噴霧干燥法制備神經(jīng)毒素殼聚糖鼻腔給藥微球的研究

1、噴霧干燥法制備神經(jīng)毒素殼聚糖鼻腔給藥微球的研究蔡鑫君，夏愛曉，柴國寶，魏穎慧，馮健，李范珠基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目（30371781），國家自然科學(xué)基金資助項目(30772793)，第一作者簡介：蔡鑫君（1985-），男，碩士研究生，主要研究方向為中藥新劑型。Tel:(0571)86613726 E-mail:zjtcmcxj *通訊作者：李范珠，男，教授，博士生導(dǎo)師 研究方向：藥物新技術(shù)與新劑型研究。Tel:(0571)86633030 E-mail:Lifanzhu(浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，浙江杭州 310053)摘要： 目的 制備神經(jīng)毒素殼聚糖微球，并對其體外釋藥模式進行研究。方

2、法 采用噴霧干燥法制備神經(jīng)毒素殼聚糖微球，以包封產(chǎn)率為指標(biāo)，考察了處方與工藝因素對殼聚糖微球的影響，并采用正交設(shè)計L9(3)4對處方和工藝進行了優(yōu)化。結(jié)果 最優(yōu)處方為殼聚糖濃度為0.75，殼聚糖-TPP重量比為101，進口溫度105，空氣流速550L/h。優(yōu)化處方制備的神經(jīng)毒素殼聚糖微球表面圓整，載藥量為(19.230.42)，包封產(chǎn)率為(92.102.1)，平均粒徑為(6.860.76)m。體外釋藥數(shù)據(jù)用Higuchi模型擬合得方程Q=11.42t1/2-5.89(r=0.9920)，表明該微球具有緩釋作用。結(jié)論 采用噴霧干燥法制備微球，具有工藝穩(wěn)定、可連續(xù)操作等優(yōu)點，制備的神經(jīng)毒素殼聚糖微

3、球具有較好的緩釋特性，關(guān)鍵詞：噴霧干燥法；神經(jīng)毒素；殼聚糖微球；體外釋放Preparation of Chitosan Microspheres Loaded with Neurotoxin-for Nasal Delivery by Spray Drying TechniqueCAI Xin-jun, XIA Ai-xiao, CHAI Guo-bao,WEI Ying-hui, Fen Jian,LI Fan-zhu*(College of Pharmaceutical Science, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 31005

4、3)ABSTRACT: OBJECTIVE To prepare the preparation of neurotoxin-loaded chitosan microspheres and to investigate the drug release behavior in vitro. Methods Microspheres were prepared using the spray drying method，the encapsulation efficiency was used to evaluate the influence of different formulation

5、 and preparation factors，the formulation was optimized by orthogonal design L9(3)4. Results The optimal formulation was as follows：chitosan concentration (0.75%)，ratio of chitosan to TPP (10：1)，inlet temperature (105)，air flow rate (550L/h).The optimized microspheres had a spherical shape，the drug l

6、oading was (19.230.42)%，encapsulation efficiency was(92.102.1)%，average diameter was(6.860.76) m.The drug release profile in vitro could be described by Higuchi equation Q=11.42t1/2-5.89(r=0.9920)，the results showed the microspheres prepared obviously sustained release effect. Conclusion Preparation

7、 of sustained-release microcapsule by spray drying is a simple method，the process is stable.Key Word: spray drying technique; neurotoxin-; chitosan microspheres; in vitro release 神經(jīng)毒素(neurotoxin-，NT-)是從云南眼鏡蛇毒液中分離得到的一類短鏈神經(jīng)毒素的主要成分之一，具有中樞鎮(zhèn)痛作用，無耐受性和依賴性，安全性高，主要以肌注方式用于控制各種疼痛及戒毒，起效較慢(約35h)，難以滿足臨床需求1。鼻腔給藥是目

8、前研究較多的適合多肽蛋白質(zhì)類藥物的新型給藥系統(tǒng)，藥物吸收迅速，可避免肝首過作用、消化道黏膜的代謝和降解，給藥方便，患者依從性好。研究表明，鼻腔給藥對相對分子質(zhì)量(Mr)小于1000的脂溶性藥物吸收較好2,3。由于NT-的Mr較大(6700)，易溶于水，直接鼻腔給藥吸收有限4。殼聚糖具有良好的生物相容性和生物黏附性，同時能促進蛋白質(zhì)等大分子藥物透過黏膜，因此在鼻腔微粒給藥系統(tǒng)中的應(yīng)用日益增多5。噴霧干燥法制備微球具有一次成球、干燥時間短、易實現(xiàn)擴大生產(chǎn)等優(yōu)點，尤其適于蛋白質(zhì)等熱敏性藥物的微囊化6。為提高NT-鼻腔給藥的生物利用度，本研究以生物降解型高分子材料殼聚糖為載體，以三聚磷酸鈉(sodiu

9、m tripolyphosphate，TPP)為交聯(lián)劑，采用噴霧干燥法制備NT-微球，用正交設(shè)計優(yōu)化處方，并考察其體外釋放行為。1 儀器與試藥290型噴霧干燥機(瑞士Bchi公司)；UV-1700型紫外-可見分光光度計(日本島津)；XL30 ESEM型掃描電子顯微鏡(Phlips公司)；Winner 2000Z型智能全自動臺式激光粒度分析儀(濟南微納儀器有限公司)。NT-原藥(中國科學(xué)院昆明動物研究所，純度99，批號060530)；殼聚糖(上海伯奧生物科技有限公司，脫乙酰度85，黏度0.1Pas，批號050106)；試劑自制，4NaCO3溶液與0.2mol/L氫氧化鈉溶液的等體積混合液和1Cu

10、SO4溶液與2酒石酸鉀鈉溶液的等體積混合液按501(v/v)混勻，臨用前配制；Folin試劑(上海喜潤化學(xué)工業(yè)有限公司)；透析袋(截留分子量為15000，上海綠鳥科技發(fā)展有限公司)；其它試劑均為分析純。2 方法與結(jié)果2.1 NT-殼聚糖微球的制備7用噴霧干燥法制備NT-殼聚糖微球。精密稱取殼聚糖適量，用1乙酸溶解后配成不同濃度備用。NT-與殼聚糖按41(w/w)混合，攪勻，再按不同重量比將1 TPP溶液緩慢滴入殼聚糖溶液，1000r/min攪拌固化30min，靜置待無氣泡時即可，分別在不同進口溫度、不同空氣流速下進行噴霧干燥得到微球粉末。同法制備不含NT-的空白微球。2.2 微球載藥量和包封產(chǎn)

11、率的測定2.2.1 分析方法取空白微球100mg和NT-水溶液(103.2mg/ml l)適量，置同一燒杯中，精密加入3檸檬酸鈉溶液50ml，室溫下攪拌(300r/min)24h使微球溶解，離心(10625g)10min，取上清液1ml，用蒸餾水定容至5ml，用Lowry法8,9在650nm處測定吸光度(D)。另取未加入NT-溶液的空白微球100mg同法操作。結(jié)果表明，空白微球在650nm處無吸收，對NT-含量的檢測無干擾。2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線精密稱取NT-適量，加水溶解并稀釋成2.58mg/ml的貯備液。精密吸取貯備液適量，用水稀釋成濃度為25.8、51.6、103.2、154.8、206.

12、4、258mg/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別精密吸取1ml，各置試管中，加入試劑 5ml，渦旋混勻，于30保溫10min，再加入Folin試劑0.5ml，渦旋混勻后繼續(xù)保溫30min。另取蒸餾水2ml，試劑和Folin試劑的用量為10ml和1ml，其它操作同上，作為空白對照，于650nm處測定D。以D對NT-濃度(c)線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程D=0.0022c+0.0102，r=0.9995，表明NT-在濃度為25.8258g/ml內(nèi)線性關(guān)系良好。2.2.3 精密度試驗分別精密量取250、125、62.5mg/ml的NT-溶液，各5份，按“2.2.2”項下方法測定，計算得高、中、低濃度的日內(nèi)RSD分別為

13、0.29、0.25、0.94；連續(xù)5d測定，計算得日間RSD分別為0.45、0.62、0.86。2.2.4 回收率試驗精密稱取空白微球100mg，分別加入250、125、 62.5mg/ml的NT-溶液，各5份，按“2.2.2”項下方法測定，計算得高、中、低濃度的方法平均回收率分別為98.5、100.1、99.0，RSD分別為1.02、1.87、1.25。2.2.5 載藥量和包封產(chǎn)率的測定精密稱取含藥微球約100mg，置錐形瓶中，按“2.2.2”項下方法操作測定，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計算NT-含量，計算載藥量與包封產(chǎn)率(包封產(chǎn)率=微球?qū)嶋H載藥量/微球理論載藥量100)10,11。2.3 正交設(shè)計優(yōu)化處方

14、和工藝在預(yù)試驗基礎(chǔ)上采用正交設(shè)計考察影響微球包封產(chǎn)率的4個因素：殼聚糖濃度(A)、殼聚糖與TPP的重量比(B)、進口溫度(C)、空氣流速(D)，各取3水平(見表1)。按L9(34)表安排試驗，以包封產(chǎn)率為考察指標(biāo)，優(yōu)選最佳處方工藝，重復(fù)實驗3次，考察微球制備工藝的重現(xiàn)性。正交實驗因素水平表見表1。表1 因素和水平Table 1 Factors and levels水平因素A /wv-1B /ww-1C /D /Lh-110.2510：110045020.5015：110550030.7520：1110550表2 正交試驗結(jié)果Table 2 Calculation and analysis of

15、 orthogonal testNOABCD包封產(chǎn)率%1111181.352122280.453133379.054212388.075223180.856231285.357313287.108321387.409332187.15均值80.28385.50784.70083.117均值84.75782.90085.22384.300均值87.21783.85082.33384.840極差6.9342.6072.8901.723結(jié)果表明，各因素對包封產(chǎn)率的影響依次為ACBD，最佳組合為A3B1C2D3，即殼聚糖濃度為0.75，殼聚糖-TPP重量比為101，進口溫度105，空氣流速550L/h

16、。2.4 優(yōu)化處方工藝驗證按優(yōu)化處方制備3批NT-殼聚糖微球，載藥量和包封產(chǎn)率為(19.230.42)、(92.102.1)，表明處方工藝重現(xiàn)性較好。2.4.1 微球的形態(tài)及粒徑分布取適量微球用掃描電鏡觀察，結(jié)果表明微球外形圓整，大小均勻(圖1)。將制得的NT-殼聚糖微球混懸于無水乙醇中，用激光粒度儀測得微球粒徑平均粒徑為(6.860.76) mm(n=3)。 圖1 NT-微球的掃描電鏡照片(A：1000，B：4000)Fig.1 Pattern of NT- microspheres by SEM(A：1000，B：4000)2.4.2 體外釋放實驗采用恒溫振蕩法。精密稱取NT-或NT-殼聚

17、糖微球適量，裝入透析袋內(nèi)，扎緊后置磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)中，(370.5)振蕩(速率100r/min)。分別在0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、8、12、24、48、72、96h取樣1ml(同時補加等量同溫介質(zhì))，用Lowry法測定樣品中NT-含量，計算累積釋放率(Q)，結(jié)果見圖2。NT-原藥；NT-殼聚糖微球圖2 體外釋放曲線(n=3)NT-；NT-chitosan microspheresFig.2 Drug releasing curve of NT-from microspheres（n3）結(jié)果表明，NT-粉末4h內(nèi)釋放完全；NT-殼聚糖微球12h累積釋放率38.8

18、，96h基本釋放完全。經(jīng)Higuchi模型擬合得方程Q=11.42t1/2-5.89，r=0.9920，說明NT-殼聚糖微球有緩釋作用。3 討論3.1 曾考察了不同脫乙酰度的殼聚糖對微球形成的影響。結(jié)果表明，當(dāng)殼聚糖脫乙酰度大于90時，與TPP溶液混合后易形成絮狀沉淀；當(dāng)脫乙酰度低于90時，與TPP交聯(lián)固化后的溶液仍保持澄清。這可能是由于脫乙酰度高的殼聚糖有更多帶正電的氨基，與帶負電荷的TPP發(fā)生過度交聯(lián)后易形成沉淀。3.2 由于NT-是多肽類藥物，制備過程中會受到溫度等外界因素對多肽結(jié)構(gòu)和生物活性的影響。我們采用小鼠熱板法考察溫度對神經(jīng)毒素鎮(zhèn)痛活性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)神經(jīng)毒素在40、60、80、

19、100等不同溫度處理后的鎮(zhèn)痛抑制率分別為54.4%、44.3%、43.7%、42.9%，鎮(zhèn)痛活性并沒有顯著差異，說明神經(jīng)毒素是一種熱穩(wěn)定性較高的多肽藥物。因此，當(dāng)噴霧干燥儀的出口溫度低于100時，對藥物的活性影響較小，而出口溫度同時受進料速度、進口溫度、空氣流速、物料性質(zhì)等影響，故試驗設(shè)計時未把出口溫度作為因素考察，重點考察進口溫度、空氣流速等工藝因素對微球包封產(chǎn)率的影響。而且優(yōu)化后的出口溫度保持在7274，對NT-的活性影響不大。3.3 體外釋放試驗表明，NT-殼聚糖微球在前12h內(nèi)的累積釋放38.8。這是由于微球表面吸附有藥物的微小結(jié)晶(圖1)，因此當(dāng)微球接觸釋放介質(zhì)后，微球表面的NT-迅

20、速釋放，形成突釋。隨后的釋放相對緩慢，這是由于TPP與殼聚糖上的氨基形成離子交聯(lián)，促進微球表面固化，釋放介質(zhì)滲入緩慢，延緩了藥物的釋放。這樣可保證藥物在較長一段時間內(nèi)維持有效血藥濃度，產(chǎn)生緩釋效應(yīng)。REFERENCES 1 Lu QM, Meng QX, Li DS, et al. Comparative study of three short-chain neurotoxins from the venom of Naja kaouthia (Yunnan, China) J. J Nat Toxins, 2002, 11(3): 221-229. 2 Uqwoke MI, Aqu RU,

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