研究生實驗二PPT學(xué)習(xí)教案

1、會計學(xué)1 研究生實驗二研究生實驗二 ELISPOTELISPOT簡介簡介 ELISPOT ELISPOT是在是在ELISA ELISA 技術(shù)的基礎(chǔ)上建立的體技術(shù)的基礎(chǔ)上建立的體 外檢測特異性抗體分泌細(xì)胞和外檢測特異性抗體分泌細(xì)胞和 CK CK 分泌細(xì)胞的分泌細(xì)胞的 固相酶聯(lián)免疫斑點技術(shù)。固相酶聯(lián)免疫斑點技術(shù)。 可在單細(xì)胞水平檢測和計數(shù)特異性分泌抗體可在單細(xì)胞水平檢測和計數(shù)特異性分泌抗體 和細(xì)胞因子的細(xì)胞，并具有較高的特異性和敏和細(xì)胞因子的細(xì)胞，并具有較高的特異性和敏 感性，目前正被國內(nèi)外廣泛應(yīng)用。感性，目前正被國內(nèi)外廣泛應(yīng)用。 第1頁/共24頁 ELISPOTELISPOT技術(shù)的發(fā)展技術(shù)的發(fā)展

2、 l ELISPOTELISPOT是是2020多年前便己研發(fā)成功的老技術(shù)。多年前便己研發(fā)成功的老技術(shù)。Czerkinsky Czerkinsky 等人率先在等人率先在19831983年，運(yùn)用該技術(shù)成功地檢測出因受激而分年，運(yùn)用該技術(shù)成功地檢測出因受激而分 泌抗體的泌抗體的B B細(xì)胞頻率。細(xì)胞頻率。 l 早期早期ELISPOTELISPOT的分析條件不是非常理想，成對抗體的品質(zhì)、的分析條件不是非常理想，成對抗體的品質(zhì)、 呈色底膜的材質(zhì)等幾個技術(shù)性的問題無法解決。呈色底膜的材質(zhì)等幾個技術(shù)性的問題無法解決。 l 直到直到19961996年年P(guān)VDFPVDF薄膜的應(yīng)用（薄膜的應(yīng)用（Forsthuber

3、 et al., Forsthuber et al., Science, 1996Science, 1996），才解決了該技術(shù)因斑點呈色問題造成低），才解決了該技術(shù)因斑點呈色問題造成低 敏感度的缺失。與原來的標(biāo)準(zhǔn)膜面相比，敏感度的缺失。與原來的標(biāo)準(zhǔn)膜面相比，PVDFPVDF薄膜提供薄膜提供 1,0001,000倍的較大面積來吸附單株抗體，使倍的較大面積來吸附單株抗體，使T T細(xì)胞分泌的各類細(xì)胞分泌的各類 細(xì)胞因子能在細(xì)胞周圍就近被俘虜，讓呈色斑點集中、清細(xì)胞因子能在細(xì)胞周圍就近被俘虜，讓呈色斑點集中、清 晰、對比色高，大大的提高晰、對比色高，大大的提高ELISPOT CytokineELISP

4、OT Cytokine分析的敏感分析的敏感 度。度。 第2頁/共24頁 19961996年以來隨著抗體制備、年以來隨著抗體制備、PVDFPVDF膜等技術(shù)改良，膜等技術(shù)改良， ELISPOT ELISPOT 分析技術(shù)已經(jīng)逐漸達(dá)到科研人員的期待，它分析技術(shù)已經(jīng)逐漸達(dá)到科研人員的期待，它 已是當(dāng)世公認(rèn)最靈敏抗原特異性已是當(dāng)世公認(rèn)最靈敏抗原特異性T T細(xì)胞的體外檢測技術(shù)細(xì)胞的體外檢測技術(shù) 。 第3頁/共24頁 ELISPOTELISPOT與與ELISAELISA的比較的比較 它們最大的不同在于：它們最大的不同在于： l1. ELISA1. ELISA通過顯色反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上測定吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)曲通過顯色

5、反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上測定吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)曲 線比較得出可溶性蛋白總量。線比較得出可溶性蛋白總量。 l2. ELISPOT2. ELISPOT也是通過顯色反應(yīng)，在細(xì)胞分泌這種可溶性蛋白也是通過顯色反應(yīng)，在細(xì)胞分泌這種可溶性蛋白 的相應(yīng)位置上顯現(xiàn)清晰可辨的斑點，可直接在顯微鏡下人工計的相應(yīng)位置上顯現(xiàn)清晰可辨的斑點，可直接在顯微鏡下人工計 數(shù)斑點或通過數(shù)斑點或通過ELISPOTELISPOT分析系統(tǒng)對斑點進(jìn)行計數(shù)，分析系統(tǒng)對斑點進(jìn)行計數(shù)，1 1個斑點代表個斑點代表 1 1個細(xì)胞，從而計算出分泌該蛋白的細(xì)胞的頻率個細(xì)胞，從而計算出分泌該蛋白的細(xì)胞的頻率; ; l3. 3. 由于是單細(xì)胞水平檢測，由于是單細(xì)胞

6、水平檢測，ELISPOTELISPOT比比ELISAELISA和有限稀釋法等和有限稀釋法等 更靈敏，能從更靈敏，能從2020萬萬-30-30萬細(xì)胞中檢出萬細(xì)胞中檢出1 1個分泌該蛋白的細(xì)胞。個分泌該蛋白的細(xì)胞。 l4. 4. 刺激劑激活細(xì)胞時，不會影響活化細(xì)胞分泌細(xì)胞因子。刺激劑激活細(xì)胞時，不會影響活化細(xì)胞分泌細(xì)胞因子。 第4頁/共24頁 10106 6抗原呈遞細(xì)胞（抗原呈遞細(xì)胞（APCAPC）中混）中混 入特定數(shù)量的入特定數(shù)量的IFN-IFN-+ +的的T T淋巴淋巴 細(xì)胞細(xì)胞 ，經(jīng)下列方法檢測：，經(jīng)下列方法檢測： ELISPOTELISPOT 細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色（細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色（FAC

7、SFACS ） ELISAELISA X X坐標(biāo)：坐標(biāo)： 10106 6 APC APC中實際中實際IFN-IFN-+ +T T細(xì)胞數(shù)量細(xì)胞數(shù)量 Y Y坐標(biāo)：坐標(biāo)： 各檢測方法的檢測結(jié)果各檢測方法的檢測結(jié)果 ELISPOT/FACS/ELISA ELISPOT/FACS/ELISA 檢測精確度比較檢測精確度比較 第5頁/共24頁 BD ELISPOT 技術(shù)優(yōu)勢技術(shù)優(yōu)勢 l單細(xì)胞水平檢測分泌到的胞外細(xì)胞因子單細(xì)胞水平檢測分泌到的胞外細(xì)胞因子 l觀察活細(xì)胞應(yīng)答（動態(tài)）結(jié)果能計數(shù)效應(yīng)細(xì)胞，分析效應(yīng)觀察活細(xì)胞應(yīng)答（動態(tài)）結(jié)果能計數(shù)效應(yīng)細(xì)胞，分析效應(yīng) 分子產(chǎn)生頻率分子產(chǎn)生頻率 of Spots: cel

8、l numbers/ frequencyof Spots: cell numbers/ frequency s size of Spots: ize of Spots: relative relative amount producedamount produced l高靈敏度高靈敏度, ,高產(chǎn)量高產(chǎn)量 , ,大容量大容量T T 細(xì)胞分析成為可行。細(xì)胞分析成為可行。 l只需要少量樣本即可進(jìn)行檢測分析。只需要少量樣本即可進(jìn)行檢測分析。 l淋巴細(xì)胞在淋巴細(xì)胞在 ELISPOT ELISPOT 分析后依然存活。這使得分析之后可分析后依然存活。這使得分析之后可 以用于進(jìn)行增殖，用于更進(jìn)一步的分析、克隆

9、或者低溫儲以用于進(jìn)行增殖，用于更進(jìn)一步的分析、克隆或者低溫儲 藏成為可能。藏成為可能。 第6頁/共24頁 BD ELISPOT 應(yīng)用應(yīng)用 l移植研究移植研究 l疫苗開發(fā)疫苗開發(fā) - -亦可評估疫苗效力，或是疫苗注射路徑影響亦可評估疫苗效力，或是疫苗注射路徑影響 lTh0/Th1/Th2Th0/Th1/Th2細(xì)胞轉(zhuǎn)換分析細(xì)胞轉(zhuǎn)換分析 l自體免疫研究自體免疫研究 免疫調(diào)節(jié)及免疫治療研究免疫調(diào)節(jié)及免疫治療研究 l癌癥研究癌癥研究 - -腫瘤反應(yīng)腫瘤反應(yīng)T T細(xì)胞作用細(xì)胞作用 l過敏機(jī)制探討過敏機(jī)制探討 IL-4 IL-4誘導(dǎo)免疫球蛋白亞型轉(zhuǎn)換，其它參與誘導(dǎo)免疫球蛋白亞型轉(zhuǎn)換，其它參與 過敏機(jī)制之細(xì)胞

10、因子研究過敏機(jī)制之細(xì)胞因子研究 l傳染疾病研究傳染疾病研究 l體液免疫研究體液免疫研究 B B細(xì)胞免疫球蛋白及特定亞型反應(yīng)的進(jìn)展研細(xì)胞免疫球蛋白及特定亞型反應(yīng)的進(jìn)展研 究究 第7頁/共24頁 第8頁/共24頁 1 1針對被分析物的針對被分析物的 捕獲抗體包被在貼有捕獲抗體包被在貼有 PVDFPVDF膜的微孔板上膜的微孔板上 2 2用完全培養(yǎng)基將用完全培養(yǎng)基將 板底封閉板底封閉 第9頁/共24頁 3 3細(xì)胞懸液加入細(xì)胞懸液加入AgAg或有絲分或有絲分 裂素等刺激劑孵育一定時間以裂素等刺激劑孵育一定時間以 激活細(xì)胞激活細(xì)胞細(xì)胞分泌的蛋白細(xì)胞分泌的蛋白 緊靠在細(xì)胞周圍，與已固定的緊靠在細(xì)胞周圍，與已

11、固定的 捕獲抗體結(jié)合捕獲抗體結(jié)合 4 4孵育一定時間后洗去孵育一定時間后洗去 細(xì)胞細(xì)胞, ,分泌出的細(xì)胞因子分泌出的細(xì)胞因子 會被會被PVDFPVDF薄膜上特異抗體薄膜上特異抗體 捕獲捕獲 第10頁/共24頁 5 5加入生物素標(biāo)記的針對加入生物素標(biāo)記的針對 被分析物的檢測抗體被分析物的檢測抗體檢檢 測抗體與被分析物結(jié)合，形測抗體與被分析物結(jié)合，形 成成 夾心三明治夾心三明治復(fù)合物復(fù)合物 6 6加入與辣根過氧化物酶加入與辣根過氧化物酶(HRP)(HRP) 連接的親和素連接的親和素親和素與檢測親和素與檢測 抗體上的生物素結(jié)合抗體上的生物素結(jié)合 7.7.加入底物與酶發(fā)生顯色反應(yīng)，監(jiān)加入底物與酶發(fā)生顯

12、色反應(yīng)，監(jiān) 測顏色斑點的形成，終止底物反應(yīng)測顏色斑點的形成，終止底物反應(yīng) ，室溫風(fēng)干，避光保存于封口塑料，室溫風(fēng)干，避光保存于封口塑料 袋中直至分析顏色斑點袋中直至分析顏色斑點 第11頁/共24頁 第12頁/共24頁 Coating Ab 包被培養(yǎng)板 0.05%PBS-Tween20(PBST) 洗板5次 每孔加入1%BSA阻斷 按實驗設(shè)計 加入含或不含刺激劑的培養(yǎng)液 及一定數(shù)目細(xì)胞孵育5-24小時 40C過夜 370C孵育1小時 取外周血單核細(xì)胞 或脾淋巴細(xì)胞 根據(jù)實驗要求， 培養(yǎng)液中加入 所需刺激物， 預(yù)先將所檢測細(xì)胞 孵育24-42小時 無菌 直接取外周血 單核細(xì)胞或 脾淋巴細(xì)胞 或者

13、BD ELISPOT 基本流程基本流程 第13頁/共24頁 去除細(xì)胞，加入冰凍去離子水200ul/孔， 培養(yǎng)板置冰上10分鐘 加入生物素標(biāo)記 的detector Ab 加入酶標(biāo)抗生物素抗體(GABA) 40C暗處混合顯色劑I和II, 加入顯色劑I/II, 暗處室溫孵育20-30分鐘 PBST洗板10次 370C孵育1小時后，PBST洗板5次 370C孵育1小時后，PBST洗板5次 顯微鏡下觀察至斑點形成， 去離子水清洗培養(yǎng)板 室溫干燥后 在倒置顯微鏡下觀察結(jié)果 非無菌 第14頁/共24頁 ELISPOT ELISPOT 結(jié)果顯示結(jié)果顯示 第15頁/共24頁 Blank controls: G1

14、-9: 無刺激劑的細(xì)胞 H1-9: 無細(xì)胞的刺激劑 樣本孔出現(xiàn)顏色斑點 Usu. 1020 mm 第16頁/共24頁 v在顯微鏡下計數(shù)，一個斑點代表一個分泌細(xì)胞在顯微鏡下計數(shù)，一個斑點代表一個分泌細(xì)胞 v用用Elispot Reader Elispot Reader 進(jìn)行分析對斑點自動計數(shù)，進(jìn)行分析對斑點自動計數(shù)， 并做出不同大小斑點的分布圖，快速、精確、還能并做出不同大小斑點的分布圖，快速、精確、還能 平衡背景信號。平衡背景信號。 v軟件自動計算出細(xì)胞的分泌頻率軟件自動計算出細(xì)胞的分泌頻率 第17頁/共24頁 第18頁/共24頁 l5.5.背景過高的克服方法：背景過高的克服方法： 增加洗滌的

15、次數(shù)。增加洗滌的次數(shù)。 在顯色之前用在顯色之前用PBSPBS洗滌以去除洗滌以去除Tween-20Tween-20，防止對顯色的干擾。，防止對顯色的干擾。 如果需要如果需要, ,增加干燥增加干燥ELISPOTELISPOT板的時間。板的時間。 徹底洗去細(xì)胞減少非特異性斑點。徹底洗去細(xì)胞減少非特異性斑點。 掌握好顯色時間，防止過度顯色。掌握好顯色時間，防止過度顯色。 l6.6.實驗結(jié)束后將實驗結(jié)束后將ELISPOTELISPOT板室溫晾干，不能高于板室溫晾干，不能高于3737防止損壞防止損壞 PVDFPVDF膜。膜。 l7.7.待待ELISPOTELISPOT板干燥后，將其保存在密封的塑料袋中防止

16、褪色板干燥后，將其保存在密封的塑料袋中防止褪色 。 BD ELISPOT BD ELISPOT 操作注意事項操作注意事項2 2 第19頁/共24頁 第20頁/共24頁 Bioreader 3000Bioreader 3000TM TM PRO PRO 酶聯(lián)斑點自動圖象分析儀酶聯(lián)斑點自動圖象分析儀 適用于分析：適用于分析： 酶聯(lián)斑點酶聯(lián)斑點( (E El lispot)ispot) 克隆形成（克隆形成（CFUCFU） 病毒斑病毒斑 第21頁/共24頁 第22頁/共24頁 ELISPOTELISPOT酶聯(lián)斑點分析軟酶聯(lián)斑點分析軟 件和件和ELISPOTELISPOT計數(shù)分析軟計數(shù)分析軟 件件 7 7、 單個孔的圖片或整塊板的圖片都可直接，復(fù)制或?qū)氲絾蝹€孔的圖片或整塊板的圖片都可直接，復(fù)制或?qū)氲?PhotoshopPhotoshop、PowerPointPowerPoint、WordWord、等軟件中進(jìn)行編輯，同時、等軟件中進(jìn)行編輯，同時 可將圖片轉(zhuǎn)換成可將圖片轉(zhuǎn)換成TIFFTIFF或者或者JPEGJPEG格式保存。格式保存。 8 8、 整塊板或單個孔的數(shù)據(jù)表格都能保存、打印，并且可直接整塊板或單個