細菌的分布與消毒滅菌

1、實驗三 細菌的分布與消毒滅菌【目的】了解細菌廣泛分布于自然界及正常人體，樹立“有菌觀念”，從而認識無菌操作對于微生物學(xué)及醫(yī)學(xué)實踐的重要性。 了解正常人體中寄居著種類繁多的細菌，正常情況下不引起人類疾病，稱為正常菌群。 熟悉外界因素對細菌的影響，學(xué)習(xí)常用的消毒滅菌方法。了解不同細菌對外界因素具有不同的抵抗力。一、細菌的分布檢查（一）空氣中的細菌檢查【材料】普通瓊脂平板培養(yǎng)基。 【方法】 取普通瓊脂平板一只開啟皿蓋，培養(yǎng)基面向上放于實驗桌上，暴露530min后蓋好。 置37培養(yǎng)1824小時后觀察結(jié)果?！窘Y(jié)果】（填表10-1） 平板培養(yǎng)基表面或多或少有菌落生長。 （二）地面水中的細菌檢查【材料】 地

2、面水(河水、井水或池水)、高層瓊脂培養(yǎng)基、1ml無菌吸管、滅菌培養(yǎng)皿。 【方法】 以無菌吸管吸取1ml地面水，加入滅菌平皿中。 將已溶化且冷至45左右的高層瓊脂傾注人上述平皿中，加蓋后輕輕搖動，使水與瓊脂充分混勻，靜凝。37 24小時后取出觀察，計數(shù)菌落?！窘Y(jié)果】（填表10-1）（三）衣服、票證、頭發(fā)、手指皮膚上的細菌檢查【材料】普通瓊脂平板培養(yǎng)基?！痉椒ā咳∑胀ㄆ桨逡粋€，用蠟筆在平板背面玻璃上劃成四等分，并貼上標(biāo)簽(圖10-1)。然后以無菌操作法，用衣袖角、票證、頭發(fā)及手指或指甲內(nèi)污物，在平板培養(yǎng)基表面相應(yīng)部位輕輕涂抹，置37培養(yǎng)24小時，觀察并記錄結(jié)果?！窘Y(jié)果】填表培養(yǎng)基表面涂抹處有菌落生

3、長。 衣服、票證、頭發(fā)、手指皮膚上的細菌檢查 （四）正常人體咽喉部的細菌檢查 【材料】 血液瓊脂平板培養(yǎng)基、滅菌棉拭、接種環(huán)、酒精燈。 【方法】 取滅菌棉拭一支，在被檢查者咽喉部輕輕涂擦后，再涂于血液瓊脂培養(yǎng)基側(cè)，然后改用滅菌接種環(huán)作分離劃線接種。蓋上皿蓋，37孵育24小時（或者采用咳喋法）?！窘Y(jié)果】（填表10-1）瓊脂平板表面有菌落生長。其中占優(yōu)勢的是一種細小菌落，其周圍有草綠色的不完全溶血環(huán)。此為咽喉部的正常菌群甲型鏈球菌。（五）實驗結(jié)果觀察(填表) 細菌分布的實驗結(jié)果檢查材料空氣水衣角票證頭發(fā)手指咽喉部細菌生長情況菌落個數(shù)實驗體會 二、消毒滅菌試驗 （一）煮沸與高壓滅菌法【原理】 高溫對

4、細菌有明顯的致死作用，主要機制是凝固菌體蛋白質(zhì)，也可能與細菌dna單螺旋斷裂、細菌細胞膜功能受損及菌體內(nèi)電解質(zhì)濃縮有關(guān)。濕熱滅菌法所需溫度比干熱法為低，時間較短。尤其是高壓蒸氣滅菌，因增加壓力而提高沸點，滅菌效果最佳。有芽胞的細菌由于對熱的抵抗力比無芽胞細菌強，所以只有采用高壓蒸氣滅菌法才能將芽胞徹底殺滅。【材料】瓊脂平板兩塊、肉湯管兩支、大腸埃希菌和枯草芽胞桿菌肉湯培養(yǎng)物?！痉椒ā?取瓊脂平板兩塊，用記號筆分別在二平板底部玻面上，注明大腸埃希菌和枯草芽胞桿菌，并分別將二塊平板底玻璃面劃分三等份，于每塊平板的三等份上分別注明對照、加熱100 10min及加熱121 20min。 取肉湯管二支，

5、分別注明加熱100 l0min及加熱121 20min，用毛細吸管吸取大腸埃希菌肉湯培養(yǎng)物，于上述二支肉湯管中各加入菌液一滴。混勻，再用接種環(huán)于二支肉湯管的任何一管中取一環(huán)菌液接種于大腸埃希菌平板的對照處，然后分別將肉湯管加熱100 l0min及加熱121 20min(高壓蒸氣15磅、20min)，再各取一接種環(huán)分別接種于平板的相應(yīng)部位?？莶菅堪麠U菌以同法試驗。將二塊瓊脂平板接種物置37培養(yǎng)24小時，比較培養(yǎng)基上二種細菌的生長情況?！窘Y(jié)果觀察】（填表10-2）表10-2 煮沸和高壓滅菌實驗結(jié)果細菌名稱100 10分鐘121 20分鐘未加熱(對照)枯草芽胞桿菌大腸埃希菌結(jié)果分析（二）紫外線殺菌法

6、【原理】波長265266nm的紫外線因與dna吸收光譜-致而有明顯的殺菌作用。其機制是使細菌dna相鄰的胸腺嘧啶形成二聚體，從而破壞dna構(gòu)型，干擾其正常復(fù)制，導(dǎo)致細菌死亡。紫外線殺菌力雖強，但穿透力弱，故只能用于實驗室、病房或手術(shù)室內(nèi)空氣及物體表面的消毒滅菌。另外，殺菌波長的紫外線對人體皮膚、眼睛等有損傷作用，應(yīng)注意防護?！静牧稀看竽c埃希菌培養(yǎng)物、瓊脂平板、接種環(huán)、酒精燈、紫外線燈?！痉椒ā恳詼缇臃N環(huán)挑取大腸埃希菌培養(yǎng)物，于瓊脂平板上作來回密集劃線接種。半啟皿蓋(將皿蓋遮住涂面的12)，置于紫外線燈下lm以內(nèi)接受照射30分鐘。蓋上皿蓋，于37培養(yǎng)24小時后觀察結(jié)果。 【結(jié)果觀察】（填空）

7、平板上用黑紙遮蓋部分 菌生長，未遮蓋部分 菌生長。這說明紫外線具有 作用，但 力弱。（三）化學(xué)消毒法1、皮膚消毒試驗【原理】乙醇可使菌體蛋白脫水凝固或與菌體蛋白、酶蛋白等結(jié)合而使之變性失活。7075 乙醇在1530秒即將細菌殺死。但95的乙醇消毒效果反不如7075為好，因高濃度乙醇使菌體蛋白表面迅速凝固，影響乙醇繼續(xù)進入菌體內(nèi)發(fā)揮作用。2.5的碘酒可使菌體酶蛋白中的硫氫基(-sh)改變，使酶失去活性，導(dǎo)致機能障礙而死亡?！静牧稀科胀ō傊桨逡粋€、2.5碘酒、75乙醇?！痉椒ā咳∑胀ō傊桨逡粋€，用蠟筆在平板背面玻璃上劃成五等分，并貼上標(biāo)簽；兩人用手在培養(yǎng)基上各涂一格，然后用2.5碘酒、75乙醇

8、消毒手指后再各涂另一格，留一格作對照，蓋好平板，置37溫箱中培養(yǎng)24小時觀察結(jié)果。【結(jié)果】（填表） 皮膚消毒試驗結(jié)果37 24h培養(yǎng)細菌生長情況結(jié)果解釋消毒前手指皮膚消毒后手指皮膚對照(不接種)2、 化學(xué)消毒劑對細菌的影響【原理】有些化學(xué)藥品濃度高時能殺滅病原微生物，稱為化學(xué)消毒劑；濃度低時能抑制細菌生長，稱為防腐劑。由于化學(xué)消毒劑對人體細胞往往具有毒性作用，故只能外用。不同細菌對不同的化學(xué)消毒劑具有不同的敏感性?！静牧稀?龍膽紫、2碘酒、2紅汞、1:1000新潔爾滅、無菌濾紙片、葡萄球菌培養(yǎng)液、大腸埃希菌培養(yǎng)液、瓊脂平板、無齒小鑷子。【方法】取瓊脂平板兩塊，分別在其底部注明葡萄球菌及大腸埃希

9、菌。同時將每塊平皿底部玻璃面劃分4等分，并分別標(biāo)明龍膽紫、碘酒、紅汞、新潔爾滅。(操作方法與藥敏試驗相似)三、抗生素的抗菌試驗(藥敏試驗，紙片法)【原理】抗生素主要是指某些微生物(大多數(shù)為放線菌和真菌、極少數(shù)為細菌)在生長繁殖過程中產(chǎn)生的一種合成代謝產(chǎn)物。此種有機化合物具有抗生物作用，能抑制或殺滅某些生物細胞，主要是一些微生物和腫瘤細胞。一種抗生素只對一定種類的生物細胞具有選擇性拮抗作用，這種作用范圍稱為抗菌譜?？股氐目咕囼?藥敏試驗)是指在體外測定藥物抑制或殺死細菌能力的試驗?！静牧稀拷瘘S色葡萄球菌、大腸埃希菌、瓊脂平板培養(yǎng)基。抗生素紙片(青、鏈、氯、慶大霉素、磺胺等)、尖頭鑷子、酒精燈

10、、接種環(huán)?！痉椒ā咳…傊桨迮囵B(yǎng)基二塊，于其底部玻璃上用標(biāo)簽紙注明本人所接種的菌株名稱（或?qū)⑵桨宓撞恳韵灩P劃為六等分，分別在靠近邊緣處注明青、鏈、氯、慶大等字樣）。以滅菌接種環(huán)挑取菌液，在培養(yǎng)基表面作密集劃線接種。將鑷子火焰滅菌，待冷后再取各藥物紙片，分別牢貼于種有細菌的平板培養(yǎng)基表面相應(yīng)位置，每次貼片后鑷子均應(yīng)經(jīng)火焰燒灼滅菌。每張紙片間距不少于24mm，紙片中心距平皿邊緣不少于15mm，并分別作好標(biāo)記。 在直徑90mm的平板上均勻擺放藥敏紙片的樣板37孵育1824h后，分別測量各紙片抑菌環(huán)直徑(包括紙片在內(nèi))(mm)，抑菌環(huán)的邊緣以肉眼見不到細菌明顯生長為限。判定其敏感度?！窘Y(jié)果觀察記錄】填

11、表。藥物敏感試驗結(jié)果判斷參考標(biāo)準(zhǔn)：抗菌藥物抑 菌 圈 直 徑（mm）耐藥中度敏感敏感青霉素鏈霉素其它抗生素101010101210141015131516敏感：表示常規(guī)劑量的藥物在體內(nèi)所達到的濃度能抑制或殺滅待測菌；中度敏感：指提高測定藥物的劑量或在該藥物濃集部位，細菌生長可被抑制；耐藥：表示常規(guī)劑量的藥物在體內(nèi)所達到的濃度不能抑制或殺滅待測菌。 藥物敏感試驗(紙片擴散法)結(jié)果抗生素大腸埃希菌金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑(cm)敏感度抑菌圈直徑(cm)敏感度青霉素紅霉素慶大霉素先鋒霉素氯霉素四、口腔內(nèi)微生物檢查（口腔專業(yè)） 【方法】滴一滴墨汁于潔凈玻片的一端； 用牙簽取齒間牙垢少許在墨汁中涂勻；用

12、玻片推成推片，干燥后油鏡觀察、繪圖。 【結(jié)果】（繪圖）口腔內(nèi)微生物可見黑色背景中有著色發(fā)亮的細菌、螺旋體等微生物。五、常用消毒滅菌器及無菌室介紹(一)高壓蒸氣滅菌器【構(gòu)造】高壓蒸氣滅菌器是雙層的金屬圓筒，蓋旁附有螺旋，借以緊閉蓋門，使蒸氣不外溢。因而當(dāng)蒸氣壓力升高時，其溫度亦相應(yīng)地增高，高壓蒸氣滅菌器上裝有排氣門、安全活塞，以調(diào)節(jié)器內(nèi)壓力。還有溫度表和壓力表，以顯示內(nèi)部的溫度和壓力。二者的關(guān)系見表10-5。器內(nèi)裝有帶孔的金屬擱板，用以放置欲滅菌物品?！居梅ā考舆m量水于器內(nèi)，放入欲滅菌物品，將蓋關(guān)上，轉(zhuǎn)緊螺旋使之密閉。滅菌器底部用電爐加熱，同時打開排氣門，使器內(nèi)冷氣完全排出，否則壓力表上所示壓力

13、并非全部為蒸氣壓力，再維持該壓力20分鐘后，停止加壓。蒸氣壓力與溫度的關(guān)系千帕斯卡 千克/平方厘米 磅/平方吋 溫度(kpa) (kg/cm2) (lb/in.2) ()34.470.355108.855.200.608113.068.940.70010115.6103.500001.05015121.3137.800001.50020126.2【注意事項】1.必須待壓力逐漸自行下降至零時，才可開蓋取物。切不可突然打開排氣門，放氣減壓，以免瓶內(nèi)液體沖出外溢。2.用于耐高溫和耐濕物品的滅菌，如普通培養(yǎng)基、手術(shù)器械、手術(shù)衣及敷料等。(二)干熱滅菌器(干烤箱)【構(gòu)造】箱壁為雙層，兩層間襯以石棉板隔熱

14、，底部裝有電熱線圈，箱壁有溫度調(diào)節(jié)器和時間調(diào)節(jié)器，箱頂有溫度計調(diào)節(jié)孔，滅菌開始時關(guān)閉調(diào)節(jié)孔。開啟電源后，箱內(nèi)溫度逐漸升高，可保持恒溫?！居梅ā?將待滅菌物品包裝妥當(dāng)，放人箱內(nèi)金屬架上，關(guān)好玻璃門和金屬門，開啟電源，調(diào)節(jié)溫度(160170)和時間(2小時)。【注意事項】溫度不可超過180，以免燒焦棉塞及包裝紙。滅菌后須待溫度下降至接近室溫時方可打開箱門，否則因冷空氣驟進會引起玻璃器皿破裂。干烤滅菌主要應(yīng)用于玻璃、陶瓷制品、凡士林、液體石蠟等物品。(三)流通蒸氣滅菌器其構(gòu)造原理同一般的蒸鍋，底層盛水，器內(nèi)有一至二層的帶孔隔板，以放置待滅菌的物品。加熱水后沸騰產(chǎn)生蒸氣。在普通大氣壓下，蒸氣溫度只能達

15、到100，維持此溫度30分鐘左右，只能殺死細菌繁殖體，而芽胞不一定死亡。所以使用流通蒸氣滅菌器時，必須行間歇滅菌法，即每日一次，每次100蒸30分鐘，取出置37孵箱培養(yǎng)過夜，使未死亡的芽胞發(fā)育成繁殖體。如此連續(xù)滅菌三次可達滅菌目的。本法用于一些不耐高溫的培養(yǎng)基之滅菌。(四)濾菌器濾菌器是用以除去細菌的器具，它含有微細小孔，只允許液體及氣體通過，而大于孔徑的物體不能通過。濾菌器可以除去細菌，但不能除去病毒、支原體、衣原體及細菌l型等微生物。濾過除菌主要用于一些不耐高溫的血清、抗生素、藥液、酶制劑等。常用的濾器有蔡氏濾器和玻璃濾器。(五)煮沸消毒器煮沸100 5min，能殺死一切細菌的繁殖體，煮沸

16、消毒器可用于一般器械(剪刀、注射器)等的消毒。 (六)紫外線燈 常用于手術(shù)室、病房、無菌室、嬰兒室等的空氣消毒，其消毒效果與照射的時間、距離和強度有關(guān)，一般要求燈管離地面約3米高處，照射12小時。(七)無菌室及無菌工作臺的工作原理及使用為避免環(huán)境和空氣中的細菌污染培養(yǎng)物，一般較為細致的細胞培養(yǎng)、細菌培養(yǎng)的操作均應(yīng)在紫外線消毒后的無菌室或超凈工作臺內(nèi)進行。一些不能經(jīng)受高壓、高溫消毒的試劑可用濾器濾膜除菌，器皿可用紫外線照射、75乙醇或0.1的十二烷基磺酸鈉(sds)浸泡消毒。1、無菌室 無菌室或稱潔凈室，是在實驗室內(nèi)部安裝的與外界隔離的用于無菌操作的實驗室。簡單的無菌室可用木結(jié)構(gòu)和玻璃制成，室內(nèi)

17、應(yīng)有空氣過濾裝置，應(yīng)安裝恒溫恒濕的空氣調(diào)節(jié)器、紫外線殺菌燈、照明燈、電源和煤氣嘴等。無菌室必須經(jīng)常保持整潔，一般進入無菌室時，應(yīng)著隔離衣、帽和專用鞋。用前必須先經(jīng)紫外線殺菌燈照射3060min；操作結(jié)束后應(yīng)擦拭臺面，并再經(jīng)紫外線殺菌燈照射處理，隨時保持室內(nèi)的無菌狀態(tài)。緩沖間是其它實驗室與無菌室隔室的中間區(qū)域，它能保持無菌操作的環(huán)境，可與更衣間為同一間，其間設(shè)吹風(fēng)機、恒溫培養(yǎng)箱和小型低速離心機等。另外，無菌室應(yīng)避免日光直射，天花板不宜過高，一般為2.5m左右，以確保紫外線的消毒作用。2、無菌工作臺 無菌工作臺又稱超凈工作臺，系在接種罩的基礎(chǔ)上設(shè)計出來的無菌工作臺。目前多采用垂直層流的氣流形式，通

18、過變速離心風(fēng)機將負壓箱內(nèi)經(jīng)過預(yù)濾器過濾的空氣壓入靜壓箱，再經(jīng)高效過濾器進行二級過濾，從出風(fēng)面吹出的潔凈風(fēng)流 ，以一定的和均勻的斷面風(fēng)速通過工作區(qū)時，將塵埃顆粒和微生物顆粒帶走，從而形成無塵無菌的工作環(huán)境。使用時應(yīng)提前50min打開紫外線殺菌燈，30min后關(guān)閉并啟動送風(fēng)機。凈化區(qū)內(nèi)嚴禁存放不必要的物件，以保持潔凈氣流型不受干擾。應(yīng)定期用電風(fēng)速計測量工作區(qū)平均風(fēng)速(每月1次) ，保持其在0.320.48m/s。每23個月將預(yù)濾器中無紡布濾料拆下進行清洗或予以更換，每3個月用塵埃粒子計數(shù)器測定工作臺的潔凈度(3.5顆/l)和平板法測定其平均菌落數(shù)(0 .5個/皿時)。當(dāng)加大風(fēng)機輸入電壓已不能使凈化

19、工作區(qū)平均風(fēng)速達到規(guī)定參數(shù)時，應(yīng)更換高效過濾器。六、醫(yī)院感染的微生物學(xué)監(jiān)測（醫(yī)院見習(xí)）(一)壓力蒸氣滅菌效果的監(jiān)測目前應(yīng)用的壓力蒸氣滅菌器有兩種：一種是普通的下排氣式壓力蒸氣滅菌器，另一種是近年來出現(xiàn)的預(yù)真空高壓蒸氣滅菌器。前者一次滅菌全過程需時70min，而后者只需20min。對于壓力蒸氣滅菌效果的檢查包括：1、操作步驟檢查 遵守操作規(guī)程，儀表的檢查(壓力表、留點溫度計、溫度記錄、定時器等)；2、化學(xué)指標(biāo)檢查 應(yīng)用指示劑顏色的改變進行監(jiān)測。如三m指示紙；某些物質(zhì)的熔解，如琥珀酸酐120熔解、苯甲酸121123熔解。3、生物指標(biāo)的監(jiān)測 為直接檢查滅菌效果，通常應(yīng)用嗜熱脂肪芽胞桿菌(nctcl0

20、003或atcc 7953，ssik 31)，有市售商品藥片供應(yīng)，菌片含菌量為51056片，此菌在1210.5飽和蒸汽中存活時間39min，殺滅時間為19min。滅菌前于滅菌器中選擇五點放置(通常將菌片放于小試管中，小試管置于滅菌器不同位置)，滅菌后以無菌手續(xù)將菌片取出，放于溴甲酚紫蛋白胨水培養(yǎng)基中于55培養(yǎng)48h。如培養(yǎng)基不變色，外觀澄清說明無細胞生長；如外觀混濁且培養(yǎng)基變?yōu)辄S色則說明有菌生長，滅菌不徹底，需查找原因并重新滅菌。(二)紫外線殺菌效果的監(jiān)測紫外線燈：常用于手術(shù)室、病房、無菌室、嬰兒室等的空氣消毒，其消毒效果與照射的時間、距離和強度有關(guān)，一般要求燈管離地面約3米高處，照射12小時

21、。紫外線消毒效果監(jiān)測：包括日常監(jiān)測、紫外燈管照射強度監(jiān)測和生物監(jiān)測。日常監(jiān)測包括燈管應(yīng)用時間、累計照射時間和使用人簽名。對新的和使用中的紫外燈管應(yīng)進行照射強度監(jiān)測，新燈管的照射強度不得低于100uw/cm2，使用中燈管不得低于70uw/cm2照射強度，監(jiān)測應(yīng)每半年一次。生物監(jiān)測必要時進行，經(jīng)消毒后的物品或空氣中的自然菌應(yīng)減少90.00以 上，人工染菌殺滅率應(yīng)達到99.90。生物學(xué)監(jiān)測應(yīng)用枯草芽胞桿菌黑色變種(atcc9372)，有市售菌片供應(yīng)，含菌量為1056片。(三)消毒劑的使用監(jiān)測1、消毒劑鑒定試驗 包括消毒劑定性試驗和消毒劑定量消毒試驗。2、消毒劑使用過程中污染菌的監(jiān)測以及常用消毒劑的中

22、和劑。(四)微生物污染監(jiān)測1、物體表面細菌污染監(jiān)測 采樣方法為應(yīng)用大小為5cm5cm的正方形無菌規(guī)格扳，放于物體表面，用浸有生理鹽水的棉拭子在規(guī)格扳內(nèi)往返涂抹10次，將取完標(biāo)本的棉拭子放入盛有定量無菌鹽水的試管中，之后進行稀釋數(shù)菌并計算出細菌的數(shù)量（可用傾碟法），按衛(wèi)生部要求醫(yī)院各類病房物體表面細菌數(shù)不得超過8個/cm3。計算公式如下：平均平板菌落數(shù)稀釋倍數(shù)采樣面積 菌落數(shù)/cm2 2、空氣中細菌監(jiān)測 室內(nèi)空氣中微生物的發(fā)生源主要為人和動物。人可不斷地從呼吸道、消化道、皮膚、毛發(fā)等排出微生物進入空氣中。一般情況下，人體排菌量每分鐘不超過1000個，但患者的排泄物和分泌物，如飛沫、痰液等含有大量的病原菌，可嚴重污染空氣和物體表面。當(dāng)人們在進行各種工作時也會污染空氣，如醫(yī)療操作、醫(yī)療用品和衛(wèi)生用品生產(chǎn)、微生物試驗、穿衣、鋪床等都可使微生物進入空氣中?？諝庵形⑸飳W(xué)監(jiān)測是通過空氣采樣、細菌培養(yǎng)來了解各種場所空氣中所含微生物的數(shù)量，從而評價衛(wèi)生狀況，以便有的放矢地采取對策。此外，通過對某種消毒措施使用前后的采樣及分析，以評價消毒效果。根據(jù)采樣原理可將采樣方法分為沉降、固體撞擊、液體沖擊和過濾4種。本實驗介紹自然沉降平板采樣法用于細菌總數(shù)的檢測。其中應(yīng)用重力沉降作用捕獲空氣中的氣溶膠粒子是沉降法中最簡便的方法?！静牧稀糠蛛x培養(yǎng)基：營養(yǎng)