麻風病皮膚查菌技術(shù)

1、麻風病皮膚查菌技術(shù) 2014年4月 麻風病的細菌學說 麻風病的病原體是麻風分枝桿菌； 麻風桿菌主要侵犯皮膚、黏膜和周圍神經(jīng)，嚴重 危害人類身心健康； 麻風桿菌是目前已知的分枝桿菌中唯一能感染人 和動物神經(jīng)的菌株。 麻風桿菌的體外培養(yǎng)尚未成功，限制了微生物學 方面的研究。 小鼠足墊感染等動物模型的成功，為麻風桿菌的 微生物學、免疫學等研究提供了基礎(chǔ)。 麻風流行病學 1、傳染源：一般認為是未經(jīng)治療過的麻風患者。間 接感染包括：土壤、污水、昆蟲叮咬及經(jīng)傷口皮 膚感染等。 2、傳播途徑： 直接方式：皮膚接觸、飛沫傳播 間接方式：昆蟲叮咬 3、易感人群：與遺傳因素有關(guān)，同時更多取決于被 感染者機體對麻風

2、桿菌特異性的細胞免疫力。 麻風桿菌的基本形態(tài) 麻風分枝桿菌是桿狀細菌。 經(jīng)抗酸染色后 菌體被染成紅色 直或略彎曲 長18m 無鞭毛，無芽胞 麻風桿菌的一般特征 麻風分枝桿菌的抗酸性抗酸性 麻風分枝桿菌形態(tài)上的形態(tài)上的多形性多形性( (完整菌、非完整完整菌、非完整 菌，短桿狀、斷裂狀、串珠狀、顆粒狀）菌，短桿狀、斷裂狀、串珠狀、顆粒狀） 完整菌與非完整菌完整菌與非完整菌 麻風分枝桿菌群族性群族性排列排列 麻風分枝桿菌在體內(nèi)分布 皮膚及周圍神經(jīng)（末梢神經(jīng)、巨噬細胞、立毛肌、 毛囊、皮脂腺、血管壁） 粘膜（鼻、頰部、咽喉部粘膜） 淋巴結(jié) LL病人在其肝、脾、睪丸能查到ML 眼球前部、淚腺、鞏膜、虹膜

3、 麻風桿菌的排出途徑 麻風病人破潰的皮損； 鼻粘膜； 瘤型病人的血、尿、便及體液中。 耐藥菌和持久菌 耐藥菌：對抗菌藥物產(chǎn)生耐受能力并失去敏感性 的細菌； 持久菌：又稱休眠菌，是指瘤型麻風在有效濃度 的殺菌性抗麻風藥物作用下仍然存活，并對該藥 完全敏感的麻風桿菌。 麻風病潛伏期 麻風桿菌侵入人體后，由于機體對桿菌感染有抵 抗力，可殺滅和清除而不發(fā)病。 自麻風桿菌進入人體至患者出現(xiàn)臨床癥狀或體征 的期間，成為潛伏期。 從病原學來說，由于麻風桿菌的繁殖周期很長 （對數(shù)生長期麻風桿菌世代時間平均是1113天）， 導致其潛伏期也較長，且發(fā)病較隱匿，較難明確 潛伏期。 麻風病診斷 麻風的正確診斷是治療和

4、控制麻風病的重要基礎(chǔ)。 漏診可致該病的繼續(xù)傳播，給患者帶來更多的身 心痛苦； 誤診可致治療、管理和資源上的浪費，給患者帶 來不必要的心理和社會壓力。 麻風在發(fā)生神經(jīng)不可逆性損害之前的早期發(fā)現(xiàn)、 早期治療是及時中斷傳染和防治畸殘發(fā)生的關(guān)鍵。 診斷要點： 1、皮損伴明確的感覺喪失； 2、周圍神經(jīng)粗大伴相應的功能障礙； 3、皮膚涂片查抗酸桿菌（AFB）陽性； 4、組織病理學檢查有麻風特異性病理改變和（或） 查AFB陽性。 麻風病的診斷要點之一：皮膚組織液涂 片查抗酸抗菌（AFB）陽性 皮膚組織液涂片查抗酸桿菌陽性是麻風的主要體 征之一。 多菌型麻風的皮膚涂片、鼻黏膜拭子涂片檢查均 能查到AFB。 皮

5、膚涂片特異性高 正常人鼻腔內(nèi)存在非致病性非典型分枝桿菌， 在現(xiàn)場不能通過鏡檢證實鼻黏膜拭子中查到的AFB是 否是麻風桿菌。 在鼻黏膜和鼻涕中查到AFB而無其他臨床、組織 學或細菌學發(fā)現(xiàn)時，無麻風診斷價值。 因此，在進行麻風診斷時，以皮膚涂片查菌的結(jié) 果更為可靠。 所有各型麻風可疑病例都應進行皮膚涂片作AFB 檢查。 皮膚涂片敏感性低 2000年中國醫(yī)學科學院皮膚病研究所報道我國 19901998年發(fā)現(xiàn)的19453例新患者中，皮膚涂片 查菌陽性者占62.9%。 Saunderson等報告，在埃塞俄比亞594例新患 者中，皮膚涂片陽性者占45%。 故：單用皮膚涂片，敏感性較低。但是，皮膚涂片 查菌

6、結(jié)果有助于細菌學分型。 傳統(tǒng)診斷麻風病的3個主要體征 （1）皮損伴感覺喪失； （2）周圍神經(jīng)粗大； （3）皮膚涂片查AFB陽性。 Saunderson等在2000年的報道中，對594例新 患者采用傳統(tǒng)的3個主要體征作為診斷標準進行了 分析。 如果把符合3個主要體征中之一者均考慮為麻 風，結(jié)果 任一神經(jīng)粗大者占84% 皮損伴感覺喪失者占70% 皮膚涂片陽性者占45%（268例），其中49% （132例）無皮損伴感覺喪失 聯(lián)合應用傳統(tǒng)標準的敏感性 聯(lián)合應用標準敏感性 （1）、（2）95% （1）、（3）92% （2）、（3）87% （1）、（2）、（3）97% WHO多菌型和少菌型麻風分類法 19

7、81年，WHO化療研究組將麻風分為多菌型和少菌型。 多菌型(MB)：包括五級分類法中的BB、BL和LL病 例，或任一部位皮膚涂片查菌細菌密度=2+者； 少菌型(PB)：包括五級分類法中的TT、BT和未定 類病例，或任一部位皮膚涂片查菌細菌密度=2+者；或在監(jiān)測期或其后皮 膚查菌雖未陰轉(zhuǎn)，但連續(xù)2次皮膚涂片，任何部位細 菌密度較前增加2+或2+以上，或有完整染色菌者。 皮膚查菌 療效判斷 臨床判愈 復發(fā)判定 查菌陰性查菌陰性 不能不能 排除診斷排除診斷 查菌陽性查菌陽性 建立診斷建立診斷 臨床疑似或確診病例的診斷與鑒別診斷臨床疑似或確診病例的診斷與鑒別診斷 病理活檢 細菌學分型 多菌型 少菌型

8、治療及監(jiān)測 方案的選擇 皮膚查菌的適用范圍 1、任何疑似病例，通過查菌建立或排除診斷； 2、臨床確診病例，通過查菌證實診斷和分型； 3、治療開始后，監(jiān)測療效； 4、復發(fā)判定，以發(fā)現(xiàn)是否存在耐藥菌或持久菌； 5、細菌學判愈。 皮膚查菌的意義 皮膚涂片查菌是診斷多菌型麻風、多菌型麻風復發(fā)、 多菌型和少菌型麻風分型以及確定高菌量麻風的直接 證據(jù)。 皮膚涂片查菌有利于與具有相似皮損表現(xiàn)的其他皮膚 病的鑒別診斷。 皮膚涂片查菌，通過觀察細菌學指數(shù)的變化來觀察療 效。 皮膚涂片查菌，有利于發(fā)現(xiàn)耐藥菌和持久菌 皮膚查菌時間 1、多菌型患者通常于治療前、治療期間及完成治療后， 每年查菌1次，可致臨床治愈； 2

9、、少菌型患者通常于治療前、完成治療時檢查一次， 以后至臨床判愈前查菌1次。 3、監(jiān)測時當出現(xiàn)細菌檢查陰性，隔3個月再在原來部 位復查一次，如細菌檢查仍然陰性，可作臨床判愈。 皮膚查菌原理圖 麻風麻風 炎癥炎癥 部位部位 皮膚查菌方法 切刮法 期望得到： 1、細菌密度指數(shù) 2、細菌形態(tài)指數(shù) 麻風桿菌的抗酸性 指在用齊-尼抗酸染色法（簡稱Z-N法）染色時， 麻風桿菌能被石碳酸復紅染成紅色，而著色后在規(guī)定 條件下不能被酸性溶液（或酸醇溶液）脫色的現(xiàn)象。 這種抗酸性可經(jīng)新鮮、純凈的吡啶提取2小時 而喪失，也可經(jīng)過碘酸處理而恢復。是鑒定麻風桿菌 的重要標準之一。 麻風桿菌形態(tài)上的多形性 皮膚涂片經(jīng)Z-N

10、法染色后在光鏡下能看到著色均勻的 桿狀菌（完整菌），也可看到短桿狀、斷裂狀、串 珠狀及顆粒狀等形態(tài)的菌（非完整菌）。 細菌形態(tài)與患者治療情況有密切的關(guān)系，不規(guī)則著 色的菌，有由于細菌細胞內(nèi)容物部分損失所致，被 認為是沒有活力的細菌。 麻風桿菌群簇性排列 即在涂片中在組織細胞內(nèi)外能看到麻風桿菌平行 排列成束狀或團狀排列的特征。 認為是細菌分泌的膠質(zhì)或分枝菌酸等引起。 器材及試劑 麻風查菌器材： 個人防護用品 消毒、止血用品 取材、涂片器材 染色鏡檢器材 檢查記錄文件 試劑：抗酸染液 其他：醫(yī)療垃圾袋、玻片盒 準備工作 選擇光線較好的場所、避免患者面部受陽光直射； 作好溝通，消除患者緊張情緒； 檢

11、查取材用物品的準備情況，尤其是止血物品； 載玻片編號（方法：如XC2013-1，注明涂片日期）； 手術(shù)刀片、載玻片的消毒處理； 取材部位的選定 皮膚查菌部位的選定 基本原則：必須真實反映病人體內(nèi)麻風分枝桿菌 的載荷情況,每次查菌應與首次查菌部位一致。 查菌部位一般為46處（包括眉眶、耳垂、下頜、 以及其他皮損部位）。具體部位選定一般臨床醫(yī)生根據(jù) 需要來定。 常規(guī)部位：眶上、耳垂及下頜 皮損應取病情最活躍處.（環(huán)狀損害、斑塊與結(jié)節(jié)、 侵潤性皮損等） 皮膚切刮涂片方法 1、用手捏緊皮損部位的皮膚，使之缺血呈蒼白色； 2、用手術(shù)刀片在皮損部位切一5mm左右長，23mm深達皮 膚真皮層的切口； 3、將

12、手術(shù)刀轉(zhuǎn)90度來回34次刮取切口邊緣和底部的組 織液，將刮出的組織液挑出； 4、切口壓迫止血； 5、按取材部位順序在潔凈的載玻片上涂成57mm大小的 涂膜。 取材涂片注意事項 1、取材部位要選取活動性皮損，如結(jié)節(jié)、斑塊、 彌漫性浸潤等； 2、取材的深度要夠，達真皮層，刀尖要確認刮到 足夠量的組織液后再取出、涂片； 3、組織液應不含血液； 4、涂抹不宜太厚。 取材涂片注意事項 應耐心向病人解釋，消除病人緊張情緒； 同一病人多次取材，取材部位盡量一致； 制作涂片用的載玻片確保清潔無油脂； 涂抹有序排列，順序要與記錄符合； 取材時應盡量避開血管； 涂片制好后，自然晾干，立即固定，并應盡早染 色。如不

13、能立即染色，要妥為保存，注意防塵防 霉。 CD2014-01 眉眶 2014.1.1 耳垂下頜 皮損1皮損2皮損3 毛玻璃端，面向上， 使用鉛筆編號 涂抹區(qū)域，已印制的圓圈在底 面。如不慎涂抹與此圓圈同為 一面，脫色時圓圈會掉色，導 致邊緣著色不均或不著色。 涂片的固定涂片的固定 待涂片自然干燥后，酒精燈的外焰上方來回2到 3次即可。 不宜用火太急，否則組織液會烤焦，組織內(nèi)炎 癥細胞收縮，細菌亦收到破壞，導致染色出現(xiàn) 偏差。 注意不要將涂片離火焰太近而將玻片烤黃或熏 黑。 取材后一定要及時固定。 染色前再固定一次。 染色加溫法 用石炭酸復紅染液覆蓋整個涂片，無溢出為宜； 于涂片下方，外焰加熱，

14、至微微有蒸汽冒出即可； 染色15分鐘，中途可再加熱12次； 自來水洗去涂片上復紅染液； 用1%鹽酸酒精脫色至無紅色脫下為止； 自來水洗去殘留脫色液； 用美藍復染30秒-1分鐘； 自來水洗去美蘭染液、晾干后鏡檢。 染色注意事項 1、染液要新鮮，配制后使用一般勿超過1年； 2、染色要按規(guī)定的操作方法進行，也要根據(jù)涂抹的 厚薄調(diào)整美藍復染的時間長短； 3、用自來水從玻片的一端輕輕沖洗，不宜直接沖洗 涂抹； 4、脫色15-30秒，輕輕晃動，如涂抹太厚，脫色時間 稍延長或再次對某一個涂抹進行脫色操作。 染色注意事項 涂片應放置水平，復紅染液應覆蓋整個涂片，避免燃 料干涸； 加熱時以微冒蒸氣為宜。氣溫低時

15、中途可加熱23次 水流宜輕緩，但要沖洗充分； 不要過度脫色，以免造成假陰性。 不宜使用吸水紙。 染片應及時鏡檢，存放時間過長，細菌脫色。 避免染色時損傷涂膜； 有關(guān)染色的研究 1、3種試劑處理方式對27例麻風患者組織液涂片 染色效果評價（2011年） 經(jīng)3.5%HCL處理，背景顏色偏淺紅色; 經(jīng)5%NaOH處理，背景顏色偏淺藍色; 經(jīng)HiCN處理，背景顏色呈藍色，與菌體呈紅色的麻風桿菌 對比明顯。 15例康復患者中4例患者報告發(fā)現(xiàn)麻風桿菌, 菌量在+之間麻風患者皮損組織液經(jīng)HiCN處理后抗酸 染色可增強細菌與背景間對比效應,查菌效率優(yōu)于常規(guī)染 色。 2、兩種抗酸染色法對麻風分枝桿菌和結(jié)核分枝桿

16、菌染色 結(jié)果分析 染色符合率：染色符合率： 染色方法MB患者17例初診肺結(jié)核157例 Z-N加熱抗酸染色法100%100% 快速抗酸染色法（TAAS)71.36%100% 一張制作好的涂片 菌體紅色、背景藍色或淺藍、無染液沉渣 涂抹大小適中、厚薄均勻 無大的空白區(qū)和大的組織殘渣 無霉菌或其他細菌污染 無紅細胞，每個視野最好平均含23各巨噬細胞 涂片鏡檢 麻風分枝桿菌的幾種型態(tài) 完整菌：菌體完整；著色均勻；兩端鈍圓，兩 側(cè)整齊；長度為寬度的4倍以上。 斷裂菌：菌體著色不均勻，有一至數(shù)個淡染或 空白區(qū)。 顆粒菌：串珠樣、竹節(jié)樣、啞鈴形及顆粒形 鏡檢內(nèi)容： 細菌學指數(shù)（BI） 形態(tài)學指數(shù)（MI） 細

17、菌學指數(shù)分級 陰性 0條菌/100油鏡視野 1+ 110條菌/100油鏡視野 2+ 110條菌/10油鏡視野 3+ 110條菌/油鏡視野 4+ 10100條菌/油鏡視野 5+ 1001000條菌/油鏡視野 6+ 1000條菌/油鏡視野 瘤型病人組織液細菌涂片（5+） 抗酸桿菌（AFB）計數(shù)方法 計數(shù)每個油鏡視野中細菌數(shù)量，包括單條菌和菌球。 如細菌太多，分布較均勻，可計數(shù)1/2或1/4視野后 乘上2倍或4倍即為整個視野菌量。 遇到菌球應大致估計一下一個菌球含多少條菌。一 般大菌球含100條左右，中等大小菌球含5060條， 小菌球含2030條，再小菌球則盡量直接計數(shù)。 細菌密度指數(shù)（BI）計算方

18、法 記下每個視野菌量，把各個視野菌量相加除以檢 查的視野數(shù)得到平均每個視野細菌數(shù)量，即為該 涂膜的細菌密度。 細菌密度的計算： 一個涂膜每個視野細菌總數(shù) 細菌密度=- 該涂膜的觀察視野數(shù) 細菌密度指數(shù)（BI）的計算 按照細菌學指數(shù)分級表，找到各涂膜細菌密度 對應的分級，按一下公示計算BI： 各涂膜細菌指數(shù)分級（+）的總和 BI=- 涂片的涂膜數(shù) 舉例： 一張涂片各涂膜對應細菌指數(shù)分級分別為：眉眶（3+）、耳垂 （3+）、下頜（3+）、皮損1（4+）、皮損2（4+）、皮損3（3+）， 其BI值應為（3+3+3+4+4+3）。 如果，只取了常規(guī)部位和皮損1、皮損2，BI=（3+3+3+4+4） 查

19、菌結(jié)果與臨床各型關(guān)系如下查菌結(jié)果與臨床各型關(guān)系如下 觀察或試驗ITTBTBBBLLL 皮損數(shù)量一個或少一個 一個或很 少 較多或多很多 皮損大小小不定不定不定小 皮損表面不定干燥屑干燥光亮光亮 毛發(fā)情況稍減少 缺少或減 少 減少稍減少不影響 感覺喪失輕或無有有輕無或輕微 皮損AFB 陰性或陽 性 陰性12+35+46+ 皮損中麻風菌數(shù)量及動態(tài)變化 皮膚中麻風菌數(shù)量視病人類型和疾病發(fā)展階段 而定，也與治療有關(guān)。 一般來說，皮膚顏色較淡，不高起、表面光 滑、數(shù)量多，感覺障礙不明顯的皮膚，查菌通常 陽性。而皮膚高起干燥，感覺障礙明顯，特別是 色紅，通常查菌陰性或很少。值得注意是，有些 界線類病人，皮

20、膚損害似為非活動性皮損，呈麻 木萎縮，但查菌可達34個加號。 皮膚涂片中ML的數(shù)量及形態(tài)，隨著病情及治 療而發(fā)生變化 經(jīng)有效治療后： 細菌指數(shù)（BI）及形態(tài)指數(shù) （MI）均下降， MI下降較BI為早。 LL病人的細菌指 數(shù)大約每年下降。 如果下降過快，則提示原分型可能不夠準確； 如果下降過慢，則表明病人沒有規(guī)則服藥或存 在耐藥菌株。 不可靠的查菌結(jié)果會對病例分型及治療帶不可靠的查菌結(jié)果會對病例分型及治療帶 來不少問題來不少問題麻風皮膚查菌質(zhì)量控制麻風皮膚查菌質(zhì)量控制 查菌假陰性時： 多菌型（MB）病人可能被誤診為少菌型（PB)， 病人得不到應有的治療。 如果以細菌陰轉(zhuǎn)為停止服藥的依據(jù)，則導致過

21、 早停藥。 查菌假陽性時：PB病人將按MB進行治療，造成治療 上的浪費，延長了治療期。 如果一個病人細菌指數(shù)下降不明顯： 首先尋找原因： 1）取材涂點數(shù)量是否一致？ 2）查菌部位是否一致？ 3）取材人是否同一人，導致取材有深淺差別？ 4）是否細菌數(shù)量仍在同一級別內(nèi)，導致顯示不出差別？ 如平均每個視野1-10條的3+判斷，1-3條和4-6條以及7-10 條都是3+，但數(shù)量有差別。同樣11-30條，31-60條以及61- 100條都是4+， 但是菌量有差別。又是菌量在下降，當時從 指數(shù)上看不出差別。 5）確實是耐藥，需要做鑒定。 如細菌下降過快，提示分型錯誤； 如下降緩慢，提示病人服藥不規(guī)則或細菌出現(xiàn)耐藥； 在界線類患者，有效治療后細菌數(shù)量可下降很快，特別是BB和BL 患者；