DNA第一代,第二代,第三代測序的介紹

1、原理是：核酸模板在DNA聚合酶、引物、4種單脫氧核苷三磷酸(d NTP其中 的一種用放射性P32標記)存在條件下復制時，在四管反應系統(tǒng)中分別按比例引 入4種雙脫氧核苷三磷酸(dd NTP )，因為雙脫氧核苷沒有3 -O H,所以只 要雙脫氧核苷摻入鏈的末端， 該鏈就停止延長， 若鏈端摻入單脫氧核苷， 鏈就可 以繼續(xù)延長。如此每管反應體系中便合成以各自 的雙脫氧堿基為 3端的一系列長度不等的核酸片段。反應終止后，分4個泳道進行凝膠電泳， 分離長短不一的核酸片段， 長度相鄰的片段相差一個堿基。 經過 放射自顯影后，根據(jù)片段 3端的雙脫氧核苷，便可依次閱讀合成片段的堿基排 列順序。 Sanger 法

2、因操作簡便，得到廣泛的應用。后來在此基礎上發(fā)展出多種 DNA測序技術，其中最重要的是熒光自動測序技術。熒光自動測序技術 熒光自動測序技術基于 Sanger 原理， 用熒光標記代替同位素標 記，并用成像系統(tǒng)自動檢測，從而大大提高了D NA測序的速度和準確性。20世紀80年代初 Jorgenson 和 Lukacs 提出了毛細管電泳技術 ( c a p il l ar y el ect r ophor es i s ) 。 1992 年美國的 Mathies 實驗室首先提出陣列毛細管電泳 ( c a p il l ar y ar r a y el ectr ophor es i s ) 新方法，并

3、采用激光聚焦熒光掃描檢測裝置，25 只毛細管并列電泳，每只毛細管在內可讀出 350 bp，DNA序列，分析效率可達 6 000 bp/h。1995年 Woolley研究組 用該技術進行測序研究，使用四色熒光標記法，每個毛細管長，在9min內可讀取150個堿基，準確率約 97 % 。目前， 應用最廣泛的應用生物系統(tǒng)公司 ( ABI ) 37 30 系列 自動測 序儀即是基于毛細管電泳和熒光標記技術的D NA測序儀。女口 ABI3730XL測序儀擁有96道毛細管 ， 4 種雙脫氧核苷酸的堿基分別用不同的熒光標記 ， 在通過毛細管時 不同長度的 DNA 片段上的 4 種熒光基團被激光激發(fā) ， 發(fā)出不

4、同顏色的熒光 ， 被 CCD 檢測 系統(tǒng)識別 ， 并直接翻譯成 DNA 序列。雜交測序技術 雜交法測序是 20 世紀 80 年代末出現(xiàn)的一種測序方法 ， 該方法不同于 化學降解法和 Sanger 法， 而是利用 DNA 雜交原理 ， 將一系列已知序列的單鏈寡核苷酸片 段固定在基片上 ， 把待測的 DN A 樣品片段變性后與其雜交 ， 根據(jù)雜交情況排列出樣品的 序列 序檢測速度快 , 采用標準化的高密度寡核苷酸芯片能夠大幅度降低檢測的成本，具 有部分第二代測序技術的特點。但 該方法誤差較大 , 且不能重復測定焦磷酸測序(pyrosequencing)技術是近年來發(fā)展起來的一種新的 DNA序列分

5、析技術，它通過核苷酸和模板結合后釋放的焦磷酸引發(fā)酶級聯(lián)反應， 促使熒光素 發(fā)光并進行檢測。既可進行DNA序列分析,又可進行基于序列分析的 單核苷酸多 態(tài)性(SNP)檢測及等位基因頻率測定 等。1 焦磷酸測序技術的原理及步驟焦磷酸測序是由DNA聚合酶(DNA polymerase)、三磷酸腺苷硫酸化酶(ATPsulfurylase) 、 熒光素酶 (1ueiferase) 和雙磷酸酶 (apyrase)4 種酶催化同一反 應體系的酶級聯(lián)化學發(fā)光反應，反應底物為5-磷酰硫酸(APS)和熒光素。反應體系還包括待測序DNA單鏈和測序引物。在每一輪測序反應中，加入1種dNTP 若該dNTP與模板配對，聚

6、合酶就可以將其摻入到引物鏈中并釋放出等摩爾數(shù)的 焦磷酸基團(PPi)。硫酸化酶催化APS和 PPi形成ATP后者驅動熒光素酶介導 的熒光素向氧化熒光素的轉化，發(fā)出與ATP量成正比的可見光信號，并由PyrogramTMW化為一個峰值，其高度與反應中摻人的核苷酸數(shù)目成正比。根據(jù)加 入dNTP類型和熒光信號強度就可實時記錄模板 DNA勺核苷酸序列。在實驗過程 中用a-硫化的三磷酸腺苷(dATPotS)代替三磷酸腺苷(dATP)以有效地被DNA聚合 酶利 用，而不被蟲熒光素識別。由于SpdATPetS可以降低dATPotS降解產物的 濃度，近年來，單鏈 DNA吉合蛋白(single strand DN

7、A binding protein ，SSBP) 和純化Spisomer dATPaS的使用dATPotS降解產物抑制雙磷酸酶活性的這一問題 得到較好解決，使得測序長度可達 100 bp ，拓展了該技術在遺羅氏454的GSFLX測序技術利用了焦磷酸測序原理，主要包括以下步驟：1) 文庫準備 將基因組DNA丁碎成300-800 bp長的片段(若是sn RNA或PCR 產物可以直接進入下一步)，在單鏈DN A的3端和5端分別連上不同的接 頭。2) 連接 帶接頭的單鏈DNA被固定在DNA捕獲磁珠上。每一個磁珠攜帶一個單 鏈 DNA 片段。隨后擴增試劑將磁珠乳化，形成油包水的混合物，這樣就形成了 許多

8、 只包含一個磁珠和一個獨特片段的微反應器 。3）擴增 每個獨特的片段在自己的微反應器里進行獨立的擴增（ 乳液 PCR） ，從而排除了其它序列的競爭。整個DNA片段文庫的擴增平行進行。對于每一個片段 而言，擴增產生幾百 萬個相同的拷貝。乳液 PC R 終止后，擴增的片段仍然結合在磁珠上。4）測序 攜帶D NA的捕獲磁珠被放入PTP板中進行測序。PTP孔的直徑（29 卩m ）只能容納一個磁珠（20卩m ）。放置在4個單獨的試劑瓶里的4種堿 基，依照T、A、C、G的順序依次循環(huán)進入PTP板，每次只進入一個堿基。如 果發(fā)生堿基配對 , 就會釋放一個焦磷酸。這個焦磷酸在ATP 硫酸化酶和熒光素酶的作用下

9、，釋放出光信號，并實時地被儀器配置的高靈敏度 CCD 捕獲到。有 一個堿基和測序模板進行配對， 就會捕獲到一分子的光信號； 由此一一對應， 就 可以準 確、快速地確定待測模板的堿基序列與其它第二代測序平臺相比， 454 測序法的突出優(yōu)勢是較長的讀長， 目前 GSFLX 測序系統(tǒng)的序列讀長已超過 400 bp 。雖然 454平臺的測序成本比其他新一代測 序 平臺 要高很多，但對于那些需要長讀長的應 用，如 從頭測 序，它仍是最 理想的選擇。Solexa 測序技術Illumna 公司的新一代測序儀 Genome Analyzer 最早由 Solexa 公司研發(fā)，利用 合成測序 （Sequencin

10、g by Synthesis） 的原理，實現(xiàn)自動化樣本制備及大規(guī)模平 行測序。 Genome Analyzer 技術的基本原理是將基因組 DN A 打碎成約 100-200 個堿基的小片段，在片段的兩個末端加上接頭（adapter ）。將DNA片段變成單鏈后通過 接頭與芯片表面的引物堿基互補而使一端被固定在芯片上 。另外一端隨 機和附近的另外一個引物互補 ，也被固定住，形成橋狀結構。通過 30輪擴增反 應，每個單分子被擴增大約1 000倍，成為單克隆的DNA簇，隨后將DNA簇線 性化。在下一步合成反應中，加入改造過的DNA聚合酶和帶有4種熒光標記的d NTP在DNA合成時，每一個核苷酸加到引物

11、末端時都會釋放出焦磷酸鹽，激發(fā) 生物發(fā)光蛋白發(fā)出熒光。 用激光掃描反應板表面， 在讀取每條模板序列第一輪反 應所聚合上去的核苷酸種類后， 將這些熒光基團化學切割，恢復 3端黏性，隨 后添加第二個核苷酸 。如此重復直到每條模板序列都完全被聚合為雙鏈。這樣， 統(tǒng)計每輪收集到的熒光信號結果， 就可以得知每個模板 DN A 片段的序列 GenomeAnalyzer 系統(tǒng)需要的樣品量低至 100ng ，文庫構建過程簡單，減少了樣 品分離和制備的時間，配對末端讀長可達到 2X 50 bp，每次運行后可獲得超過 20 G B 的高質量過濾數(shù)據(jù)，且運行成本較低，是性價比較高的新一代測序技術。 SOLiD 測序

12、技術SOLiD 全稱為 Supported Oligo Ligation Detetion，是 ABI (應用生物系統(tǒng))公司于 2007 年底推出的全新測序技術，目前已發(fā)展到 SOLiD 3 Plus 。與 454和 Solexa 的合成測序不同， S OLiD 是通過 連接反應 進行測序的。其基本原理是以 四色熒光標記的寡核苷酸進行多次連接合成 ，取代傳統(tǒng)的聚合酶連接反應。具體步驟包括：1) 文庫準備 SOLiD 系統(tǒng)能支持兩種測序模板：片段文庫 ( fragment library )或配對末端文庫(mate-paired library)。片段文庫就是將基因組 DNA打斷，兩頭加上接頭，

13、制成文庫。該文庫適用于 轉錄組測序、RNA定量、mi RNA研究、 重測序、3 ，5 RACE、甲基化分析及ChIP測序等。配對末端文庫是將基 因組 D NA 打斷后， 與中間接頭連接 ，環(huán)化，然后用 EcoP15 酶切，使中間接頭 兩端各有 27bp 的堿基，最后加上兩端的接頭，形成文庫。該文庫適用于 全基因 組測序、SNP分析、結構重排及拷貝數(shù)分析 等。2) 擴增 SOLiD 用的是與 454 技術類似的乳液 PCR 對要測序的片段進行擴增。在微反應器中加入測序模板、PCR反應元件、 微珠和引物，進行乳液PCR(emulsi on PCR )。PCR反應結束后，磁珠表面就固定有拷貝數(shù)目巨大

14、的同一DNA莫板的擴增產物。3) 微珠與玻片連接 乳液PCR完成之后，變性模板，富集帶有延伸模板的微珠， 微珠上的模板經過 3修飾，可以與玻片共價結合。 SOLiD 系統(tǒng)最大的優(yōu)點就是 每張玻片能容納更高密度的微珠 ，在同一系統(tǒng)中輕松實現(xiàn)更高的通量。 含有 DNA 模板的磁珠共價結合在SOLiD玻片表面，SOLiD測序反應就在SOLiD玻片表面進 行。每個磁珠經SOLiD測序后得到一條序列。4) 連接測序 SOLiD 連接反應的底物是 8 堿基單鏈熒光探針混合物 。探針的 5 端用 4 種顏色的熒光標記，探針 3端第 1、2 位堿基是 ATCG 4種堿基中的任 何兩種堿基組成的堿基對，共 16

15、 種堿基對，因此 每種顏色對應著 4 種堿基對 。 3 - 5 位是隨機的 3 個堿基。 6 - 8 位是可以和任何堿基配對的特殊堿基 。單向 SOLiD測序包括5輪測序反應，每輪測序反應含有多次連接反應，得到原始顏色 序列。SOLiD序列分析軟件根據(jù)“雙堿基編碼矩陣”把堿 基序列轉換成顏色編碼序列，然后與 SOLiD 原始顏色序列進行比較。由于雙堿 基編碼規(guī)則中一種顏色對應 4 種堿基對，前面堿基對的第二個堿基是后面堿基對 的第一個堿基 , 所以一個錯誤顏色編碼就會引起連鎖的解碼錯誤， 改變錯誤顏色 編碼之后的所有堿基。SOLiD序列分析軟件可以對測序錯誤進行自動校正，最后 解碼成原始序列。

16、因為SOLiD系統(tǒng)采用了雙堿基編碼技術，在測序過程中對每個 堿基判讀兩遍， 從而減少原始數(shù)據(jù)錯誤， 提供內在的校對功能， 得到的原始堿基 數(shù)據(jù)的準確度大于 %，而在 15X 覆蓋率時的準確度可以 達到 9 % ，是目前新 一代基因分析技術中準確度最高的 。超高通量是SOLiD系統(tǒng)最突出的 特點，目前SOLiD3單次運行可產生50 GB的 序列數(shù)據(jù) , 相當于 17 倍人類基因組覆蓋度。第二代測序技術的應用1) 從頭測序 ( de-novo sequencing) 對于基因組未被測序過的生物，其基因組 測序需要從頭測序。由于受測序讀取長度的限制，新一代測序技術中只有 454 技術能獨立完成復雜基

17、因組如真核生物基因組的從頭測序工作。Solexa 和SOLiD技術只能完成簡單生物如細菌的基因組的從頭測序。在復雜基因組的從頭 測序中，將 Sol xa /S O L i D 與 45 4 技術或傳統(tǒng)的 Sanger 測序技術結合， 分別利用它們的高通量和較長讀長的優(yōu)勢， 可以大大降低測序成本， 提高測序速 度。2) 重測序 如果對照一個參考基因組， 新一代測序技術可以短時間內非常輕松的 完成一個基因組的重測序3) SNP研究 SNP全稱是 Single Nucleotide Polymorphism，意即單核苷酸多態(tài)性, 是指不同個體的基因組上單個核苷酸的變異，包括替換、缺失和插入。 SNP 是指變異頻率大于 1 % 的單核苷酸變異，人體許多表型差異、對藥物或疾病的易感性等等都可能與SNP有關4) 轉錄組及表達譜分析 基因表達譜指細胞在特定的條件下表達的所有基因。 以 往的基因表達譜分析主要依靠基因芯片技術， 該技術需要依賴已知的基因序列來 設計探針，通過熒光標記和雜交， 根據(jù)熒光的強度計算表達量的多少， 誤差較大 , 而且無法檢測未知基因的表達量。第二代測序技術可對單個細胞樣品