高效液相色譜儀中反相HPLC柱子的清潔和再生

1、高效液相色譜儀中反相 HPLC 柱子的清潔和再生反相色譜是迄今在高效液相色譜中應用最廣泛的技術， 主要是因為它適用于分析極大多數(shù)的 非極性物質和很多的可離子化的及離子化合物。 大多數(shù)用于反相色譜的固定相都是天然的疏水物 質，因此， 分析物是按照它們與固定相的疏水相互作用的大小來分離的，含有疏水的機制也能以同樣的保留方式分離。固定相上還有少數(shù)物質，如混合相（例如苯基己基）、末端封閉和非末端封閉種類和極性 嵌入相也存在于這些鍵合硅膠上。 還有很多填料用于反相色譜， 包括聚合物， 聚合物表面涂上 硅膠和氧化鋁，無機有機混合物，涂層氧化鋯，和石墨化碳。 不同種類的固定相有他們自己的 優(yōu)點和缺點。反相色

2、譜柱利用各種流動相和添加物可以有很多的應用。一些技術利用添加物可以改變或修飾填料的表面。有時候這些添加物有可能會污染鍵合相表面。硅膠表面因為有疏水鍵合相而有一些別的化學性質。 殘留的硅烷醇存在于所有的硅膠鍵合填 料中。這些硅烷醇具有弱酸性，因此能與某些待分析物合基質成分，特別是堿性成分。 因為硅烷 醇的 pKa 值大約是 4.5，離子化能在中性 pH 條件下發(fā)生因此與陽離子產生靜電相互作用就有可 能發(fā)生。較老的 A 型硅膠能容納高濃度金屬離子（有時候 100ppm 或更多） ，而這能使硅膠表面 的酸性更大甚至能發(fā)生金屬鰲合現(xiàn)象或清除一些化合物。 殘留硅烷醇在非末端封閉的硅膠合短鏈 鍵合相如 C

3、2 或 C4 上更讓人煩惱。使用者必須清楚他們所用的固定相表面特殊性質和可能的分析物固定相表面的相互作用， 這樣當他們使用反相方法時才能考慮到可能的基質相互作用。例如， 非常疏水的樣品基質如玉米油，高芳香物質， 和蠟能粘住固定相裝填表面并且改變他們的性質。 含有蛋白質物質的生物流體 也能吸附在裝填表面。盡管分析者想盡最大努力來保護 HPLC 柱子，某些分析物基質污染能 使固定相受到有害的影響。當柱子被污染，它的色譜行為和沒被污染的柱子比會有些不同。被污染的柱子能產生反壓問 題。 被污染的反相柱子必須清洗和再生才能恢復原來的操作條件。這部分的 柱子觀察 將討論可行的方法使柱子回復原來的或差不多原

4、來的狀態(tài)。什么導致反相柱子污染產生？通常，樣品中含有一些對分析者來說不感興趣的東西。鹽、脂質、含脂物質、腐質酸、疏水 蛋白質和其它一些生物物質是一些可能在使用時與 HPLC 柱發(fā)生相互作用的物質。這些物質有 比分析者的目標物或少或大的保留值。 那些保留值較小的物質如鹽類一般來說在空體積時就被沖 出色譜柱。 這些非目標產物的干擾能被檢測器檢測到而且能形成色譜峰， 氣泡， 基線上移或者是 負峰。如果樣品成分在柱子中有很強的保留而且流動相溶液成分不足以把這些物質洗脫下來， 次上樣后， 這些吸附在柱子表面的物質通常就會積累在柱頭。 這些行為通常只有通過平行實驗才 能發(fā)現(xiàn)。有著中等保留值的樣品能被緩慢洗

5、出而且表現(xiàn)為寬峰，基線擾動，或者基線漂移。有時候這些被吸附的樣品成分累積到一定程度足以使他們開始形成新的固定相。 分析物能與 這些雜質作用形成一定的分離機理。保留時間會波動，拖尾會出現(xiàn)。如果足夠的污染產生， 柱子 的反壓能超過泵所能承受的最大壓力，使柱子無法工作以及在堵塞處產生空體積。清洗硅膠鍵合柱子再生被污染 HPLC 柱子的關鍵是知道污染物的性質并且能找到適當?shù)娜軇﹣砣コ?。如果?染是因為重復進樣時強保留物質的累積引起的， 利用簡單的步驟來除去這些污染物往往能恢復其 色譜行為。有時候，經過多次操作以后的色譜柱用90100%的溶劑B （雙溶劑反相系統(tǒng)中較強的溶劑）沖洗 20 個體積可以清除污

6、染物。例如，柱子中殘留的脂質就能用非水溶劑如甲醇、乙 晴、四氫呋喃。如果你使用的是緩沖液系統(tǒng)，不要直接切換到強溶劑，突然轉換到高濃度有機溶劑可能會使 HPLC 流動體系中的緩沖液沉淀，這樣會導致更大的問題如柱頭堵塞、管道堵塞、 泵泄漏、活塞損傷或進樣閥轉軸失靈。應該先用無緩沖流動相（即把緩沖液換成水）。沖洗510 個體積以后才更換強溶劑。有時候，強溶劑也沒法把殘留在色譜柱上的污染物洗掉。那么更強的溶劑或者是一系列溶劑 就有必要用來清洗柱子樂， 如果污染物是非生物物質， 使用者可以跳過一個或多個另外的有機溶 劑去除污染物。溶劑與溶劑之間的組合有很多。到柱子廠家的網頁上能找到推薦的溶劑系統(tǒng)。一般來

7、說， 所有的清洗方法都有類似的形式。 所用的溶劑都是隨溶劑強度增加， 經常最后一個溶 劑是非常疏水的（如醋酸乙酯甚至是烴）， 可以用來溶解非極性物質如脂質和油類。 我們必須保 證一系列溶劑中每個溶劑都能與下一個溶劑互混。清洗過程要結束時， 必須借助一個中等強度能互混的溶劑而回到原始溶劑系統(tǒng)。 例如， 異丙醇是一個非常好的作為中間步驟的溶劑， 因為它能 與正己烷或二氯甲烷互溶又能與水相溶劑互溶。但是異丙醇粘度非常大， 必須確保較低的流速以免使泵壓過高。當然，如果使用紫外檢測器的話，避免溶劑在紫外區(qū)域有吸收，要不然需使用大量的溶劑沖洗才能使基線平穩(wěn)。對于典型的硅膠鍵合柱來說如果沒有緩沖溶液的話推薦

8、使用以下溶劑系列：100 %甲醇100 %乙晴75%乙晴 25 %異丙醇100 %異丙醇100%二氯甲烷100正己烷用二氯甲烷或正己烷以后，由于溶劑相容性柱子必須用異丙醇沖洗后才能用原來的水相溶劑。每種溶劑至少沖洗 10個柱體積。如250mM 4.6mmHPLC分析柱，分析者可以用 12ml/min 的流速來沖洗，要回復原來的溶劑體系，不需要每一步都沖洗，可以跳過中間步驟。 中間步驟推薦使用異丙醇， 然后用沒有緩沖的流動相， 最后回復起始流動相配置。 四氫呋喃是另外一種比較 受歡迎的去除污染的溶劑。如果使用者懷疑柱子被嚴重污染，可以二甲基亞砜（DMSO ）或者二甲基甲酰銨和水按 50：50 的

9、比例混合用低于 0.5ml/min 的流速流過色譜柱。成功再生反相柱子 是一個非常耗時間的過程，溶劑沖洗可以利用梯度系統(tǒng)過夜操作。問：用 HPLC 進行分析時保留時間有時發(fā)生漂移， 有時發(fā)生快速變化， 原因何在 ?如何解決 ? 答：關于漂移問題：1 、溫度控制不好，解決方法是采用恒溫裝置，保持柱溫恒定2、流動相發(fā)生變化，解決辦法是防止流動相發(fā)生蒸發(fā)、反應等3、柱子未平衡好，需對柱子進行更長時間的平衡關于快速變化問題1 、流速發(fā)生變化，解決辦法是重新設定流速，使之保持穩(wěn)定2、泵中有氣泡，可通過排氣等操作將氣泡趕出。3、流動相不合適，解決辦法為改換流動相或使流動相在控制室內進行適當混合問：液相色譜

10、中峰出現(xiàn)拖尾或出現(xiàn)雙峰的原因是什么 ?答： 1、篩板堵塞或柱失效，解決辦法是反向沖洗柱子，替換篩板或更換柱子。2、存在干擾峰，解決辦法為使用較長的柱子，改換流動相或更換選擇性好的柱子問： HPLC 靈敏度不夠的主要原因及解決辦法答： 1 、樣品量不足：解決辦法為增加樣品量2、樣品未從柱子中流出：可根據(jù)樣品的化學性質改變流動相或柱子3、樣品與檢測器不匹配：根據(jù)樣品化學性質調整波長或改換檢測器4、檢測器衰減太多：調整衰減即可。5、檢測器時間常數(shù)太大：解決辦法為降低時間參數(shù)6、檢測器池窗污染：解決辦法為清洗池窗。7、檢測池中有氣泡：解決辦法為排氣。8、記錄儀測壓范圍不當：調整電壓范圍即可。9、流動相

11、流量不合適：調整流速即可。10、檢測器與記錄儀超出校正曲線：解決辦法為檢查記錄儀與檢測器，重作校正曲線。問：做 HPLC 分析時，柱壓不穩(wěn)定，原因何在?如何解決 ?答：原因可能有：1、泵內有空氣，解決的辦法是清除泵內空氣，對溶劑進行脫氣處理；2、比例閥失效，更換比例閥即可。3、泵密封墊損壞，更換密封墊即可。4、溶劑中的氣泡，解決的辦法是對溶劑脫氣，必要時改變脫氣方法；5、系統(tǒng)檢漏，找出漏點，密封即可。6、梯度洗脫，這時壓力波動是正常的。問：我最近更換了另一種牌號的 ODS 柱，雖然分離情況仍可以，但保留時間不能重現(xiàn)，為什么 答：這是因為被分析物可能具有形成氫健的能力。盡管過去幾年來，填料的制造

12、技術有了極大 的提高，但不同的廠商的 ODS 填料表面硅醇基的濃度不同。正是這些硅醇基可能與樣品發(fā)生相 互作用。因此，同一被分析物中的各組分在不同牌號的 ODS 柱上的相對保留時間就可能不同。 在流動相中加入少量競爭物，如三乙基胺 (TEA) ，將會使硅醇基的成鍵能力飽和，從而保證不同 牌號柱子上的相對保留時間具有較好的重現(xiàn)性。問：我購買的 HPLC 柱驗收測試時柱壓過高，請問為什么 ?答：柱壓過高是 HPLC 柱用戶最常碰到的問題。其原因有多方面，而且常常并不是柱子本身的 問題，您可按下面步驟檢查問題的起因。1、拆去保護柱，看柱壓是否還高，否則是保護柱的問題，若柱壓仍高，再檢查；2、把色譜柱

13、從儀器上取下， 看壓力是否下降， 否則是管路堵塞， 需清洗， 若壓力下降， 再檢查。3、將柱子的進出口反過來接在儀器上，用10 倍柱體積的流動相沖洗柱子， ( 此時不要連接檢測器，以防固體顆粒進入流動性 )。這時，如果柱壓仍不下降，再檢查；4、更換柱子入口篩板，若柱壓下降，說明你的溶劑或樣品含有顆粒雜質，正是這些雜質將篩板 堵塞引起壓力上升。若柱壓還高，請與廠商聯(lián)系。一般情況下， 在進樣器與保護柱之間接一個在 線過濾器便可避免柱壓過高的問題， SGE 提供的 Rheodyne 7315 型過濾器就是解決這一問題的最 佳選擇。高效液相色譜儀的幾個使用問題1. 色譜柱中的流動相會排干嗎？不少做色譜

14、分離試驗的人遇到過這樣的情形：不慎未及時補充流動相，泵將溶劑瓶中的流動 相吸干了， HPLC 系統(tǒng)由此而停止工作了。 如此情況是否會損壞色譜柱？泵是否已將色譜柱中所 有流動相都排干了？色譜柱還能使用嗎？事實上， 如果泵將溶劑瓶中的流動相吸干， 并不會造成 色譜柱的損壞。即使泵中充滿了空氣， 泵也不會將空氣排入色譜柱。因為泵只能輸送液體， 而不 能輸送空氣。 相比之下， 另一個更可能發(fā)生的情況是忘記蓋上色譜柱兩端的密封蓋或蓋子太松而 使色譜柱變干。 同樣， 整個色譜柱干涸的情況不太容易發(fā)生， 多半可能只是色譜柱兩端的幾個毫 米變干了， 因揮發(fā)掉所有溶劑是色譜柱變干需要相當長的時間。 即使色譜柱真

15、的變干了， 也不一 定就不可救藥了?？梢試L試用一種完全脫氣的、表面張力低的溶劑 （如經氦氣脫氣的甲醇） 沖洗 色譜柱以除去氣體。 較低的表面張力有助于浸潤填料表面； 已脫氣的溶劑應該能夠溶解并去除滯 留在填料中的氣體。色譜柱大約需要（以 1mL/min 的流速）沖一個小時或更多的時間被徹底浸 潤，恢復到正常狀態(tài)。2. 使用 PEEK （ polyetheretherketone ）管路和接頭需要注意什么問題？ 如果經常需要改變流路或更換不同品牌的色譜柱， 使用 PEEK 材料制成的管路和接頭會非常 方便。 PEEK 管路容易連接； PEEK 接頭不僅無需工具，手擰即可固定，而且容易調節(jié)錐箍之外

16、 的管路長度，方便與不同品牌或規(guī)格的色譜柱相連接。使用此類材料的管路需要注意的是： PEEK 對鹵代烷烴和四氫呋喃的兼容性不好。 雖然未觀察 到上述溶劑溶解 PEEK 材料的明顯跡象， 但 PEEK 遇到上述溶劑會變脆。 另一個西藥考慮的因素 是壓力限。不銹鋼管可耐受 6000psi 的壓力，但 PEEK 管只能耐受近 4000psi （但多數(shù) HPLC 應 用系統(tǒng)壓力不會超過 3000psi ）。使用 PEEK 接頭時則無需擔心接頭耐溶劑性能，因為接頭幾乎或很少與溶劑直接接觸。但手 擰固定的 PEEK 接頭壓力限低于不銹鋼管， 因而壓力太高時， 可能會使接頭在管路上滑動而產生 死體積或漏液。3. 如何預防液相泵的故障 :要保持泵的良好操作性能 ,必須維護系統(tǒng)的清潔 ,保證溶劑和試劑的質量 ,對流動相進行過濾 和脫氣 .下面列出預防泵故障的幾項措施 :1）