植物的器官培養(yǎng)[共71頁]

1、第六章第六章 植物的器官培養(yǎng)植物的器官培養(yǎng) 【學習目的要求【學習目的要求】 1 1一般掌握離體根培養(yǎng)的取材部位和培養(yǎng)基的選擇。 2 2掌握莖尖培養(yǎng)的種類和操作步驟。 3 3掌握莖段培養(yǎng)中材料的選擇、處理及培養(yǎng)基的調(diào) 整。 4 4掌握離體葉片的培養(yǎng)步驟。 5 5一般掌握胚胎培養(yǎng)的類型與各自的注意事項。 6.掌握如何防止培養(yǎng)過程中外植體的褐化和玻璃化。 7.掌握植物器官組織培養(yǎng)常見問題的原因及對策 【主要內(nèi)容主要內(nèi)容】 第一節(jié)營養(yǎng)器官培養(yǎng) 一、離體根培養(yǎng)一、離體根培養(yǎng) 二、莖尖培養(yǎng)二、莖尖培養(yǎng) 三、莖段培養(yǎng)三、莖段培養(yǎng) 四、離體葉培養(yǎng)四、離體葉培養(yǎng) 第二節(jié)生殖器官培養(yǎng) 一、花器官和種子培養(yǎng)一、花器

2、官和種子培養(yǎng) 二、胚胎培二、胚胎培 三、胚珠培養(yǎng)三、胚珠培養(yǎng) 第三節(jié) 植物器官組織培養(yǎng)常見問題及對策 第一節(jié)營養(yǎng)器官培養(yǎng)第一節(jié)營養(yǎng)器官培養(yǎng) 一、離體根培養(yǎng)一、離體根培養(yǎng) 離體根培養(yǎng)特點：因為根系生長快，離體根培養(yǎng)特點：因為根系生長快， 代謝強，變異小，加上無代謝強，變異小，加上無 菌，不受微生物干擾，可根據(jù)研究需要，菌，不受微生物干擾，可根據(jù)研究需要， 改變培養(yǎng)的成分來研改變培養(yǎng)的成分來研 究其營養(yǎng)吸收、生長和代謝的變化。究其營養(yǎng)吸收、生長和代謝的變化。 應(yīng)用：研究根系生理和代謝變化；也可由根細胞再生成植株，不應(yīng)用：研究根系生理和代謝變化；也可由根細胞再生成植株，不 僅證明根細胞的全能性，也產(chǎn)

3、生了無性繁殖系，用于生產(chǎn)實踐僅證明根細胞的全能性，也產(chǎn)生了無性繁殖系，用于生產(chǎn)實踐。 一、離體根培養(yǎng)一、離體根培養(yǎng) 培養(yǎng)方法：培養(yǎng)方法： 1 1培養(yǎng)基培養(yǎng)基 用無機離子濃度低的用無機離子濃度低的WhiteWhite培養(yǎng)培養(yǎng) 基，也可用基，也可用MSMS、B5B5等，但濃度為等，但濃度為2/32/3或或1/21/2。 WhiteWhite培養(yǎng)基配方為：硝酸鉀培養(yǎng)基配方為：硝酸鉀8080，硫酸鎂，硫酸鎂720720， 硫酸錳硫酸錳7 7，硫酸銅，硫酸銅0.030.03，碘化鉀，碘化鉀0.750.75， Vpp0.5,VB6 0.1,VB1 0.1,Vpp0.5,VB6 0.1,VB1 0.1,甘氨

4、酸甘氨酸3(mg/L) 3(mg/L) 一、離體根培養(yǎng)一、離體根培養(yǎng) 2無性系的建立和培養(yǎng)、應(yīng)用 1)將種子進行表面消毒，在無菌條件下用濕布培養(yǎng)萌發(fā)，至根伸長1.0cm以上。 2)從根尖一端切取長1.2cm的尖端，接種于培養(yǎng)基中。3)培養(yǎng)物生長甚快， 幾天后發(fā) 育出側(cè)根。待側(cè)根生長約一周后，即切取側(cè)根的根尖進行接種培養(yǎng)，如此反復(fù)，得 到離體根的無性系。 4)這種根可用來進行根系生理生化和代謝方面的實驗研究。如營養(yǎng)選擇吸收、根尖伸長 生長、生長素對伸長的影響等 5)培養(yǎng)條件為暗光、2527。 3植株再生培養(yǎng) 第一步誘導(dǎo)形成愈傷組織。 第二步在再分化培養(yǎng)基上誘導(dǎo)芽的分 化、再分化成小植株。 二、二

5、、 莖尖培養(yǎng)莖尖培養(yǎng) 概念：是切取莖尖部分或莖尖分生組織部分，進行培養(yǎng)的過程。概念：是切取莖尖部分或莖尖分生組織部分，進行培養(yǎng)的過程。 這是組織培養(yǎng)中用得較多的外植體。因為莖尖分生區(qū)是三個分這是組織培養(yǎng)中用得較多的外植體。因為莖尖分生區(qū)是三個分 區(qū)的主要部分。區(qū)的主要部分。 莖尖培養(yǎng)可分為微莖尖培養(yǎng)和普通莖尖培養(yǎng)。莖尖培養(yǎng)可分為微莖尖培養(yǎng)和普通莖尖培養(yǎng)。 1.1.微莖尖：指帶有微莖尖：指帶有1-21-2個葉原基的生長錐，其長度不超過個葉原基的生長錐，其長度不超過0.5mm0.5mm。 2.2.普通莖尖：指取幾普通莖尖：指取幾mmmm到幾十到幾十mmmm長的頂芽尖及側(cè)芽尖。這里主要介長的頂芽尖及

6、側(cè)芽尖。這里主要介 紹后者紹后者 特點：技術(shù)簡單，特點：技術(shù)簡單， 操作方便，易成活和分化，成苗時間短。操作方便，易成活和分化，成苗時間短。 步驟如下：步驟如下： 1取材：挑選潔凈、無污染，生長不久的莖，從植物的莖、藤或匍匐枝 上切取2cm以上的頂梢。 木本植物可事先對莖尖噴幾次滅菌藥劑。 用于普通莖尖培養(yǎng)。 2消毒 將采到的莖尖切成0.51.0cm長，并將大葉除去，休眠芽預(yù)先 剝除鱗片。 將莖尖置于流水沖洗干凈，再在95%的酒精中處理30秒， 然后在稀釋20倍的次氯酸鈉中浸5分鐘，最后用無菌水沖洗數(shù)次， 瀝干后準備接種。 3 接種 為了減少污染，在接種前再剝掉一些幼葉，使莖尖為0.5cm大

7、小左右。 用作快速繁殖。 注意：一要防褐化。接種時，不用銹刀，動作敏捷， 隨切隨接，用 15%VC液浸泡處理。二要防干燥 4 4培養(yǎng)培養(yǎng) （1 1）培養(yǎng)基：）培養(yǎng)基： 采用采用MSMS培養(yǎng)基或略加修改，或補加其它物培養(yǎng)基或略加修改，或補加其它物 質(zhì)。也可用其它培養(yǎng)基如質(zhì)。也可用其它培養(yǎng)基如White,HellerWhite,Heller等。等。 培養(yǎng)基中生長素是必須的，如培養(yǎng)基中生長素是必須的，如2,4-D2,4-D，IAA,IAA, NAANAA等，但等，但 是濃度不能太高，一般用是濃度不能太高，一般用0.1mg/L0.1mg/L左右，若高易產(chǎn)生畸左右，若高易產(chǎn)生畸 形芽或形成愈傷組織。形芽

8、或形成愈傷組織。 （2 2）培養(yǎng)問題處理：）培養(yǎng)問題處理： 莖尖在培養(yǎng)過程中會出現(xiàn)生長太慢、莖尖在培養(yǎng)過程中會出現(xiàn)生長太慢、 生長太快生長太快 和生長正常等三種類型。和生長正常等三種類型。 I I 生長太慢：接種后莖尖不增大，只是莖尖逐漸生長太慢：接種后莖尖不增大，只是莖尖逐漸 變綠，出現(xiàn)綠色小點，細胞逐漸老化而進入休變綠，出現(xiàn)綠色小點，細胞逐漸老化而進入休 眠狀態(tài)，眠狀態(tài)， 或者逐漸變褐死亡。引起原因的是或者逐漸變褐死亡。引起原因的是 生長素濃度太低，或是溫度過低或過高。生長素濃度太低，或是溫度過低或過高。 （2 2）培養(yǎng)問題處理：）培養(yǎng)問題處理： II II 生長太快型：是接種后莖尖迅速增

9、大，在莖生長太快型：是接種后莖尖迅速增大，在莖 尖基部產(chǎn)生愈傷組織，尖基部產(chǎn)生愈傷組織， 并迅速增殖，而莖并迅速增殖，而莖 尖不伸長，久之莖尖也形成愈傷組織，從而尖不伸長，久之莖尖也形成愈傷組織，從而 喪失發(fā)育成苗的能力。引起原因一是生長素喪失發(fā)育成苗的能力。引起原因一是生長素 濃度過高，引起細胞瘋狂分裂而導(dǎo)致愈傷組濃度過高，引起細胞瘋狂分裂而導(dǎo)致愈傷組 織的形成?？椀男纬?。 二是光照太弱或溫度太高。二是光照太弱或溫度太高。 （2 2）培養(yǎng)問題處理：）培養(yǎng)問題處理： III III 生長正常型是接種后莖尖基部稍增大并形成生長正常型是接種后莖尖基部稍增大并形成 少量愈傷組織，少量愈傷組織， 莖尖

10、顏色逐漸變綠，并逐莖尖顏色逐漸變綠，并逐 漸伸長，葉原基發(fā)育成可見的小葉，進而形漸伸長，葉原基發(fā)育成可見的小葉，進而形 成小苗。成小苗。 （3 3）培養(yǎng)條件：）培養(yǎng)條件： o 培養(yǎng)時每天光照可長一些，最長達培養(yǎng)時每天光照可長一些，最長達16h/d16h/d，照度，照度 1500-3000Lx1500-3000Lx，溫度，溫度252522。并且根據(jù)不同植物種。并且根據(jù)不同植物種 類，類， 或者隨培養(yǎng)過程的不同，給予適當?shù)臅円箿鼗蛘唠S培養(yǎng)過程的不同，給予適當?shù)臅円箿?差等處理。差等處理。 o 注意：防培養(yǎng)基干燥，由于莖尖培養(yǎng)時間較長，通注意：防培養(yǎng)基干燥，由于莖尖培養(yǎng)時間較長，通 過定期轉(zhuǎn)移、嚴加

11、封口等。過定期轉(zhuǎn)移、嚴加封口等。 一般莖尖培養(yǎng)在一般莖尖培養(yǎng)在 天左右可直接長成新梢。天左右可直接長成新梢。 （4 4）繼代培養(yǎng)）繼代培養(yǎng) 用莖段切割法。用莖段切割法。 繼代培養(yǎng)可用繼代培養(yǎng)可用MS0MS0培養(yǎng)基?；蛴蒙L物質(zhì)較培養(yǎng)基?；蛴蒙L物質(zhì)較 低的低的MSMS培養(yǎng)基。培養(yǎng)基。 也可邊增殖邊生根培養(yǎng)也可邊增殖邊生根培養(yǎng) （5 5）誘導(dǎo)生根）誘導(dǎo)生根 I） 用1/2 MS培養(yǎng)基， 并只加入生長素類調(diào)節(jié)物質(zhì)， 如NAA 、IBA等。注意濃度 II）也可將切下的新梢基部浸入50或100ppm的IBA溶液 處理48小時，然后轉(zhuǎn)移到無激素的生根培養(yǎng)基中。 III）注意較高濃度的生長素對生根有抑制作

12、用。 5.5.移栽馴化移栽馴化 指標：發(fā)現(xiàn)新梢基部生有較濃密的不定根，生長健壯而發(fā)達， 長度在1cm以內(nèi)。 移栽：可先進行幾天煉苗程， 取出洗培養(yǎng)基栽入馴化器 皿基質(zhì)蛭石：珍珠巖：草炭土為1:1:0.5。 栽后管理：1)初期保持濕度。 基質(zhì)澆透水，床面澆濕， 搭 小拱棚等，并且初期要常噴霧處理。 2)后期逐漸減少濕度。拱棚兩端打開通風，減少噴水次數(shù)。 以后揭去拱棚，并控制水分。 溫度管理上要掌握適宜的生根溫度，最適宜的溫度是1620， 春季地溫較低時，可用電熱線來加溫。 光照：初期弱光照，加蓋遮陽網(wǎng)或報紙等，后期可直接利用自 然光照。 移栽前的工作移栽前的工作 o （1 1）培養(yǎng)瓶生壯苗）培養(yǎng)

13、瓶生壯苗 加入生長控制劑，如多效唑，加入生長控制劑，如多效唑， B9B9， CCCCCC，其，其 作用是使苗粗壯，葉綠素增加。作用是使苗粗壯，葉綠素增加。 （2 2）煉苗）煉苗 將瓶蓋打開，打破無菌環(huán)境，濕度逐漸下降，光照逐將瓶蓋打開，打破無菌環(huán)境，濕度逐漸下降，光照逐 漸加強，使之形成新的功能強的根和葉片。一般煉苗時漸加強，使之形成新的功能強的根和葉片。一般煉苗時 間為間為101030D30D。 移栽時應(yīng)注意的問題移栽時應(yīng)注意的問題 （1 1）防止菌類滋生）防止菌類滋生 苗底部培養(yǎng)基要洗干凈苗底部培養(yǎng)基要洗干凈 殺菌劑處理苗的根部殺菌劑處理苗的根部 定時用殺菌劑處理種植基質(zhì)定時用殺菌劑處理種

14、植基質(zhì) 常用殺菌劑：常用殺菌劑：KMnO4KMnO4、百菌清、多菌靈、托、百菌清、多菌靈、托 不津，使用濃度不津，使用濃度0.10.1 （2 2）保持小苗水分供給平衡）保持小苗水分供給平衡 （3 3）移栽時選擇合理的種植基質(zhì)）移栽時選擇合理的種植基質(zhì) 基質(zhì)要疏松透氣，有適宜的保水性，易于基質(zhì)要疏松透氣，有適宜的保水性，易于 滅菌處理，不利于雜菌滋生：常用珍珠巖，椰滅菌處理，不利于雜菌滋生：常用珍珠巖，椰 糠，蛭石，細沙，泥炭?？罚问?，細沙，泥炭。 泥炭 珍珠巖 椰糠 (4)注意一定光照，溫度條件注意一定光照，溫度條件 一般強度較高的慢射光較好一般強度較高的慢射光較好 三、三、 莖段培養(yǎng)莖段培

15、養(yǎng) 概念：指不帶芽和帶概念：指不帶芽和帶1 1個以上定芽的，包括塊莖、個以上定芽的，包括塊莖、 球莖在內(nèi)的幼莖切段的無菌培養(yǎng)。球莖在內(nèi)的幼莖切段的無菌培養(yǎng)。 培養(yǎng)目的：快速繁殖。也可研究莖細胞的生理，培養(yǎng)目的：快速繁殖。也可研究莖細胞的生理， 以及篩選突變體育種。以及篩選突變體育種。 快繁優(yōu)點：培養(yǎng)技術(shù)簡單易行，繁殖速度較快；快繁優(yōu)點：培養(yǎng)技術(shù)簡單易行，繁殖速度較快； 芽生芽方式增殖的苗木質(zhì)量好，且無病，性芽生芽方式增殖的苗木質(zhì)量好，且無病，性 狀均一；解決不能用種子繁殖植物的快速繁殖狀均一；解決不能用種子繁殖植物的快速繁殖 問題等。問題等。 1.1.材料選擇和處理材料選擇和處理 取生長健壯無

16、病蟲的幼嫩枝條或鱗莖盤，木本則取當年生嫩枝或一年 生枝條, 剪去葉片，剪成34cm的小段。 注意：1）盡力取頂部莖切段和頂芽， 但由于頂芽少可利用腋芽，但 盡力用莖上部的腋芽。 2）盡量在生長期取芽，休眠期成活率降低。如蘋果在36月取 材的成活率為60%，711月下降到10%，122月都在10%以下。 1.1.材料選擇和處理材料選擇和處理 在自來水中沖洗在自來水中沖洗1 13 3小時，小時， 用用75%75%酒酒 精滅菌精滅菌30306060秒，秒， 再用再用0.1%0.1%升汞浸泡升汞浸泡3 38 8 分鐘，分鐘， 或用飽和漂白粉浸泡或用飽和漂白粉浸泡10102020分鐘，分鐘， 因材料老嫩

17、和蠟質(zhì)多少而定時間。因材料老嫩和蠟質(zhì)多少而定時間。 最后用最后用 無菌水沖洗數(shù)次，以備接種。無菌水沖洗數(shù)次，以備接種。 2 2培養(yǎng)過程培養(yǎng)過程 o 培養(yǎng)選MS培養(yǎng)基，加入3%蔗糖，用0.7%的瓊脂固化。 培養(yǎng)條件保持25左右，給予充分的光照和光期。 o 培養(yǎng)物的變化：1）基部切口上長出愈傷組織，呈現(xiàn)稍 許增大，控制不要過大。2）而芽開始長長，有時會出 現(xiàn)叢生芽，培養(yǎng)方式或是培養(yǎng)出芽梢或是培養(yǎng)芽叢，從 而得到無菌苗。 o 培養(yǎng)基：促進腋芽增殖用6-BA是最為有效的，依次為Kt 和Zt等。生長素雖不能促進腋芽增殖，但可改善苗的生 長，也要適量加入。GA對芽伸長有促進作用。 2 2培養(yǎng)過程培養(yǎng)過程

18、p繼代擴繁：包括二種途徑，一是促進腋芽的快速生長； 二是誘 導(dǎo)形成大量不定芽。第一種途徑的好處是不會產(chǎn)生變異， 能保 持品種優(yōu)良特性。且方法簡便，可在各種植物上使用，每年從一 個芽可增殖10萬株以上。第二種途徑雖會產(chǎn)生變異，繁殖系數(shù)較 高，適于多數(shù)植物。 p生根培養(yǎng)和移栽馴化與莖尖培養(yǎng)相似，不再重復(fù)。 p同樣注意馴化管理。要進行煉苗，小心移栽，初期濕度要大，基 質(zhì)通氣濕潤，保濕保溫，特別要精心管理等。 四、四、 離體葉培養(yǎng)離體葉培養(yǎng) p 離體葉培養(yǎng):包括葉原基、葉柄、葉鞘、葉片、子 葉在內(nèi)的葉組織的無菌培養(yǎng)。 它大多經(jīng)脫分化形 成愈傷組織，再經(jīng)再分化生出不定芽和不定根。 p 應(yīng)用：不僅可用于研

19、究形態(tài)建成、 光合作用、葉 綠素形成等理論問題，而且也是繁殖稀有名貴品種 的有效手段 四、四、 離體葉培養(yǎng)離體葉培養(yǎng) o葉培養(yǎng)特點：材料來源廣泛，數(shù)量大，容易培養(yǎng)，尤其對木本葉培養(yǎng)特點：材料來源廣泛，數(shù)量大，容易培養(yǎng)，尤其對木本 植物，生成的愈傷組織完整，數(shù)量多，較迅速等。植物，生成的愈傷組織完整，數(shù)量多，較迅速等。 o葉片再生能力：葉片再生能力： 以羊齒植物最多，雙子葉植物次之，單子以羊齒植物最多，雙子葉植物次之，單子 葉植物最少。葉植物最少。 o再生方式：再生方式： 一種是直接誘導(dǎo)形成不定芽，另一種是先誘導(dǎo)形一種是直接誘導(dǎo)形成不定芽，另一種是先誘導(dǎo)形 成愈傷組織，再經(jīng)愈傷組織分化成植株。成

20、愈傷組織，再經(jīng)愈傷組織分化成植株。 葉的離體培養(yǎng)技術(shù)如下：葉的離體培養(yǎng)技術(shù)如下： 材料選擇及滅菌 選擇健康潔凈的植株，取其 較幼嫩葉片，沖洗干凈，用70%酒精漂洗約10秒， 再在飽和漂白粉液中浸315分鐘，或在0.1%升汞 中浸35分鐘，以前者為佳。用無菌水沖洗數(shù)次， 再放在無菌的干濾紙上吸干水分，以供接種用。 對一些粗糙或帶茸毛的葉片要延長滅菌時間。注意 要選擇成熟的葉片。 葉的離體培養(yǎng)技術(shù)如下：葉的離體培養(yǎng)技術(shù)如下： .接種 將葉片切成約0.5cm見方小塊或圓 片及薄片（如葉柄和子葉），注意選擇切塊 位置。MS培養(yǎng)基附加BA13，NAA0.251。 3.培養(yǎng) 培養(yǎng)條件為每天1012小時光照

21、， 光強15003000Lx。 3.培養(yǎng) 1） 培養(yǎng)24周，葉切塊開始增厚腫大， 進而形成愈傷組織。 2）轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，其培養(yǎng) 基的BA含量為2左右，約再過10天左右，愈 傷組織開始轉(zhuǎn)綠出現(xiàn)綠色芽點， 形成不定 芽。通過繼代培養(yǎng)和生根培養(yǎng)，完成整個組 培過程。 3.培養(yǎng) o 葉的培養(yǎng)比胚，莖尖和莖段培養(yǎng)難度大。首 先要選用易培養(yǎng)成功的葉組織， 如幼葉比 成熟葉易培養(yǎng)，子葉比葉片易培養(yǎng)。其次要 添加適當?shù)纳L素和細胞分裂素濃度，保證 利于葉組織的脫分化和再分化。 第二節(jié)生殖器官培養(yǎng) 一、一、 花器官和種子培養(yǎng)花器官和種子培養(yǎng) （一）花器官培養(yǎng)（一）花器官培養(yǎng) 花器官培養(yǎng)花器官培養(yǎng)：

22、 指整個花器及其組成部分如花托、花瓣、花絲、指整個花器及其組成部分如花托、花瓣、花絲、 花柄、子房、花藥等的無菌培養(yǎng)。子房和花藥培養(yǎng)另有專門敘花柄、子房、花藥等的無菌培養(yǎng)。子房和花藥培養(yǎng)另有專門敘 述。述。 應(yīng)用：應(yīng)用：理論上通過離體花芽培養(yǎng)可了解整體植物和內(nèi)源激素在理論上通過離體花芽培養(yǎng)可了解整體植物和內(nèi)源激素在 花芽性別決定中所起的作用?；ㄑ啃詣e決定中所起的作用。 可以了解花器各部分對果實和可以了解花器各部分對果實和 種子發(fā)育的作用，種子發(fā)育的作用， 以及內(nèi)、外源激素在果實種子發(fā)育過程中以及內(nèi)、外源激素在果實種子發(fā)育過程中 的調(diào)控作用。生產(chǎn)上可用于珍貴品種的擴大繁殖。的調(diào)控作用。生產(chǎn)上可用

23、于珍貴品種的擴大繁殖。 培養(yǎng)方法如下：培養(yǎng)方法如下： 1取材 從健壯植株上取未開放的花蕾，已經(jīng)開 花的不宜用，因為消毒困難。 先用75%酒精消毒 約30秒鐘，再用飽和漂白粉浸1015分鐘，取出用 無菌水沖洗數(shù)次。 2接種培養(yǎng) 用整個花蕾培養(yǎng)時，只要把花梗插 入培養(yǎng)基中。若用花器， 則分別取下切成小片。 2接種培養(yǎng) I) I) 培養(yǎng)基：培養(yǎng)基： MSMS、 B5B5等。若讓花器官育成小植株，要用誘導(dǎo)培養(yǎng)等。若讓花器官育成小植株，要用誘導(dǎo)培養(yǎng) 基，加入生長激素和細胞分裂素，先形成愈傷組織或胚狀體，基，加入生長激素和細胞分裂素，先形成愈傷組織或胚狀體， 再分化培養(yǎng)成植株。如菊花的花瓣片接在含再分化培

24、養(yǎng)成植株。如菊花的花瓣片接在含6-BA 2mg/L6-BA 2mg/L、 NAA NAA 0.20.2的的MSMS培養(yǎng)基上，形成少量愈傷組織。再經(jīng)培養(yǎng)基上，形成少量愈傷組織。再經(jīng)1 1個月就分化出綠色個月就分化出綠色 芽點，再切割轉(zhuǎn)接，可形成大量無根苗，用于繁殖。芽點，再切割轉(zhuǎn)接，可形成大量無根苗，用于繁殖。 II) 26II) 261500Lx1500Lx光照，每天光照光照，每天光照1010小時，小時， 培養(yǎng)約培養(yǎng)約2 2周周 （二）種子培養(yǎng)（二）種子培養(yǎng) o種子培養(yǎng)是指受精后發(fā)育完全的成熟種子和發(fā)育不完全的未成種子培養(yǎng)是指受精后發(fā)育完全的成熟種子和發(fā)育不完全的未成 熟種子的無菌培養(yǎng)。這項技

25、術(shù)廣泛地應(yīng)用于花卉、蔬菜、果樹、熟種子的無菌培養(yǎng)。這項技術(shù)廣泛地應(yīng)用于花卉、蔬菜、果樹、 農(nóng)作物等的種子培養(yǎng)之中。農(nóng)作物等的種子培養(yǎng)之中。 o優(yōu)點：可以打破種子休眠，特別對一些休眠期長的植物；優(yōu)點：可以打破種子休眠，特別對一些休眠期長的植物； 可可 以作為大量生產(chǎn)試管苗的好材料，它分化容易，以作為大量生產(chǎn)試管苗的好材料，它分化容易， 無菌操作方無菌操作方 便。可使遠緣雜交產(chǎn)生的雜種敗育種子，正常萌發(fā)產(chǎn)生第二代便?？墒惯h緣雜交產(chǎn)生的雜種敗育種子，正常萌發(fā)產(chǎn)生第二代 植株。植株。 培養(yǎng)技術(shù)如下：培養(yǎng)技術(shù)如下： 1種子滅菌 種皮厚或不飽滿的種子，宜用 0.1%升汞消毒1020分鐘。幼嫩的或發(fā)育不 全

26、的種子，宜用飽和漂白粉消毒1530分鐘。 若種子上有絨毛或蠟質(zhì)，應(yīng)先用95%酒精或 吐溫40處理，提高消毒效果。對殼厚難萌發(fā) 的種子，可去殼培養(yǎng)。 培養(yǎng)技術(shù)如下：培養(yǎng)技術(shù)如下： 2 2培養(yǎng)基培養(yǎng)基 若以種子萌發(fā)為目的，培養(yǎng)基可不加或少加生長若以種子萌發(fā)為目的，培養(yǎng)基可不加或少加生長 激素。對某些發(fā)育不全的無胚乳的種子培養(yǎng)，應(yīng)提供適激素。對某些發(fā)育不全的無胚乳的種子培養(yǎng)，應(yīng)提供適 當?shù)纳L激素。種子培養(yǎng)的糖濃度可稍低，一般當?shù)纳L激素。種子培養(yǎng)的糖濃度可稍低，一般1 13%3%。 3 3接種培養(yǎng)接種培養(yǎng) 種子培養(yǎng)的接種較容易，每瓶種子培養(yǎng)的接種較容易，每瓶3 35 5粒，粒， 均均 勻排列，勻排

27、列， 4.4.培養(yǎng)條件：培養(yǎng)條件：20202828，100010002000Lx2000Lx光強，每天光照光強，每天光照1010小小 時時 二、二、 胚胎培養(yǎng)胚胎培養(yǎng) o胚及胚器官（如子房、 胚珠）在離體無菌條件下，使胚發(fā)育成幼 苗的技術(shù)。 包括幼胚培養(yǎng)、成熟胚培養(yǎng)、胚珠培養(yǎng)、子房培養(yǎng)、 胚乳培養(yǎng)等。 o胚胎培養(yǎng)史：已有近百年， 1904年的Haning首次培養(yǎng)了蘿卜和辣 椒的胚，并萌發(fā)形成小苗。30年代把蘭科植物的胚培養(yǎng)成小植株。 40年代進行蘋果、桃、柑桔、梨、葡萄、山楂、馬鈴薯、甘藍與大 白菜的種間雜種的胚胎培養(yǎng)、胚乳培養(yǎng)及子房與胚珠培養(yǎng)。 （一）胚胎培養(yǎng)的意義（一）胚胎培養(yǎng)的意義 1.

28、克服遠緣雜種的不育性 用胚胎培養(yǎng)和試管受精技術(shù)，解決種間 和屬間胚敗育， 胚發(fā)育不全，而不能正常萌發(fā)的問題。 2.使胚發(fā)育不全的植物獲得后代。 如蘭花、天麻的種子成熟時， 胚只有67個細胞，多數(shù)胚不能成活。分離出這此些未成熟胚 進行培養(yǎng)，得到正常植物。 3.縮短育種年限 應(yīng)用胚培養(yǎng)技術(shù)可以縮短育種周期12年。 （二）離體胚培養(yǎng)（二）離體胚培養(yǎng) o 胚發(fā)育過程：受精胚發(fā)育過程：受精受精卵受精卵合子合子第一次第一次 分裂分裂分生組織和幼胚分生組織和幼胚成熟胚。在這個過成熟胚。在這個過 程，胚靠消耗胚乳的營養(yǎng)而發(fā)育，程，胚靠消耗胚乳的營養(yǎng)而發(fā)育， 同時胚同時胚 處在胚囊環(huán)境中，可吸收氨基酸、維生素等

29、處在胚囊環(huán)境中，可吸收氨基酸、維生素等 營養(yǎng)。營養(yǎng)。 離體胚培養(yǎng)包括成熟胚和幼胚培養(yǎng)離體胚培養(yǎng)包括成熟胚和幼胚培養(yǎng) 成熟胚培養(yǎng) 指子葉期后至發(fā)育完全的胚。 培養(yǎng)較易成功，在含有無機大量元素和糖的培養(yǎng)基上，就能 正常生長成幼苗。將成熟或未成熟種子70%酒精表面消毒無 菌水沖洗34次無菌條件下進行解剖，取出胚并接種在適當 的培養(yǎng)上培養(yǎng)。 幼胚培養(yǎng) 幼胚是指子葉期以前的幼小胚 ，現(xiàn)在可對心形期 胚或更早期(0.10.2mm)的胚進行培養(yǎng)。胚越小就越難培養(yǎng)， 現(xiàn)在大麥、薺菜、甘蔗、甜菜、胡蘿卜等幼胚已培養(yǎng)成功。 I)I)操作方法操作方法 o 與成熟胚培養(yǎng)基本相同， 切取幼胚必須在 高倍解剖鏡下進行，

30、操作時要特別細心， 盡量取出完整的胚。 II)II)培養(yǎng)方式培養(yǎng)方式 常見有三種明顯不同的生長方式：常見有三種明顯不同的生長方式： 第一種是繼續(xù)進行正常的胚胎發(fā)育，第一種是繼續(xù)進行正常的胚胎發(fā)育， 維持維持“胚性生長胚性生長”； 第二種是在培養(yǎng)后迅速萌發(fā)成幼苗，第二種是在培養(yǎng)后迅速萌發(fā)成幼苗， 而不繼續(xù)進行胚性而不繼續(xù)進行胚性 生長，通常稱為生長，通常稱為“早熟萌發(fā)早熟萌發(fā)”； 第三種是發(fā)生細胞增殖形成愈傷組織，并由此再分化形成第三種是發(fā)生細胞增殖形成愈傷組織，并由此再分化形成 多個胚狀體或芽原基。多個胚狀體或芽原基。 特別是加有生長調(diào)節(jié)劑時，就特別是加有生長調(diào)節(jié)劑時，就 更為如此。更為如此。

31、 III)III)影響因素影響因素 1. 培養(yǎng)基培養(yǎng)基 成熟胚對培養(yǎng)基要求不高，而幼胚要求較高，常用的培成熟胚對培養(yǎng)基要求不高，而幼胚要求較高，常用的培 養(yǎng)基有養(yǎng)基有Tukey、MS、B5、Nitsch培養(yǎng)基，其中前者適于成熟培養(yǎng)基，其中前者適于成熟 胚培養(yǎng)，其它適于未成熟胚和幼胚培養(yǎng)。胚培養(yǎng)，其它適于未成熟胚和幼胚培養(yǎng)。 幼胚需要較高的蔗糖濃度，幼胚需要較高的蔗糖濃度， 提供較高的滲透壓。由于幼胚提供較高的滲透壓。由于幼胚 在自然條件下賴以生存的是無定形的液體胚乳，在自然條件下賴以生存的是無定形的液體胚乳， 具有較高的滲具有較高的滲 透壓，人工培養(yǎng)基中要創(chuàng)造高滲透壓的條件，透壓，人工培養(yǎng)基中

32、要創(chuàng)造高滲透壓的條件， 它可以調(diào)節(jié)胚的它可以調(diào)節(jié)胚的 生長，阻止可能的滲透壓影響，生長，阻止可能的滲透壓影響， 還能抑制早熟萌發(fā)中的細胞延還能抑制早熟萌發(fā)中的細胞延 長，以及抑制胚的萌發(fā)，避免把細胞的伸長狀態(tài)轉(zhuǎn)化為分裂狀態(tài)。長，以及抑制胚的萌發(fā)，避免把細胞的伸長狀態(tài)轉(zhuǎn)化為分裂狀態(tài)。 III)III)影響因素影響因素 2.生長調(diào)節(jié)物質(zhì) 不同植物的胚培養(yǎng)需要的生長物質(zhì)不同，如IAA可明顯促 進向日葵胚的生長。IAA,Kt的共同作用可促進薺菜幼胚的生長。一般認 為IAA可使胚的長度增加；加入BA可提高胚的生存機會。 3.天然提取物 椰乳對胚培養(yǎng)有一定的促進作用，如番茄胚在含有50%椰乳的 培養(yǎng)基中可

33、維持生長。瓜類的胚乳提取物也能促進胚生長的能力，可能 是植物激素的細胞分裂物質(zhì)和一些有機氮化合物作用的結(jié)果。 4.溫光條件 大多數(shù)植物的胚在2530為宜，但是，早熟果樹(如桃)必須 經(jīng)過一定的低溫春化階段才能正常萌發(fā)生長。 光照可以促進某些植物 的胚轉(zhuǎn)綠， 利于胚芽生長，而黑暗利于胚根生長。因此以光暗交替培 養(yǎng)較為有利。 5. 其它條件 胚培養(yǎng)中還要求較高濃度的氨基酸及無機鹽。 三、胚珠培養(yǎng)三、胚珠培養(yǎng) o 概念概念：在無菌條件下對授粉的子房取出胚珠 進行培養(yǎng)的過程。有時也把胚珠連同胎座一 起取下來培養(yǎng)。 o 優(yōu)點：優(yōu)點：胚珠培養(yǎng)可以解決象蘭科植物成熟胚 較小不易培養(yǎng)的問題。另一方面在未受精的

34、 胚珠培養(yǎng)中，可誘發(fā)大孢子發(fā)育成單倍體， 用于單倍體育種。 三、胚珠培養(yǎng)三、胚珠培養(yǎng) o 接種和培養(yǎng)基：接種和培養(yǎng)基：從花中取出子房進行表面消毒，在無菌 條件下進行解剖，取出胚珠，放在培養(yǎng)基上培養(yǎng)；多用 Nistch培養(yǎng)基，也可采用MS、N6、B5等培養(yǎng)基。 o 注意：注意：關(guān)鍵是選擇胚的發(fā)育時期，實驗證明發(fā)育到球形 胚期的胚珠較易培養(yǎng)成功。另外可取用帶胎座甚至帶部 分子房的胚珠進行培養(yǎng)。 四、胚乳培養(yǎng)四、胚乳培養(yǎng) o 概念概念：指對由兩個單倍的極核和一個單倍的精子結(jié) 合而成的三倍體組織的培養(yǎng)。可獲得無子結(jié)實的三 倍體植株，進而可將它加倍成六倍體植株。 o 接種和培養(yǎng)基接種和培養(yǎng)基 ：取授粉4

35、8天后的幼果，常規(guī)消 毒后，在無菌條件下切開果實，取出種子，小心分 離出胚乳。接種在培養(yǎng)基上； 培養(yǎng)過程：培養(yǎng)過程： I)I)接入接入MSMS、WhiteWhite等培養(yǎng)基，附加等培養(yǎng)基，附加2 2，4-D4-D或或NAA 0.5NAA 0.52.02.0，BA0.1BA0.1 1.01.0。在。在25252727和黑暗條件或散射光下培養(yǎng)和黑暗條件或散射光下培養(yǎng), ,約約6-106-10天胚乳開天胚乳開 始膨大始膨大, ,形成愈傷組織；形成愈傷組織； II)II)轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基,MS,MS培養(yǎng)基附加培養(yǎng)基附加0.50.53.0 mg/l3.0 mg/l的的BABA及少量的及少量的

36、NAANAA。 使愈傷組織長出芽。使愈傷組織長出芽。 III)III)切下不定芽切下不定芽, ,插入生根培養(yǎng)基中，光下培養(yǎng)插入生根培養(yǎng)基中，光下培養(yǎng)10101515天天, ,切口處可切口處可 長出白色的不定根。長出白色的不定根。 第三節(jié)第三節(jié) 植物器官組織培養(yǎng)常見問題及對策植物器官組織培養(yǎng)常見問題及對策 一、污染及控制一、污染及控制 1 1、污染的含義：、污染的含義： 指在組培過程中培養(yǎng)瓶內(nèi)滋生菌斑，使培養(yǎng)材料不能正常生長發(fā)指在組培過程中培養(yǎng)瓶內(nèi)滋生菌斑，使培養(yǎng)材料不能正常生長發(fā) 育，從而導(dǎo)致培養(yǎng)失敗的現(xiàn)象。育，從而導(dǎo)致培養(yǎng)失敗的現(xiàn)象。 2 2、污染原因（從病原菌分析）、污染原因（從病原菌分析

37、） （1）細菌污染：菌斑呈黏粘液狀，界限比較明顯，一般接種后12天 即能發(fā)現(xiàn)。主要是大腸桿菌和鏈球菌。 （2）真菌污染：菌斑呈絨毛狀、絮狀，界限不明顯，伴有不同顏色的 孢子接種后310天才能發(fā)現(xiàn)。主要是霉菌污染。 3、污染途徑 （1）外植體帶菌 （2）培養(yǎng)基及接種器具滅菌不徹底 （3）接種操作時帶入 （4）環(huán)境不清潔 4 4、污染的預(yù)防措施、污染的預(yù)防措施 A A、 防止外植體帶菌防止外植體帶菌 （1 1） 選擇好外植體采集時期和采集部位選擇好外植體采集時期和采集部位 外植體采集以春秋為宜；外植體采集以春秋為宜； 優(yōu)先選擇地上部分作為外植體；優(yōu)先選擇地上部分作為外植體； 陰雨天勿采，晴天下午采

38、集；陰雨天勿采，晴天下午采集； 采前噴殺蟲劑、殺菌劑或套塑料袋采前噴殺蟲劑、殺菌劑或套塑料袋。 （2 2）室內(nèi)或無菌條件下進行預(yù)培養(yǎng)。）室內(nèi)或無菌條件下進行預(yù)培養(yǎng)。 （3 3）外植體嚴格滅菌）外植體嚴格滅菌 滅菌效果實驗滅菌效果實驗 多次滅菌和交多次滅菌和交 替滅菌替滅菌 B B、保證培養(yǎng)基及接種器具徹底滅菌、保證培養(yǎng)基及接種器具徹底滅菌 1 1、分裝時，注射器勿觸瓶口。培養(yǎng)基勿粘瓶口、分裝時，注射器勿觸瓶口。培養(yǎng)基勿粘瓶口 2 2、檢查封口膜是否破損、檢查封口膜是否破損 3 3、扎瓶口要位置適當，松緊適宜、扎瓶口要位置適當，松緊適宜 4 4、保證滅菌時間和高壓鍋內(nèi)溫度、保證滅菌時間和高壓鍋內(nèi)

39、溫度 5 5、接種工具用前徹底滅菌、接種工具用前徹底滅菌 6 6、工作服、口罩、帽子等布質(zhì)品定期進行濕熱滅菌、工作服、口罩、帽子等布質(zhì)品定期進行濕熱滅菌 C C、操作人員嚴格遵守無菌操作規(guī)程、操作人員嚴格遵守無菌操作規(guī)程 D D、 保證接種與培養(yǎng)環(huán)境清潔保證接種與培養(yǎng)環(huán)境清潔 （1 1）污染瓶經(jīng)高壓滅菌后再清洗）污染瓶經(jīng)高壓滅菌后再清洗 （2 2）接種環(huán)境定期熏蒸消毒、紫外燈照射，或用臭）接種環(huán)境定期熏蒸消毒、紫外燈照射，或用臭 氧滅菌機消毒氧滅菌機消毒 （3 3）定期清洗或更換超凈臺初過濾器，進行帶菌實）定期清洗或更換超凈臺初過濾器，進行帶菌實 驗；接種前驗；接種前151520min20mi

40、n打開風機，風速調(diào)整到打開風機，風速調(diào)整到2020 30m/min30m/min，并對臺面用，并對臺面用75%75%酒精噴霧消毒酒精噴霧消毒 （4 4）定期對培養(yǎng)室消毒，防止高溫）定期對培養(yǎng)室消毒，防止高溫 二、培養(yǎng)物的不良表現(xiàn)及改進措施二、培養(yǎng)物的不良表現(xiàn)及改進措施 （一）初始培養(yǎng)階段（一）初始培養(yǎng)階段 1.1.培養(yǎng)物水浸狀、變色、壞死、莖斷面附近干枯培養(yǎng)物水浸狀、變色、壞死、莖斷面附近干枯 可能原因：表面殺菌劑過量，消毒時間過長，外植體選用不當（部位或時期）?？赡茉颍罕砻鏆⒕鷦┻^量，消毒時間過長，外植體選用不當（部位或時期）。 改進措施：調(diào)換其他殺菌劑或降低濃度，縮短消毒時間，試用其他部

41、位，生長改進措施：調(diào)換其他殺菌劑或降低濃度，縮短消毒時間，試用其他部位，生長 初期取材。初期取材。 2.2.培養(yǎng)物長期培養(yǎng)幾乎無反應(yīng)培養(yǎng)物長期培養(yǎng)幾乎無反應(yīng) 可能原因：基本培養(yǎng)基不適宜，生長素不當或用量不足，溫度不適宜?？赡茉颍夯九囵B(yǎng)基不適宜，生長素不當或用量不足，溫度不適宜。 改進措施：更換基本培養(yǎng)基或調(diào)整培養(yǎng)基成分，尤其是調(diào)整鹽離子濃度，增加生長素用改進措施：更換基本培養(yǎng)基或調(diào)整培養(yǎng)基成分，尤其是調(diào)整鹽離子濃度，增加生長素用 量，試用量，試用2,4-D2,4-D，調(diào)整培養(yǎng)溫度。，調(diào)整培養(yǎng)溫度。 （一）初始培養(yǎng)階段（一）初始培養(yǎng)階段 3.3.愈傷組織生長過旺、疏松，后期水浸狀愈傷組織生長

42、過旺、疏松，后期水浸狀 可能原因：激素過量，溫度偏高，無機鹽含量不當?？赡茉颍杭に剡^量，溫度偏高，無機鹽含量不當。 改進措施：減少激素用量，適當降低培養(yǎng)溫度，調(diào)整無機鹽（尤其是改進措施：減少激素用量，適當降低培養(yǎng)溫度，調(diào)整無機鹽（尤其是 銨鹽）含量，適當提高瓊脂用量增加培養(yǎng)基硬度。銨鹽）含量，適當提高瓊脂用量增加培養(yǎng)基硬度。 4.4.愈傷組織太緊密、平滑或突起，粗厚，生長緩慢愈傷組織太緊密、平滑或突起，粗厚，生長緩慢 可能原因：細胞分裂素用量過多，糖濃度過高，生長素過量?？赡茉颍杭毎至阉赜昧窟^多，糖濃度過高，生長素過量。 改進措施：減少細胞分裂素用量，調(diào)整細胞分裂素與生長素比例，降改進措

43、施：減少細胞分裂素用量，調(diào)整細胞分裂素與生長素比例，降 低糖濃度。低糖濃度。 （一）初始培養(yǎng)階段（一）初始培養(yǎng)階段 5.5.側(cè)芽不萌發(fā)側(cè)芽不萌發(fā), ,皮層過于膨大皮層過于膨大, ,皮孔長出愈傷組織皮孔長出愈傷組織 可能原因可能原因: :枝條過嫩枝條過嫩, ,生長素、細胞分裂素用量過多。生長素、細胞分裂素用量過多。 改進措施：減少激素用量，采用較老化枝條。改進措施：減少激素用量，采用較老化枝條。 6 6、初代培養(yǎng)外植體的褐變、初代培養(yǎng)外植體的褐變 外植體褐變是指在接種后，其表面開始褐化，有時甚至會使整個培養(yǎng)外植體褐變是指在接種后，其表面開始褐化，有時甚至會使整個培養(yǎng) 基褐化的現(xiàn)象。它的出現(xiàn)是由于

44、植物組織中的多酚氧化酶被激活，基褐化的現(xiàn)象。它的出現(xiàn)是由于植物組織中的多酚氧化酶被激活， 而使細胞的代謝發(fā)生變化所致。而使細胞的代謝發(fā)生變化所致。 在褐變過程中，會產(chǎn)生醌類物質(zhì)，它們多呈棕褐色，當擴散到培養(yǎng)基在褐變過程中，會產(chǎn)生醌類物質(zhì)，它們多呈棕褐色，當擴散到培養(yǎng)基 后，就會抑制其他酶的活性，從而影響所接種外植體的培養(yǎng)。后，就會抑制其他酶的活性，從而影響所接種外植體的培養(yǎng)。 （1 1）褐變的主要原因如下）褐變的主要原因如下 植物品種植物品種 研究表明，在不同品種間的褐變現(xiàn)象是不同的。由于多酚氧化研究表明，在不同品種間的褐變現(xiàn)象是不同的。由于多酚氧化 酶，而有些花卉品種的外植體在接種后不容易褐

45、變。因此，在培養(yǎng)過程酶，而有些花卉品種的外植體在接種后不容易褐變。因此，在培養(yǎng)過程 中應(yīng)該有所選擇，對不同的品種分別進行處理。中應(yīng)該有所選擇，對不同的品種分別進行處理。 生理狀態(tài)生理狀態(tài) 由于外植體的生理狀態(tài)不同，所以在接種后褐變程度也有所不由于外植體的生理狀態(tài)不同，所以在接種后褐變程度也有所不 同。一般來說，處于幼齡期的植物材料褐變程度較淺，而從已經(jīng)成年的同。一般來說，處于幼齡期的植物材料褐變程度較淺，而從已經(jīng)成年的 植株采收的外植體，由于含醌類物質(zhì)較多，因此褐變較為嚴重。一般來植株采收的外植體，由于含醌類物質(zhì)較多，因此褐變較為嚴重。一般來 說，幼嫩的組織在接種后褐變程度并不明顯，而老熟的組

46、織在接種后褐說，幼嫩的組織在接種后褐變程度并不明顯，而老熟的組織在接種后褐 變程度較為嚴重。變程度較為嚴重。 培養(yǎng)基成分 濃度過高的無機鹽會使某些觀賞植物的褐變程度增加，此外， 細胞分裂素的水平過高也會刺激某些外植體的多酚氧化酶的活性，從而 使褐變現(xiàn)象加深。 培養(yǎng)條件不當 如果光照過強、溫度過高、培養(yǎng)時間過長等，均可使多酚 氧化酶的活性提高，從而加速被培養(yǎng)的外植體的褐變程度。 （2 2）減輕褐變現(xiàn)象發(fā)生的方法）減輕褐變現(xiàn)象發(fā)生的方法 選擇合適的外植體選擇合適的外植體 一般來說，最好選擇生長處于旺盛的外植體，這一般來說，最好選擇生長處于旺盛的外植體，這 樣可以使褐變現(xiàn)象明顯減輕。樣可以使褐變現(xiàn)象

47、明顯減輕。 合適的培養(yǎng)條件合適的培養(yǎng)條件 無機鹽成分、植物生長物質(zhì)水平、及時繼代培養(yǎng)均無機鹽成分、植物生長物質(zhì)水平、及時繼代培養(yǎng)均 可以減輕材料的褐變現(xiàn)象?？梢詼p輕材料的褐變現(xiàn)象。 使用抗氧化劑使用抗氧化劑 半胱氨酸及其鹽酸鹽、二硫蘇糖醇、谷胱甘肽、抗壞半胱氨酸及其鹽酸鹽、二硫蘇糖醇、谷胱甘肽、抗壞 血酸等。該類藥劑一般需用濃度為血酸等。該類藥劑一般需用濃度為50-200mg/L50-200mg/L。用經(jīng)過濾滅菌的藥。用經(jīng)過濾滅菌的藥 液洗滌剛切割的外植體傷口表面，或加入固體培養(yǎng)基的表層，或?qū)⒁合礈靹偳懈畹耐庵搀w傷口表面，或加入固體培養(yǎng)基的表層，或?qū)?剛切割的外植體浸入其中一定時間。另外，使用

48、剛切割的外植體浸入其中一定時間。另外，使用0.1%-0.5%0.1%-0.5%的活性炭的活性炭 對防止褐變也有較為明顯的效果。對防止褐變也有較為明顯的效果。PVPPVP處理。處理。 連續(xù)轉(zhuǎn)移連續(xù)轉(zhuǎn)移 對容易褐變的材料可間隔對容易褐變的材料可間隔121224h24h的培養(yǎng)后，再轉(zhuǎn)移到新的的培養(yǎng)后，再轉(zhuǎn)移到新的 培養(yǎng)基上，這樣經(jīng)過連續(xù)處理培養(yǎng)基上，這樣經(jīng)過連續(xù)處理7-l0d7-l0d后，褐變現(xiàn)象便會得到控制或大后，褐變現(xiàn)象便會得到控制或大 為減輕。為減輕。 （二）繼代培養(yǎng)階段（二）繼代培養(yǎng)階段 1.苗分化數(shù)量少、速度慢、分枝少、個別苗生長細高 可能原因：細胞分裂素用量不足，溫度偏高，光照不足。 改

49、進措施：增加細胞分裂素用量，適當降低溫度，改善光照， 改單芽繼代為團塊（叢芽）繼代。 2.苗分化過多，生長慢，有畸形苗，節(jié)間極短，苗叢密集，微 型化。 可能原因：細胞分裂素用量過多，溫度不適宜。 改進措施：減少或停用細胞分裂素一段時間，調(diào)節(jié)溫度。 （二）繼代培養(yǎng)階段（二）繼代培養(yǎng)階段 3.分化率低,畸形,培養(yǎng)時間長時苗再次愈傷組織化 可能原因:生長素用量偏高,溫度偏高。 改進措施：減少生長素用量，適當降溫。 4.葉粗厚變脆 可能原因：生長素用量偏高，或兼有細胞分裂素用量偏高。 改進措施：適當減少激素用量，避免葉片接觸培養(yǎng)基 5.再生苗的葉緣、葉面等外偶有不定芽分化出來 可能原因：細胞分裂素用量偏高，或表明該種植物適于該種再生方式。 改進措施：適當減少細胞分裂素用量，或分階段地利用這一再生方式 （二）繼代培養(yǎng)階段（二）繼代培養(yǎng)階段 6.叢生苗過于細弱，不適于生根或移栽 可能原因：細胞分裂素濃度過高或赤霉素使用不當，溫度過高，光照短，光 強不足，久不轉(zhuǎn)移，生長空間窄。 改進措施：減少細胞分裂素用量，免用赤霉素，延長光照時間，增強光照， 及時轉(zhuǎn)接，降低接種密度。 7.幼苗淡綠，部分失綠 可能原因：無機鹽含量不足，PH值不適宜，鐵、錳、鎂等缺少或比例失調(diào)， 光照、溫度不適。 改進措施：針對營養(yǎng)元素虧缺情況調(diào)整培養(yǎng)基，調(diào)好PH值，調(diào)控溫度、光照。 8.幼苗生長無力、發(fā)黃落葉、有黃葉、死苗