：只連接黏性末端 T4DNAT4DNA連接酶連接酶 大俠大俠 Ecoli DNAEcoli DNA連接酶連接酶 T4DNAT4DNA連接酶連接酶 G C T T A A A A T T C G G A A T T C C T T A A G 大俠大俠 T4DNA連接酶連接酶 C C C G G G G G G C C C C C C G G G G G G C C C 大俠大俠 v作用作用 v作為運(yùn)載工具，將目的基因轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞作為運(yùn)載工具，將目的基因轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞 中去；中去； v利用它在宿主細(xì)胞內(nèi)對目的基因進(jìn)行大量的利用它在宿主細(xì)胞內(nèi)對目的基因進(jìn)行大量的 復(fù)制克?。?fù)制克

7、?。?v類型類型 v細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)的質(zhì)粒細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)的質(zhì)粒 v 噬菌體的衍生物噬菌體的衍生物 v動植物病毒動植物病毒 大俠大俠 v能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定地保存；能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定地保存； v有一至多個(gè)限制酶切點(diǎn)，而每種酶的切點(diǎn)最好只有有一至多個(gè)限制酶切點(diǎn)，而每種酶的切點(diǎn)最好只有 一個(gè)，以便與目的基因連接；一個(gè)，以便與目的基因連接； v有一定的標(biāo)記基因，便于進(jìn)行篩選有一定的標(biāo)記基因，便于進(jìn)行篩選 v必須是安全的對受體細(xì)胞無害，不選用霍亂弧菌必須是安全的對受體細(xì)胞無害，不選用霍亂弧菌 的質(zhì)粒）的質(zhì)粒） v天然存在的質(zhì)粒天然存在的質(zhì)粒DNADNA分子并不完全具備上述條件，分子并不完全具備上述條

8、件， 需人工改造需人工改造 v限制酶切割位點(diǎn)所處的位置必須是在所需的標(biāo)記基限制酶切割位點(diǎn)所處的位置必須是在所需的標(biāo)記基 因之外，這樣才能保證標(biāo)記基因的完整性，有利于對因之外，這樣才能保證標(biāo)記基因的完整性，有利于對 目的基因的檢測目的基因的檢測 大俠大俠 v裸露的、結(jié)構(gòu)簡單、裸露的、結(jié)構(gòu)簡單、 獨(dú)立于細(xì)菌染色體獨(dú)立于細(xì)菌染色體 擬核外，具有自擬核外，具有自 主復(fù)制能力的雙鏈環(huán)主復(fù)制能力的雙鏈環(huán) 狀狀DNADNA分子。分子。 v攜帶外源攜帶外源DNADNA片段的片段的 質(zhì)粒進(jìn)入受體細(xì)胞后，質(zhì)粒進(jìn)入受體細(xì)胞后， 停留在細(xì)胞中進(jìn)行自停留在細(xì)胞中進(jìn)行自 我復(fù)制，或整合到染我復(fù)制，或整合到染 色體色體DN

9、ADNA上，隨染色體上，隨染色體 DNADNA進(jìn)行同步復(fù)制。進(jìn)行同步復(fù)制。 大俠大俠 大俠大俠 G C C T A G G A T C C G G G A T C C C C T A G G 酶酶 大俠大俠 G A T C C T A G 酶酶 C T A G G A T C 大俠大俠 G C C T A G G A T C C G 酶酶 C T A G G A T C 酶酶 大俠大俠 P7-2 聯(lián)系你已有的知識，想一想，為什么細(xì)聯(lián)系你已有的知識，想一想，為什么細(xì) 菌中限制酶不剪切細(xì)菌本身的菌中限制酶不剪切細(xì)菌本身的DNA？ v提示：迄今為止，基因工程中使用的限制酶絕大部提示：迄今為止，基因工

10、程中使用的限制酶絕大部 分都是從細(xì)菌或霉菌中提取出來的，它們各自可以識分都是從細(xì)菌或霉菌中提取出來的，它們各自可以識 別和切斷別和切斷DNADNA上特定的堿基序列。上特定的堿基序列。 v細(xì)菌中限制酶之所以不切斷自身細(xì)菌中限制酶之所以不切斷自身DNADNA，是因?yàn)槲⑸?，是因?yàn)槲⑸?物在長期的進(jìn)化過程中形成了一套完善的防御機(jī)制，物在長期的進(jìn)化過程中形成了一套完善的防御機(jī)制， 對于外源入侵的對于外源入侵的DNADNA可以降解掉。生物在長期演化過可以降解掉。生物在長期演化過 程中，含有某種限制酶的細(xì)胞，其程中，含有某種限制酶的細(xì)胞，其DNADNA分子中或者不分子中或者不 具備這種限制酶的識別切割序列，

11、或者通過甲基化酶具備這種限制酶的識別切割序列，或者通過甲基化酶 將甲基轉(zhuǎn)移到所識別序列的堿基上，使限制酶不能將將甲基轉(zhuǎn)移到所識別序列的堿基上，使限制酶不能將 其切開。這樣，盡管細(xì)菌中含有某種限制酶也不會使其切開。這樣，盡管細(xì)菌中含有某種限制酶也不會使 自身的自身的DNADNA被切斷，并且可以防止外源被切斷，并且可以防止外源DNADNA的入侵的入侵 大俠大俠 P73 天然的天然的DNA分子可以直接用做基因工分子可以直接用做基因工 程載體嗎？為什么？程載體嗎？為什么？ v不是，作為基因工程使用的載體必需滿足以下條件。不是，作為基因工程使用的載體必需滿足以下條件。 v載體載體DNADNA必需有一個(gè)或

12、多個(gè)限制酶的切割位點(diǎn)，以便目的基必需有一個(gè)或多個(gè)限制酶的切割位點(diǎn)，以便目的基 因可以插入到載體上去。這些供目的基因插入的限制酶的切點(diǎn)因可以插入到載體上去。這些供目的基因插入的限制酶的切點(diǎn) 所處的位置，還必須是在質(zhì)粒本身需要的基因片段之外，這樣所處的位置，還必須是在質(zhì)粒本身需要的基因片段之外，這樣 才不至于因目的基因的插入而失活。才不至于因目的基因的插入而失活。 v載體載體DNADNA必需具備自我復(fù)制的能力，或整合到受體染色體必需具備自我復(fù)制的能力，或整合到受體染色體DNADNA 上隨染色體上隨染色體DNADNA的復(fù)制而同步復(fù)制。的復(fù)制而同步復(fù)制。 v載體載體DNADNA必需帶有標(biāo)記基因，以便重

13、組后進(jìn)行重組子的篩選。必需帶有標(biāo)記基因，以便重組后進(jìn)行重組子的篩選。 v載體載體DNADNA必需是安全的，不會對受體細(xì)胞有害，或不能進(jìn)入必需是安全的，不會對受體細(xì)胞有害，或不能進(jìn)入 到除受體細(xì)胞外的其他生物細(xì)胞中去。到除受體細(xì)胞外的其他生物細(xì)胞中去。 v載體載體DNADNA分子大小應(yīng)適合，以便提取和在體外進(jìn)行操作，太分子大小應(yīng)適合，以便提取和在體外進(jìn)行操作，太 大就不便操作。大就不便操作。 v實(shí)際上自然存在的質(zhì)粒實(shí)際上自然存在的質(zhì)粒DNADNA分子并不完全具備上述條件，都分子并不完全具備上述條件，都 要進(jìn)行人工改造后才能用于基因工程操作。要進(jìn)行人工改造后才能用于基因工程操作。 大俠大俠 P7-

14、4 DNA連接酶有連接單鏈連接酶有連接單鏈DNA的本領(lǐng)嗎？的本領(lǐng)嗎？ v提示：迄今為止，所發(fā)現(xiàn)的提示：迄今為止，所發(fā)現(xiàn)的DNA連接酶都不連接酶都不 具有連接單鏈具有連接單鏈DNA的能力，至于原因，現(xiàn)在的能力，至于原因，現(xiàn)在 還不清楚，也許將來會發(fā)現(xiàn)可以連接單鏈還不清楚，也許將來會發(fā)現(xiàn)可以連接單鏈 DNA的酶。的酶。 大俠大俠 P4尋根問底尋根問底 v1.根據(jù)你所掌握的知識，你能分析出限制酶根據(jù)你所掌握的知識，你能分析出限制酶 存在于原核生物中的作用是什么嗎？存在于原核生物中的作用是什么嗎？ v提示：原核生物容易受到自然界外源提示：原核生物容易受到自然界外源DNA的的 入侵，但是，生物在長期的進(jìn)

15、化過程中形成入侵，但是，生物在長期的進(jìn)化過程中形成 了一套完善的防御機(jī)制，以防止外來病原物了一套完善的防御機(jī)制，以防止外來病原物 的侵害。限制酶就是細(xì)菌的一種防御性工具，的侵害。限制酶就是細(xì)菌的一種防御性工具， 當(dāng)外源當(dāng)外源DNA侵入時(shí)，會利用限制酶將外源侵入時(shí)，會利用限制酶將外源 DNA切割掉，以保證自身的安全。所以，限切割掉，以保證自身的安全。所以，限 制酶在原核生物中主要起到切割外源制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、 使之失效，從而達(dá)到保護(hù)自身的目的。使之失效，從而達(dá)到保護(hù)自身的目的。 v. 大俠大俠 P4尋根問底：尋根問底： DNA連接酶與連接酶與DNA聚合酶聚合酶 是一回事嗎？

16、為什么？是一回事嗎？為什么？ v答：不是一回事。基因工程中所用的連接酶蛋白答：不是一回事。基因工程中所用的連接酶蛋白 酶有兩種：酶有兩種：Ecoli連接酶和連接酶和T4連接酶。這兩種連接連接酶。這兩種連接 酶催化反應(yīng)基本相同，都是連接雙鏈酶催化反應(yīng)基本相同，都是連接雙鏈DNA的缺口，而的缺口，而 不能連接單鏈不能連接單鏈DNA。DNA連接酶和連接酶和DNA聚合酶都是聚合酶都是 形成磷酸二酯鍵在相鄰核苷酸的形成磷酸二酯鍵在相鄰核苷酸的3位碳原子上的羥位碳原子上的羥 基與基與5位碳原子上所連磷酸基團(tuán)的羥基之間形成），位碳原子上所連磷酸基團(tuán)的羥基之間形成）， 那么，二者的差別主要表現(xiàn)在什么地方呢？那

17、么，二者的差別主要表現(xiàn)在什么地方呢？ v（1DNA聚合酶只能將單個(gè)核苷酸加到已有的核酸聚合酶只能將單個(gè)核苷酸加到已有的核酸 片段的片段的3末端的羥基上，形成磷酸二酯鍵；而末端的羥基上，形成磷酸二酯鍵；而DNA連連 接酶是在兩個(gè)接酶是在兩個(gè)DNA片段之間形成磷酸二酯鍵，不是在片段之間形成磷酸二酯鍵，不是在 單個(gè)核苷酸與單個(gè)核苷酸與DNA片段之間形成磷酸二酯鍵。片段之間形成磷酸二酯鍵。 v（2DNA聚合酶是以一條聚合酶是以一條DNA鏈為模板，將單個(gè)鏈為模板，將單個(gè) 核苷酸通過磷酸二酯鍵形成一條與模板鏈互補(bǔ)的核苷酸通過磷酸二酯鍵形成一條與模板鏈互補(bǔ)的DNA 鏈；而鏈；而DNA連接酶是將連接酶是將DNA雙鏈上的兩個(gè)缺口同時(shí)連雙鏈上的兩個(gè)缺口同時(shí)連 接起來。因此接起來。因此DNA連接酶不需要模板。連接酶不需要模板。 大俠大俠 P7模擬制作模擬制作 v（三模擬制作討論題（三模擬制作討論題 v1. 你模擬插入的你模擬插入的DNA片段能稱得上一個(gè)基因嗎？片段能稱得上一個(gè)基因嗎？ v提示：不能。因?yàn)橐话慊蛴猩锨€(gè)堿基對。