第八章2010-4-miRNA

1、miRNA與siRNA 非編碼小分子RNA miRNA siRNA 非編碼小分子RNA 從“生物垃圾”到“年度分子” 真核生物基因組中99%為非編碼序列， 外顯子和調(diào)控序列外稱為“垃圾” 非編碼序列轉(zhuǎn)錄出的RNA為“垃圾RNA 分子” 非編碼核糖核酸：除成熟mRNA分子外 所有獨(dú)立存在的RNA分子。 進(jìn)化越高，“垃圾”越多？ 1993年，線蟲，lin-4 2000年，線蟲，let-7 很快分離出一類21-22 小分子RNA 1998, RNA干擾現(xiàn)象 2001，人工合成，siRNA，抑制同源序列 基因的表達(dá) 至此，“垃圾”變“寶物” 非編碼RNA的研究成果先后7次在近10年 scince評(píng)選：

2、年度十大科技突破 2000年，RNA的研究進(jìn)展被美國(guó)科學(xué)雜志 評(píng)為重大科技突破； 2001年“RNA干擾”作為當(dāng)年最重要的科學(xué)研 究成果之一，再次入選“十大科技突破”； 2002年12月20日，Science雜志將“Small RNA siRNA）和微小RNA （microRNA；miRNA）是兩種序列特 異性地轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)的調(diào)節(jié)因子，是小 RNA的最主要組成部分，它們的相關(guān)性密 切，既具有相似性，又具有差異性。對(duì)小 RNA的深入研究將使我們更深一步了解生 命的奧秘。 RNA干涉（RNAi）在實(shí)驗(yàn)室中是一種強(qiáng)大 的實(shí)驗(yàn)工具，通過(guò)這種方式，利用具有同源 性的雙鏈RNA（dsRNA）誘導(dǎo)序列特異

3、的 目標(biāo)基因的沉默，迅速阻斷基因活性。 小的干涉RNA（siRNA）是在RNA干涉過(guò)程 中人工體外合成的小片段RNA，由約20個(gè)堿 基對(duì)組成，包括5個(gè)磷酸根，2個(gè)核苷和3個(gè) 懸臂。 在哺乳動(dòng)物中利用小的干涉RNA和短發(fā) 夾RNA（short hairpin RNAs， shRNA）來(lái)進(jìn)行RNA干涉以使基因沉 默已經(jīng)成為強(qiáng)大而有力的生物工具。 圖1 dsRNA可以沉默目標(biāo)基因。 在植物中，通過(guò)注入人工合成的RNA病毒或者是插入反向重復(fù)序列 可以誘導(dǎo)目標(biāo)基因沉默。在線蟲中，沉默也可以用注射dsRNA的方 式來(lái)誘導(dǎo)。這兩種生物體中，沉默是系統(tǒng)的并且傳遍全身。 a) 沉默信號(hào)從脈桿傳到葉片組織。綠色是

4、綠色熒光蛋白；紅色是葉 綠素?zé)晒?，可以在綠色熒光蛋白被沉默后看出。 b,c）通過(guò)實(shí)驗(yàn)，使得線蟲的核中表達(dá)綠色熒光蛋白。實(shí)驗(yàn)者在左邊 加上對(duì)照dsRNA，右邊加上綠色熒光蛋白的dsRNA。一些神經(jīng)元核 仍然可以檢測(cè)到熒光，對(duì)應(yīng)于少量的蛋白質(zhì)表達(dá)。 c）Hela細(xì)胞加上ORC6 siRNA之后，針對(duì)微管蛋白（綠色）和 DNA（紅色）進(jìn)行染色。ORC6的去除導(dǎo)致多核細(xì)胞的積累。穩(wěn)定 的沉默也可以通過(guò)表達(dá)發(fā)夾結(jié)構(gòu)或者折回的雙鏈RNA的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)。 d）當(dāng)和野生型的果蠅相比（右邊），成體果蠅中表達(dá)控制白色基因 的發(fā)夾同源物（左邊）導(dǎo)致眼睛喪失色素。 1999年， Hamilton等在植物基因沉默的研究中

5、首次發(fā)現(xiàn) 2125nt 的dsRNA 的出現(xiàn)對(duì)轉(zhuǎn)基因?qū)е禄虺聊种?要，而在轉(zhuǎn)基因正確表達(dá)的植株中則未出現(xiàn)。 隨后，Hammond 等進(jìn)行的細(xì)胞提取物核酸酶活性實(shí)驗(yàn)證明 了小分子RNA在RNAi 中的作用，這些小分子RNA就是由 dsRNA形成的siRNA。 RNAi能夠調(diào)節(jié)和關(guān)閉基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的各種高級(jí) 生命活動(dòng)。 RNAi的發(fā)現(xiàn)不僅提升了人們對(duì)RNA分子的認(rèn)識(shí)，還大大推 進(jìn)基因功能的研究，更為各種類型的傳染病和癌癥提供了一種 新的手段。 近年來(lái)，有關(guān)RNAi研究成果令人眼花繚亂：人們利用RNAi 途徑來(lái)人為調(diào)節(jié)特定基因的表達(dá)以達(dá)到治療遺傳疾病甚至癌癥 的目的，而且已經(jīng)有不少的

6、成功信息公布。 siRNA是RNAi途徑的主要作用 物,miRNA和siRNA很容易混淆，他們 有許多共同點(diǎn)也有許多不同點(diǎn)。 相同點(diǎn)/聯(lián)系點(diǎn)siRNAmiRNA 長(zhǎng)度及特征都約在22nt左右，5端是磷酸基，3端是羥基 合成的底物miRNA和siRNA合成都是由雙鏈的RNA或RNA 前體形成的 Dicer酶依賴Dicer酶的加工，是Dicer的產(chǎn)物，所以具有 Dicer產(chǎn)物的特點(diǎn) Argonaute家族蛋白都需要Argonaute家族蛋白參與 RISC組分二者都是RISC組分，所以其功能界限變得不清晰， 如二者在介導(dǎo)沉默機(jī)制上有重疊；產(chǎn)生了on target和off target的問(wèn)題 作用方式

7、都可以阻遏靶標(biāo)基因的翻譯，也可以導(dǎo)致mRNA 降解，即在轉(zhuǎn)錄水平后和翻譯水平起作用 進(jìn)化關(guān)系可能的兩種推論：siRNA是miRNA的補(bǔ)充， miRNA在進(jìn)化過(guò)程中替代了siRNA 不同點(diǎn)/分歧點(diǎn)siRNAmiRNA 機(jī)制性質(zhì)往往是外源引起的，如病 毒感染和人工插入 dsRNA之后誘導(dǎo)而產(chǎn)生， 屬于異常情況 是生物體自身的一套正常的調(diào) 控機(jī)制 直接來(lái)源長(zhǎng)鏈dsRNA發(fā)夾狀pre-miRNA 分子結(jié)構(gòu)siRNA是雙鏈RNA， 3端有2個(gè)非配對(duì)堿基， 通常為UU miRNA是單鏈RNA 對(duì)靶RNA特異性較高，一個(gè)突變?nèi)菀滓?RNAi沉默效應(yīng)的改變 相對(duì)較低，一個(gè)突變不影響 miRNA的效應(yīng) 作用方

8、式RNAi途徑miRNA途徑 生物合成，成熟過(guò)程由dsDNA在Dicer酶切 割下產(chǎn)生;發(fā)生在細(xì)胞質(zhì) 中 pri-miRNA在核內(nèi)由一種稱為 Drosha酶處理后成為60nt的 帶有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的Precursor miRNAs (pre-miRNAs)； 這些pre-miRNAs在轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì) 胞核外之后再由Dicer酶進(jìn)行 處理，酶切后成為成熟的 miRNAs；發(fā)生在細(xì)胞核和細(xì) 胞質(zhì)中 不同點(diǎn)/分歧點(diǎn)siRNAmiRNA Argonaute (AGO) 蛋 白質(zhì) 各有不同的AGO蛋白 質(zhì) 各有不同的AGO蛋白質(zhì) 互補(bǔ)性 （complementarity） 一般要求完全互補(bǔ)不完全互補(bǔ)，存在錯(cuò)配現(xiàn)象

9、RISCs的分子量不同 (Martinez and Tuschl, 2004; Martinez et al., 2002; Nykanen et al., 2001; Pham et al., 2004) siRISCsmiRISCs/miRNP 各自的生物學(xué)功能不同抵抗病毒的防御機(jī) 制；沉默那些過(guò)分 表達(dá)的mRNA；保 護(hù)基因組免受轉(zhuǎn)座子 的破壞 對(duì)有機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育有重要 作用(Rhoades et al., 2002) 重要特性高度特異性高度的保守性、時(shí)序性和組 織特異性 不同點(diǎn)/ 分歧點(diǎn) siRNAmiRNA 作用機(jī) 制 單鏈的siRNA結(jié)合到RISC復(fù)合物中， 引導(dǎo)復(fù)合物與mRNA完

10、全互補(bǔ)，通 過(guò)其自身的解旋酶活性，解開 siRNAs，通過(guò)反義siRNA鏈識(shí)別 目的mRNA片段，通過(guò)內(nèi)切酶活性 切割目的片段，接著再通過(guò)細(xì)胞外切 酶進(jìn)一步降解目的片段。同時(shí)， siRNA也可以阻遏3UTR具有短片 斷互補(bǔ)的mRNA的翻譯（off target）。 成熟的miRNAs則是通過(guò)與 miRNP核蛋白體復(fù)合物結(jié)合，識(shí) 別靶mRNA，并與之發(fā)生部分互 補(bǔ)，從而阻遏靶mRNA的翻譯。 在動(dòng)物中，成熟的單鏈miRNAs 與蛋白質(zhì)復(fù)合物miRNP結(jié)合，引 導(dǎo)這種復(fù)合物通過(guò)部分互補(bǔ)結(jié)合到 mRNA的3UTR（非編碼區(qū)域）， 從而阻遏翻譯。除此之外， miRNA也可以切割完全互補(bǔ)的 mRNA。 加工過(guò) 程 siRNA對(duì)稱地來(lái)源于雙鏈RNA的前 體的兩側(cè)臂 miRNA是不對(duì)稱加工，miRNA 僅是剪切pre-miRNA的一個(gè)側(cè)臂， 其他部分降解。 對(duì)RNA 的影響 降解目標(biāo)mRNA；影響mRNA的穩(wěn) 定性 在RNA代謝的各個(gè)層面進(jìn)行調(diào)控； 與mRNA的穩(wěn)定性無(wú)關(guān) 作用位 置 siRNA可作用于mRNA的任何部位miRNA主要作用于靶標(biāo)基因3- UTR區(qū) 生物學(xué) 意義 siRNA不參與生物生長(zhǎng)，是RNAi的 產(chǎn)物，原始作用是抑制轉(zhuǎn)座子活性和 病毒感染 miRNA主要在發(fā)育過(guò)程中起作用， 調(diào)節(jié)內(nèi)源基因表達(dá) 我國(guó)對(duì)于RNA