2010年版《中國藥典》三部微生態(tài)活菌制品總論征求意見稿

1、微生態(tài)活菌制品總論（征求意見稿）微生態(tài)活菌制品系由人體內(nèi)正常菌群成員或具有促進(jìn)正常菌群生長和活性作用的無害外籍細(xì)菌，經(jīng)培養(yǎng)、收集菌體、干燥成菌粉后，加入適宜輔料混合制成。用于預(yù)防和治療因菌群失調(diào)引起的相關(guān)癥狀和疾病。微生態(tài)活菌制品必須由非致病的、活的細(xì)菌組成，無論在生產(chǎn)過程、制品貯存和使用期間均應(yīng)保持穩(wěn)定的活菌狀態(tài)。它可由一株細(xì)菌制成單價制劑；也可由多株或幾種細(xì)菌聯(lián)合制成多價制劑。根據(jù)其不同的使用途徑和方法可制備成片劑、膠囊劑、顆粒劑或散劑等多種劑型。目前，國內(nèi)已經(jīng)批準(zhǔn)生產(chǎn)的微生態(tài)活菌制品有22種（見附錄1），其中大多用于防治腸道菌群失調(diào)。制造微生態(tài)活菌制品的制備方法、工藝應(yīng)能保證成品含有足夠

2、的活菌數(shù)量，保持其穩(wěn)定性，同時應(yīng)防止外源因子的污染。一、基本要求生產(chǎn)和檢定用設(shè)施、原料及輔料、水、器具、動物等應(yīng)符合“凡例”的有關(guān)要求。二、生產(chǎn)用菌種生產(chǎn)用菌種應(yīng)符合“生物制品生產(chǎn)檢定用菌毒種管理規(guī)程”的有關(guān)規(guī)定。1、菌種名稱及來源選用的生產(chǎn)菌種應(yīng)來自人體內(nèi)正常菌群，或?qū)θ梭w無毒無害、具有促進(jìn)正常菌群生長和活性作用的外籍細(xì)菌；細(xì)菌分離過程和傳代背景應(yīng)清晰；應(yīng)具備穩(wěn)定的生物學(xué)和遺傳學(xué)特性，并能保持穩(wěn)定的活菌狀態(tài)。應(yīng)經(jīng)實驗室和臨床試驗證明安全、有效。2，種子批的建立生產(chǎn)用菌種應(yīng)按照“生物制品生產(chǎn)檢定用菌毒種管理規(guī)程”的有關(guān)規(guī)定建立種子批系統(tǒng)。三級種子批應(yīng)分別凍干，置適宜溫度保存；種子批傳代應(yīng)限定傳

3、代次數(shù)，原始種子批和主種子批啟開后傳代次數(shù)不得超過10代，工作種子批啟開后至發(fā)酵培養(yǎng)傳代次數(shù)不得超過5代。3、種子批檢定菌種的屬、種型分類鑒定，應(yīng)依據(jù)最新版伯杰氏細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊（Bergeys Manual of Systematic Bacteriology）和伯杰氏細(xì)菌命名手冊(Bergeys Manual of Determinative Bacteriology）的有關(guān)規(guī)定，包括形態(tài)、生長代謝特性檢查，原始種子或主種子還應(yīng)作遺傳特性和抗生素敏感性等檢查。三級種子批常規(guī)檢查包括以下三項：（1）培養(yǎng)特性及染色鏡檢將菌種接種于適宜培養(yǎng)基，置有氧或厭氧環(huán)境中培養(yǎng)，觀察其生長情況，確定菌種為需

4、氧性細(xì)菌或厭氧性細(xì)菌；以劃線法觀察在瓊脂平板上生長的單個菌落的形狀、大小、表面、邊緣、透明度、色澤等特征；也可比較菌種在不同溫度、pH、或氯化鈉濃度等條件下的生長特性等。取菌種的新鮮培養(yǎng)物涂片作革蘭染色，在顯微鏡下觀察菌體的染色反應(yīng)、形態(tài)、大小和排列等，有芽孢的細(xì)菌應(yīng)同時觀察芽孢的形狀、大小和位置（也可增做芽孢染色）。檢查結(jié)果均應(yīng)符合原始菌種的特性。（2）生化反應(yīng)按附錄XIV“細(xì)菌生化反應(yīng)培養(yǎng)基”選擇相應(yīng)的培養(yǎng)基或其它適宜的方法進(jìn)行，結(jié)果應(yīng)符合原始菌種的特性。（3）毒性試驗毒性試驗是通過動物試驗檢查菌種是否存在不安全因素，以保證人體使用安全。用體重1822g小鼠5只，每只腹腔注射0.3ml新鮮

5、菌液（不少于1.0109CFU /0.3ml），連續(xù)觀察3天，小鼠均應(yīng)健康存活、體重增加；或每只小鼠經(jīng)口灌胃0.5ml新鮮菌液（不少于1.0109CFU /0.5ml），每天1次，連續(xù)3天, 從第1天灌胃起連續(xù)觀察至第7天, 小鼠均應(yīng)健康存活，體重增加。除另有規(guī)定外，原始種子或主種子批還需進(jìn)行以下檢查：細(xì)菌代謝產(chǎn)物-脂肪酸測定用氣相色譜法（附錄 C）或其他適宜的方法進(jìn)行，應(yīng)符合該菌種的特性。遺傳特性分析可采用細(xì)菌DNA 的G+C mol%的含量測定或其他適宜方法進(jìn)行，應(yīng)符合該菌種的遺傳特性。抗生素敏感性試驗采用瓊脂擴(kuò)散紙片法或其他適宜方法進(jìn)行菌株的抗生素敏感性檢查，應(yīng)符合該菌種的特性。穩(wěn)定性試

6、驗菌種在適宜培養(yǎng)基中，連續(xù)傳代30代次后，將第30代培養(yǎng)物作種子批檢定，全部檢查結(jié)果應(yīng)與原始菌種的特性一致。三、菌粉制造應(yīng)包括種子液制備、大罐培養(yǎng)、收獲菌體（或芽孢）和菌體干燥制成菌粉。如生產(chǎn)多價制品時，應(yīng)每種菌分別培養(yǎng)，制備單價菌粉。 1、生產(chǎn)用種子 啟開工作種子批菌種，接種于適宜培養(yǎng)基進(jìn)行多級種子擴(kuò)增，應(yīng)涂片作革蘭染色，在顯微鏡下觀察510個視野，細(xì)菌的染色反應(yīng)、形態(tài)應(yīng)一致并符合生產(chǎn)用菌種的特征。制備過程應(yīng)防止污染，菌種傳代次數(shù)應(yīng)符合規(guī)定。2、生產(chǎn)用培養(yǎng)基采用經(jīng)批準(zhǔn)的培養(yǎng)基用于生產(chǎn)。3、培養(yǎng)采用液體培養(yǎng)。將種子液置適宜條件下培養(yǎng)（包括厭氧或需氧、溫度、時間等），培養(yǎng)過程中取樣涂片作革蘭染色

7、鏡檢、PH值檢測等，芽孢菌需進(jìn)行芽孢形成率的檢測，均應(yīng)符合規(guī)定。培養(yǎng)結(jié)束后取樣做純菌檢查，如發(fā)現(xiàn)污染應(yīng)予廢棄。生產(chǎn)多價制品的單價菌粉時，應(yīng)分別培養(yǎng)。4、收獲菌體和制成菌粉培養(yǎng)結(jié)束后離心收獲濕菌體，與適宜的分散劑、穩(wěn)定劑混合。采用冷凍真空干燥法干燥菌體，芽孢菌可采用加熱干燥方法，再經(jīng)粉碎、過篩制成粉末狀菌粉。5、菌粉的保存與有效期應(yīng)通過活菌穩(wěn)定性試驗確定保存溫度和有效期。6、菌粉檢定按“菌粉檢定”項進(jìn)行，符合規(guī)定后方能進(jìn)行半成品配制。四、半成品1、配制 根據(jù)菌粉的活菌數(shù)量，以適宜比例與輔料混合均勻后制成半成品。配制多價制品時，應(yīng)將各單價菌粉、輔料按配方比例和配制程序混合均勻，配制過程應(yīng)防止污染。

8、2、半成品檢定按 “半成品檢定”項進(jìn)行，并符合規(guī)定。五、 成品1、劑型制備根據(jù)制品的用途、使用對象和用藥途徑等因素確定劑型。制備過程應(yīng)符合附錄“制劑通則”項下相關(guān)劑型的規(guī)定。2、分批應(yīng)符合“生物制品分批規(guī)程”規(guī)定。3、分裝、規(guī)格和包裝制品的分裝應(yīng)符合附錄“制劑通則”的有關(guān)規(guī)定。包裝應(yīng)符合“生物制品包裝規(guī)程”的有關(guān)規(guī)定。規(guī)格應(yīng)符合批準(zhǔn)的規(guī)格要求。檢定微生態(tài)活菌制品質(zhì)量檢定應(yīng)包括菌粉檢定、半成品檢定和成品檢定。一、菌粉檢定1、 外觀應(yīng)為白色、灰白色或灰黃色粉末。2、目的菌檢查取少量菌粉加入適量滅菌生理氯化鈉溶液或適宜稀釋液后，涂布在適宜瓊脂平板上，在適宜條件下培養(yǎng)，其培養(yǎng)物的生長特性和染色鏡檢的特

9、征應(yīng)符合生產(chǎn)用菌種特征。3、雜菌檢查：雜菌檢查：方法和結(jié)果判斷見本總論附錄3。如不符合規(guī)定應(yīng)廢棄。4、干燥失重菌粉中殘余水分的含量會直接影響活菌的生存，須進(jìn)行菌粉干燥失重的檢查。應(yīng)按附錄 L或儀器方法測定。5、活菌數(shù)測定測定每克菌粉中含有的活菌數(shù)量。方法見本總論附錄2。二、半成品檢定半成品須作雜菌檢查，根據(jù)用藥途徑確定雜菌檢查的質(zhì)控指標(biāo)。方法和結(jié)果判斷見本總論附錄3。三、成品檢定1、鑒別試驗檢查成品中所含的目的細(xì)菌是否符合生產(chǎn)用菌種的特性。即按上述“種子批檢定”方法進(jìn)行生長特性、染色鏡檢和生化反應(yīng)檢查，應(yīng)符合規(guī)定。對于多價制品，則須逐一檢查單價菌。2、理化檢查（1）外觀性狀根據(jù)劑型，觀察制品的

10、外觀、色澤。片劑外觀應(yīng)完整光潔，呈白色或類白色，間有菌粉色斑；顆粒劑、散劑和膠囊劑內(nèi)粉末的粒子大小應(yīng)一致，色澤均勻，間有菌粉色斑。（2）干燥失重按附錄 L或儀器方法測定，減失重量應(yīng)不得超過5.0 %，芽孢菌制品應(yīng)不得超過7.0%。（3） 粒度散劑和顆粒劑應(yīng)進(jìn)行粒度檢查。按附錄V G第二法，采用單篩分法或雙篩分法檢查，應(yīng)符合規(guī)定。（4）裝量（重量）差異 各劑型按附錄“制劑通則”的相應(yīng)規(guī)定進(jìn)行，應(yīng)符合規(guī)定。 （5）崩解時限膠囊劑、片劑按附錄 C進(jìn)行，應(yīng)符合規(guī)定。3、活菌數(shù)測定按本總論附錄2方法測定每克制品活菌數(shù)，應(yīng)符合規(guī)定。多價制品應(yīng)分別測定各單價活菌數(shù)。4、雜菌檢查目的是檢查成品中外源性微生物的

11、污染情況和是否存在意外的不安全因素，以保證人體使用安全。方法和結(jié)果判斷與半成品的“雜菌檢查”項相同。5、安全試驗：安全試驗是通過動物試驗進(jìn)行的非特異性毒性檢查，應(yīng)根據(jù)制品的使用途徑和人用劑量確定試驗方法。腸道微生態(tài)制品照下述方法檢查：取2g制品加入8ml生理鹽水中，混合均勻，用5只體重1822g小鼠，每只小鼠經(jīng)口灌胃0.5ml，每天1次，連續(xù)3天。自第1日灌胃起，連續(xù)觀察7天，小鼠應(yīng)健康存活、體重增加，判為合格。如不符合規(guī)定，可用10只小鼠復(fù)試1次，判定標(biāo)準(zhǔn)同前。陰道微生態(tài)制品照下述方法檢查，用2426g雌性小鼠5只，每只小鼠陰道內(nèi)置入10mg制品，每天1次，連續(xù)3天。從給藥第1天，連續(xù)觀察7

12、天，小鼠應(yīng)健康存活，陰道局部無紅腫分泌物等癥狀，體重增加，判為合格。保存、運輸及有效期按批準(zhǔn)的溫度保存和運輸，自半成品配制之日起，按批準(zhǔn)的有效期執(zhí)行。使用說明 應(yīng)符合“生物制品包裝規(guī)程”規(guī)定和批準(zhǔn)的內(nèi)容。附錄1 已批準(zhǔn)的微生態(tài)活菌制品 制品名稱 細(xì)菌種類 一、 雙歧桿菌活菌膠囊 青春型雙歧桿菌 二、 雙歧桿菌活菌散 青春型雙歧桿菌三、 雙歧桿菌三聯(lián)活菌膠囊 1.長型雙歧桿菌2.嗜酸乳桿菌 3.糞腸球菌四、 雙歧桿菌三聯(lián)活菌散 1.長型雙歧桿菌2.嗜酸乳桿菌 3.糞腸球菌五、 雙歧桿菌乳桿菌三聯(lián)活菌片 1.長型雙歧桿菌 2.保加利亞乳桿菌 3.嗜熱鏈球菌六、 地衣芽孢桿菌活菌膠囊 地衣芽孢桿菌七

13、、 地衣芽孢桿菌活菌顆粒 地衣芽孢桿菌八、 地衣芽孢桿菌活菌片 地衣芽孢桿菌九、 蠟樣芽孢桿菌活菌膠囊 蠟樣芽孢桿菌十、 蠟樣芽孢桿菌活菌片 蠟樣芽孢桿菌十一、雙歧桿菌四聯(lián)活菌片 1.嬰兒雙歧桿菌 2.嗜酸乳桿菌 3.糞腸球菌4.蠟樣芽孢桿菌十二、酪酸梭菌活菌膠囊 酪酸梭狀芽孢桿菌十三、酪酸梭菌活菌散 酪酸梭狀芽孢桿菌十四、酪酸梭菌活菌片 酪酸梭狀芽孢桿菌十五、凝結(jié)芽孢桿菌活菌片 凝結(jié)芽孢桿菌十六、酪酸梭菌二聯(lián)活菌膠囊 1.酪酸梭狀芽孢桿菌 2.嬰兒型雙歧桿菌十七、酪酸梭菌二聯(lián)活菌散 1.酪酸梭狀芽孢桿菌 2.嬰兒型雙歧桿菌十八、枯草桿菌活菌膠囊 枯草芽孢桿菌十九、枯草桿菌腸球菌二聯(lián)活菌多維顆

14、粒 1.枯草芽孢桿菌 2.屎腸球菌二十、枯草桿菌腸球菌二聯(lián)活菌膠囊 1.枯草芽孢桿菌 2.屎腸球菌二十一、凝結(jié)芽孢桿菌活菌片 凝結(jié)芽孢桿菌二十二、陰道用乳桿菌活菌膠囊 德氏乳桿菌 附錄2 活菌數(shù)測定無菌稱取3.0g制品（或菌粉），加入27.0ml稀釋液中，充分搖勻，作10倍系列稀釋（最終稀釋度根據(jù)不同的指標(biāo)要求而定），取最終稀釋度100l，滴入選擇性瓊脂培養(yǎng)基平皿上，共做3個平皿，并以玻棒涂布均勻，置適宜條件下培養(yǎng)，到期觀察每個平皿菌落生長情況，并計數(shù)。但必須注意當(dāng)平皿菌落數(shù)小于10或大于300時，應(yīng)調(diào)整最終稀釋度，重新測定。根據(jù)3個平皿菌落總數(shù)按下列公式計算活菌數(shù)。3個平皿菌落數(shù)之和3活菌數(shù)

15、（CFU/g）= 10最終稀釋度附注：（1）活菌數(shù)用“CFU”表示，即為細(xì)菌集落單位。（2）稀釋液通常使用生理氯化鈉溶液。（3）選擇性瓊脂培養(yǎng)基，是指最適宜制劑（或菌粉）中活菌生長的培養(yǎng)基。須經(jīng)批準(zhǔn)后才能使用。附錄3 雜菌檢查法 微生態(tài)活菌制品雜菌檢查法系檢查微生態(tài)活菌制品及半成品、菌粉受外源微生物污染程度的方法。檢查項目包括控制菌、非致病性雜菌總數(shù)、真菌數(shù)檢查。雜菌檢查應(yīng)在環(huán)境潔凈度10000 級下的局部潔凈度100 級的單向流空氣區(qū)域內(nèi)進(jìn)行。檢驗全過程必須嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作，防止再污染。單向流空氣區(qū)域、工作臺面及環(huán)境應(yīng)定期按醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法的現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)

16、進(jìn)行潔凈度驗證。供試品檢查時，如果使用了表面活性劑、中和劑或滅活劑，應(yīng)證明其有效性及對微生物無毒性。除另有規(guī)定外，本檢查法中細(xì)菌培養(yǎng)溫度為3037；真菌培養(yǎng)溫度為2028。檢驗結(jié)果以1g為單位報告。供試品的準(zhǔn)備檢驗時，應(yīng)從2個以上最小包裝單位中抽取供試品，一般應(yīng)隨機(jī)抽取不少于3倍的檢驗用量。一次試驗所用的供試品量即為檢驗量（g）。除另有規(guī)定外，直接稱取1.0g菌粉、半成品、成品（片劑、膠囊劑先研碎）備用?？刂凭鷻z查控制菌檢查用培養(yǎng)基的適用性檢查控制菌檢查用的培養(yǎng)基應(yīng)進(jìn)行培養(yǎng)基的適用性檢查，成品培養(yǎng)基、由脫水培養(yǎng)基或按培養(yǎng)基處方配制的培養(yǎng)基均應(yīng)檢查。檢查項目包括培養(yǎng)基的促生長、指示和抑制特性能力

17、。菌種 試驗所用的菌株傳代次數(shù)不得超過5代（從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代），并采用適宜的菌種保藏技術(shù)，以保證試驗菌株的生物學(xué)特性。破傷風(fēng)梭狀芽孢桿菌檢查以生孢梭菌作為指示菌。大腸埃希菌（Escherichia coli）CMCC（B） 44 102金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CMCC（B） 26 003乙型付傷寒沙門菌（Salmonella paratyphi B）CMCC（B） 50 094銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）CMCC（B） 10 104生孢梭菌（Clostridium sporogenes）CMCC（B）

18、64 941白色念珠菌（Candida albicans）CMCC（F） 98 001痢疾志賀菌（Shigella dysenteriae）CMCC（B） 51 252菌液制備 接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、乙型付傷寒沙門菌、銅綠假單胞菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1824小時；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基或改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2448小時。用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)為10100cfu或1001000cfu的菌懸液。菌懸液制備后應(yīng)在2小時內(nèi)使用，若保存在28的菌懸液可以在24小時內(nèi)使用。

19、適用性檢查 控制菌檢查用培養(yǎng)基的適用性檢查所用的菌株及檢測項目見表1 。表1 控制菌檢查用培養(yǎng)基的促生長、抑制和指示能力檢查控制菌培養(yǎng)基特性試驗菌株大腸埃希菌膽鹽乳糖培養(yǎng)基促生長能力大腸埃希菌抑制能力金黃色葡萄球菌曙紅亞甲藍(lán)瓊脂促生長能力+ 指示能力大腸埃希菌沙門菌、志賀菌膽鹽乳糖培養(yǎng)基促生長能力乙型付傷寒沙門菌痢疾志賀菌抑制能力金黃色葡萄球菌沙門、志賀屬瓊脂促生長能力+指示能力乙型付傷寒沙門菌、痢疾志賀菌銅綠假單胞菌 NAC液體促生長能力銅綠假單胞菌抑制能力金黃色葡萄球菌NAC瓊脂促生長能力銅綠假單胞菌抑制能力大腸埃希菌綠膿菌素測定用培養(yǎng)基促生長能力+指示能力銅綠假單胞菌金黃色葡萄球菌 7.

20、5%氯化鈉肉湯促生長能力金黃色葡萄球菌抑制能力大腸埃希菌甘露醇鹽瓊脂促生長能力+指示能力金黃色葡萄球菌抑制能力大腸埃希菌梭菌 梭菌增菌培養(yǎng)基促生長能力生孢梭菌哥倫比亞瓊脂促生長能力生孢梭菌白色念珠菌沙氏葡萄糖肉湯促生長能力白色念珠菌沙氏葡萄糖瓊脂促生長能力+指示能力白色念珠菌念珠菌顯色培養(yǎng)基 促生長能力+指示能力白色念珠菌抑制能力大腸埃希菌吐溫 80 玉米瓊脂培養(yǎng)物促生長能力+指示能力白色念珠菌增菌培養(yǎng)基促生長能力檢查：分別接種不大于100cfu 的試驗菌于被檢培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基中，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及最短培養(yǎng)時間下培養(yǎng)。與對照培養(yǎng)基管比較，被檢培養(yǎng)基管試驗菌應(yīng)生長良好。固體培養(yǎng)基

21、促生長能力檢查：取試驗菌各0.1ml（含菌數(shù)50100cfu）分別涂布于被檢培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基平皿中，每種培養(yǎng)基平行制備2 個平皿，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及最短培養(yǎng)時間下培養(yǎng)，計數(shù)。被檢培養(yǎng)基的菌落數(shù)與對照培養(yǎng)基菌落數(shù)相比應(yīng)不小于70%，且生長的菌落形態(tài)應(yīng)一致。培養(yǎng)基抑制能力檢查：接種試驗菌于被檢培養(yǎng)基中，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及最長時間下培養(yǎng)，試驗菌應(yīng)不得生長。培養(yǎng)基指示能力檢查：分別接種少量試驗菌于被檢培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基平皿上，在相應(yīng)控制菌檢查規(guī)定的培養(yǎng)溫度及時間下培養(yǎng)。被檢培養(yǎng)基中試驗菌生長的菌落形態(tài)、大小、指示劑反應(yīng)情況等應(yīng)與對照培養(yǎng)基一致。供試品檢查供試品的控制菌檢查

22、應(yīng)按下述方法進(jìn)行。陽性對照試驗 供試品進(jìn)行控制菌檢查時，應(yīng)做陽性對照試驗。取陽性對照菌于相應(yīng)選擇性培養(yǎng)基平皿上劃線接種，按供試品的控制菌檢查方法培養(yǎng)，觀察菌落生長情況。陽性對照試驗應(yīng)檢出相應(yīng)的控制菌。陰性對照試驗 取增菌液0.1ml 照相應(yīng)控制菌檢查法檢查，作為陰性對照。陰性對照應(yīng)無菌生長。1大腸埃希菌檢查1.1增菌培養(yǎng)稱取供試品1g，加到9ml滅菌膽鹽乳糖增菌液中,培養(yǎng)1824小時。1.2 特異培養(yǎng)將上述增菌液搖勻，取0.1ml滴加到曙紅亞甲藍(lán)瓊脂平皿上，以玻棒涂勻，一式3份，培養(yǎng)1824小時，觀察菌落生長情況。1.3 結(jié)果判定陽性對照平皿應(yīng)長出紫黑色、圓形、稍凸起、邊緣整齊、表面光滑、帶有

23、金屬光澤的菌落。供試品平皿上若未見菌落生長、或生長的菌落與陽性對照的菌落形態(tài)特征不符，判供試品未檢出大腸埃希菌；若生長的菌落與陽性對照的菌落形態(tài)特征相符或疑似，應(yīng)作革蘭氏染色鏡檢等適宜的鑒定試驗，鑒別是否為制品中的目的菌或大腸埃希菌。2 志賀、沙門菌檢查2.1增菌培養(yǎng)稱取供試品1g，加到9ml滅菌膽鹽乳糖增菌液中,培養(yǎng)1824小時。2.2 特異培養(yǎng)將上述增菌液搖勻，取0.1ml滴加到沙門、志賀屬瓊脂平皿上，以玻棒涂勻，一式3份，培養(yǎng)2448小時，觀察菌落生長情況。2.3 結(jié)果判定陽性沙門菌對照平皿應(yīng)長出無色透明或半透明、圓形、光滑、稍隆起菌落，中心呈黑褐色。陽性志賀菌對照平皿應(yīng)長出無色、半透明

24、、圓形、微突、光滑、的菌落。供試品平皿培養(yǎng)24小時、48小時各觀察結(jié)果1次，若未見菌落生長，判供試品未檢出志賀、沙門菌；若有菌落生長，應(yīng)與陽性對照的菌落比較，并作革蘭染色鏡檢等適宜的鑒定試驗，鑒別是否為制品中的目的菌或志賀、沙門菌。3.銅綠假單胞菌檢查3.1 增菌培養(yǎng)稱取供試品1g，加到9ml的NAC液體中,培養(yǎng)1824小時。3.2 特異培養(yǎng)將上述增菌液搖勻，取0.1ml滴加到NAC瓊脂平皿上，以玻棒涂勻，一式3份，培養(yǎng)1824小時，觀察菌落生長情況。3.3 結(jié)果判定陽性對照平皿應(yīng)長出產(chǎn)綠色色素的菌落，可使整個培養(yǎng)基呈綠色。如平皿上無菌落生長或生長的菌落與陽性對照菌落形態(tài)特征不符，判供試品未檢

25、出銅綠假單胞菌。如平皿生長的菌落與上述菌落形態(tài)特征相符或疑似，應(yīng)挑選23個菌落，分別接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)1824小時。取斜面培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭染色、鏡檢及氧化酶試驗，鑒別是否為制品中的目的菌或銅綠假單胞菌。氧化酶試驗 取潔凈濾紙片置于平皿內(nèi)，用無菌玻棒取斜面培養(yǎng)物涂于濾紙片上，滴加新配制的1二鹽酸二甲基對苯二胺試液，在30秒內(nèi)若培養(yǎng)物呈粉紅色并逐漸變?yōu)樽霞t色為氧化酶試驗陽性，否則為陰性。若斜面培養(yǎng)物為非革蘭陰性無芽孢桿菌或氧化酶試驗陰性，均判供試品未檢出銅綠假單胞菌。否則，應(yīng)進(jìn)行綠膿菌素試驗。綠膿菌素（Pyocyanin）試驗 取斜面培養(yǎng)物接種于PDP瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)24 小時，

26、加三氯甲烷35ml 至培養(yǎng)管中，攪碎培養(yǎng)基并充分振搖。靜置片刻，將三氯甲烷相移至另一試管中，加入1mol/L 鹽酸試液約1ml，振搖后，靜置片刻，觀察。若鹽酸溶液呈粉紅色，為綠膿菌素試驗陽性，否則為陰性。同時用未接種的PDP 瓊脂培養(yǎng)基斜面同法作陰性對照，陰性對照試驗應(yīng)呈陰性。若上述疑似菌為革蘭陰性桿菌、氧化酶試驗陽性及綠膿菌素試驗陽性，判供試品檢出銅綠假單胞菌。若上述疑似菌為革蘭陰性桿菌、氧化酶試驗陽性及綠膿菌素試驗陰性，應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行適宜的鑒定試驗，確認(rèn)是否為銅綠假單胞菌。4金黃色葡萄球菌檢查4.1增菌培養(yǎng)稱取供試品1g，加到9ml滅菌的7.5氯化鈉肉湯中,培養(yǎng)1824小時。4.2特異培養(yǎng)將上

27、述增菌液搖勻，取0.1ml滴加到甘露醇高鹽瓊脂平皿上，以玻棒涂勻，一式3份，培養(yǎng)1824小時，觀察菌落生長情況。4.3 結(jié)果判定陽性對照平皿應(yīng)長出產(chǎn)金黃色素的圓形、凸起，邊緣整齊的菌落。供試品平皿上若未見菌落生長或生長的菌落與陽性對照菌落形態(tài)不符，判未檢出金黃色葡萄球菌；若平皿上生長的菌落與陽性對照品的菌落特征相符或疑似，應(yīng)挑選23 個菌落，分別接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)1824 小時。取營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭染色，并接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1824 小時，作血漿凝固酶試驗。血漿凝固酶試驗 取滅菌小試管3 支，各加入血漿和無菌水混合液（11）0.5ml，再分別加入可疑菌株的營

28、養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物（或由營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)物制備的濃菌懸液）0.5ml、金黃色葡萄球菌營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物（或由營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)物制備的濃菌懸液）0.5ml、營養(yǎng)肉湯或0.9%無菌氯化鈉溶液0.5ml，即為試驗管、陽性對照管和陰性對照管。將3 管同時培養(yǎng)，3 小時后開始觀察直至24 小時。陰性對照管的血漿應(yīng)流動自如，陽性對照管血漿應(yīng)凝固，若試驗管血漿凝固者為血漿凝固酶試驗陽性，否則為陰性。如陽性對照管或陰性對照管不符合規(guī)定時，應(yīng)另制備血漿，重新試驗。若上述疑似菌為非革蘭陽性球菌、血漿凝固酶試驗陰性，亦非制品中的目的菌，判供試品未檢出金黃色葡萄球菌。5.破傷風(fēng)梭狀芽孢桿菌 5.1增菌培養(yǎng)取供試品1

29、g或1ml 2 份，其中1 份置80保溫10 分鐘后迅速冷卻。上述2 份供試液直接或處理后分別接種至9ml 的梭菌增菌培養(yǎng)基中，置厭氧條件下培養(yǎng)48小時。5.2特異培養(yǎng)取上述每一培養(yǎng)物0.1ml，分別涂布接種于含慶大霉素的哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基平皿上，一式3份，置厭氧條件下培養(yǎng)4872 小時。5.3 結(jié)果判定若供試平皿上無菌落生長，判供試品未檢出破傷風(fēng)梭狀芽孢桿菌；若平皿上有菌落生長，應(yīng)挑選23個菌落進(jìn)行革蘭染色等適宜的鑒定試驗。若上述疑似菌為革蘭陽性梭狀芽孢菌，應(yīng)進(jìn)行芽孢的位置、大小、形態(tài)的觀察等適宜的鑒定試驗，判斷是否為破傷風(fēng)梭狀芽孢桿菌。6.白色念珠菌（Candida albicans） 6

30、.1增菌培養(yǎng)取供試品1g或1ml，接種至9ml的沙氏葡萄糖肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2448 小時。6.2特異培養(yǎng)取上述培養(yǎng)物0.1ml，滴加到沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平皿上，以玻棒涂勻，一式3份，培養(yǎng)2448 小時（必要時延長至72小時）。6.3 結(jié)果判定陽性對照平皿應(yīng)長出乳白色偶見淡黃色的菌落，菌落表面光滑有濃酵母氣味，培養(yǎng)時間稍久則菌落增大，顏色變深、質(zhì)地變硬或有皺摺。若供試品平皿上未見菌落生長或生長的菌落與陽性對照菌落形態(tài)特征不符，判供試品未檢出白色念珠菌。如平皿上生長的菌落與陽性對照菌落形態(tài)特征相符或疑似，應(yīng)挑選23個菌落分別接種至念珠菌顯色培養(yǎng)基平皿上，培養(yǎng)2448 小時（必要時延長至72 小

31、時）。若平皿上無綠色或翠綠色的菌落生長，判供試品未檢出白色念珠菌。若平皿上生長的菌落為綠色或翠綠色，挑取相符或疑似的菌落接種于1%吐溫80 玉米瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2448 小時。取培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭染色鏡檢及芽管試驗。芽管試驗 挑取1%吐溫80 玉米瓊脂培養(yǎng)基上的培養(yǎng)物，接種于加有一滴血清的載玻片上，蓋上蓋玻片，置濕潤的平皿內(nèi)，置3537、13h，置顯微鏡下觀察，可見到由孢子長出短小芽管。若上述疑似菌為非革蘭陽性菌，顯微鏡未見厚膜孢子、假菌絲、芽管，亦非制品中的目的菌，判供試品未檢出白色念珠菌。非致病性雜菌、真菌計數(shù)計數(shù)培養(yǎng)基的適用性檢查非致病性雜菌、真菌計數(shù)用的培養(yǎng)基應(yīng)進(jìn)行培養(yǎng)基的適用性檢查，包

32、括成品培養(yǎng)基、由脫水培養(yǎng)基或按培養(yǎng)基處方配制的培養(yǎng)基均應(yīng)檢查。菌種 對試驗菌種的要求同控制菌培養(yǎng)基的適用性檢查。大腸埃希菌（Escherichia coli）CMCC（B） 44 102金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CMCC（B） 26 003枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）CMCC（B） 63 501白色念珠菌（Candida albicans）CMCC（F） 98 001菌液制備 接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1824 小時；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基或改良馬丁

33、瓊脂培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2448 小時。上述培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml 含菌數(shù)為 50100cfu或5001000cfu的菌懸液。菌懸液制備后應(yīng)在2小時內(nèi)使用，若保存在28的菌懸液可以在24小時內(nèi)使用。適用性檢查 取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌菌液各1ml(含50100cfu)，分別注入無菌平皿中，立即傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2個平皿，混勻，凝固，置3037培養(yǎng)48小時，計數(shù)；取白色念珠菌液1ml(含50100cfu)，注入無菌平皿中，立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基，每株試驗菌平行制備2個平皿，混勻，凝固，置2028培養(yǎng)72小時，計數(shù)。或采用涂布法，取上述菌液各

34、0.1ml(含菌數(shù)50100cfu)，分別涂布于相應(yīng)瓊脂培養(yǎng)基平皿上，以玻璃棒涂布均勻，一式2份，同法培養(yǎng)，計數(shù)。同時，用對應(yīng)的對照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基進(jìn)行上述試驗。結(jié)果判定 被檢培養(yǎng)基的菌落數(shù)與對照培養(yǎng)基菌落數(shù)相比大于70%，且菌落形態(tài)大小應(yīng)與對照培養(yǎng)基上的菌落一致。判該培養(yǎng)基的適用性檢查符合規(guī)定。供試品檢查供試品的非致病性雜菌、真菌檢查應(yīng)按下述方法進(jìn)行。陽性對照 除另有規(guī)定外，真菌以白色念珠菌為對照菌，其它以金黃色葡萄球菌為對照菌。除另有規(guī)定外，選用營養(yǎng)瓊脂用于非致病性雜菌的檢查，玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基用于真菌計數(shù)。1 真菌檢查稱取供試品1g，加到9ml滅菌 0.9氯化鈉溶液或其它適宜稀釋液中

35、,混勻，10倍系列稀釋，取適宜稀釋度供試液0.1ml加到已備好的玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上，以玻璃棒涂勻，一式3份，倒置，恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96小時，每天觀察結(jié)果，記錄平皿上生長的真菌菌落數(shù)。結(jié)果計算：以3個平皿上生長的菌落平均數(shù)計算： 3個平皿菌落數(shù)之和 3 真菌數(shù)（cfu/g）= 100 2 非致病性雜菌檢查稱取供試品1g，加到9ml滅菌 0.9氯化鈉溶液或其它適宜稀釋液中,混勻，10倍系列稀釋，取適宜稀釋度供試液0.1ml加到已備好的瓊脂培養(yǎng)基上，以玻璃棒涂勻，一式3份，倒置，恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時，每天觀察結(jié)果，記錄平皿上生長的菌落數(shù)。結(jié)果計算方法同真菌檢查。結(jié)果判斷供試品檢出控制菌或其他致

36、病菌時，按一次檢出結(jié)果為準(zhǔn)，不再復(fù)試。供試品的非致病性雜菌總數(shù)、真菌數(shù)其中任何一項不符合，不再復(fù)試。判供試品不符合規(guī)定。稀釋液除另有規(guī)定外，微生態(tài)制品雜菌檢查用稀釋液采用0.9%無菌氯化鈉溶液。稀釋液配制后，應(yīng)采用驗證合格的滅菌程序滅菌。1.pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液 照無菌檢查法（附錄 A)制備。2.0.9%無菌氯化鈉溶液配制 取氯化鈉9.0g，加水溶解使成1000ml，過濾，分裝、滅菌。培養(yǎng)基及其制備方法可以照“無菌檢查法”（附錄 A）和“微生物限度檢查法”（附錄 G）制備。也可使用按以上處方生產(chǎn)的符合要求的脫水培養(yǎng)基。配制后，應(yīng)采用驗證合格的滅菌程序滅菌。上述附錄未收錄的培養(yǎng)基

37、按照以下配方配制。1. 7.5%氯化鈉肉湯培養(yǎng)基蛋白胨 10.0g 氯化鈉 75.0g牛肉浸粉 3.0g 水 1000ml取上述成分混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH為弱堿性，煮沸，濾清，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.20.2，分裝，滅菌。2. NAC液體培養(yǎng)基蛋白胨 20.0g 奈啶酮酸 0.015g硫酸鎂 0.3g 磷酸氫二鉀 0.3g溴化十六烷基三甲銨 0.3g 水 1000ml除瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.50.1，加熱溶化后，分裝，滅菌。3. NAC瓊脂培養(yǎng)基蛋白胨 20.0g 奈啶酮酸 0.015g硫酸鎂 0.3g 磷酸氫二鉀 0.3g瓊脂 14.0g 溴化十六烷基

38、三甲銨 0.3g水 1000ml除瓊脂外，取上述成分，混合，微溫溶解，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.50.1，加入瓊脂，加熱溶化后，分裝，滅菌，冷至60，傾注平皿。雜菌限度標(biāo)準(zhǔn)微生態(tài)活菌制品的藥效成份就是活菌，雜菌檢查既不同于其它生物制品的無菌檢查，也不同于化學(xué)藥品的微生物限度檢查。雜菌檢查的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)是基于藥品的給藥途徑和對患者健康潛在的危害以及活菌制品的特殊性而制訂的。1.口服微生態(tài)活菌制品1.1菌粉大腸埃希菌 每1g不得檢出。金黃色葡萄球菌 每1g不得檢出。銅綠假單胞菌 每1g不得檢出。沙門菌及志賀菌 每1g不得檢出。非致病性雜菌數(shù) 每1g 不得過500 個cfu。真菌數(shù) 每1g不得過100 個cfu。1.2半成品、成品大腸埃希菌 每1g不得檢出。金黃色葡萄球菌 每1g不得檢出。銅綠假單胞菌 每1g不得檢出。沙門菌及志賀菌 每1g不得檢出。非致病性雜菌數(shù) 每1g 不得過1000 個cfu。真菌數(shù) 每1g不得過100 個cfu。2. 陰道微生態(tài)活菌制品2.1 菌粉金黃色葡萄球菌 每1g不得檢出銅綠假單胞菌 每1g不得檢出破傷風(fēng)梭狀芽孢桿菌