RNA提取系列PPT課件

1、RNA提取系列 核酸純化系統(tǒng)核酸純化系統(tǒng) RNA提取專項提取專項 RNA提取系列 1RNA相關(guān)知識及提取原理相關(guān)知識及提取原理 1RNA提取流程提取流程 1實驗舉例及實驗中注意點實驗舉例及實驗中注意點 1特殊組織特殊組織RNA的提取的提取 1RNA的評價與鑒定的評價與鑒定 1RNA的保護的保護 RNA提取系列 AAAAAA RNA相關(guān)知識及提取原理相關(guān)知識及提取原理細胞中細胞中RNA的種類和含量的種類和含量 AAAAAA tRNA mRNA rRNA RNase 不同豐度不同豐度組織名稱組織名稱樣品量樣品量總總RNARNA含量含量 高豐度高豐度 肝臟肝臟1mg1mg 2-4g2-4g脾臟脾臟1

2、mg1mg 心臟心臟1mg1mg 中豐度中豐度 大腦大腦1mg1mg 0.05-2g0.05-2g 胚胎胚胎1mg1mg 腎臟腎臟1mg1mg 肺肺1mg1mg 低豐度低豐度 膀胱膀胱1mg1mg 0-0.05g0-0.05g骨骨1mg1mg 脂肪脂肪1mg1mg 高豐度高豐度 成纖細胞成纖細胞10105 5 0.5-1g0.5-1g 人白細胞人白細胞10105 5 中豐度中豐度 酵母酵母10105 50.5-1.5g0.5-1.5g 擬南芥葉片擬南芥葉片1mg1mg0.2-0.5g0.2-0.5g 低豐度低豐度 煙草葉片煙草葉片1mg1mg 0.05-0.1g0.05-0.1g 玉米葉片玉米

3、葉片1mg1mg RNA提取系列 RNA相關(guān)知識及提取原理相關(guān)知識及提取原理RNA的裂解原理 異硫氰酸胍/苯酚法 細胞在變性劑異硫氰酸胍的作用下被裂解，同時核蛋 白體上的蛋白變性，核酸釋放 釋放出來的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而 分別位于整個體系中的中間相和水相，從而得以分離 胍鹽/-巰基乙醇法 鹽酸胍裂解樣本，抑制RNase的活性 -巰基乙醇變性蛋白 RNA提取系列 RNA相關(guān)知識及提取原理相關(guān)知識及提取原理RNA吸附原理 吸附材料吸附材料純化原理純化原理 硅基質(zhì)硅基質(zhì) 高鹽低高鹽低pHpH值結(jié)合核酸值結(jié)合核酸 低鹽高低鹽高pHpH值洗脫值洗脫 陰離子交換樹脂陰離子交換樹脂

4、低鹽高低鹽高pHpH值結(jié)合核酸值結(jié)合核酸 高鹽低高鹽低pHpH值洗脫值洗脫 磁珠磁珠 磁性微粒掛上不同基團可磁性微粒掛上不同基團可 吸附并攜帶吸附并攜帶RNARNA 沉淀法沉淀法 介質(zhì)吸附介質(zhì)吸附 RNA提取系列 1RNA相關(guān)知識及提取方法原理相關(guān)知識及提取方法原理 1RNA提取流程提取流程 1實驗舉例及實驗中注意點實驗舉例及實驗中注意點 1特殊組織特殊組織RNA的提取的提取 1RNA的評價與鑒定的評價與鑒定 1RNA的保護的保護 RNA提取系列 RNA提取流程 1、樣本前處理 2、細胞裂解 3、 RNA的純化及獲得 RNA提取系列 RNA提取流程 樣品前處理注意點 選擇新鮮血液，不得超過選擇

5、新鮮血液，不得超過4 4小時小時 選擇新鮮的幼嫩組織選擇新鮮的幼嫩組織 選擇處于生長旺盛的時期收集細胞選擇處于生長旺盛的時期收集細胞 選擇新鮮組織，生長旺盛的組織選擇新鮮組織，生長旺盛的組織 RNA提取系列 可將新鮮血液先進行紅細胞裂解，得到的白細胞可將新鮮血液先進行紅細胞裂解，得到的白細胞 然后加入一定量的然后加入一定量的TRNzolTRNzol，-70-70保存較長時間保存較長時間 去掉培養(yǎng)基，加入一定量去掉培養(yǎng)基，加入一定量TRNzolTRNzol -70 -70 保存較長時間保存較長時間 推薦使用推薦使用專門的專門的RNARNA樣品樣品 儲存液儲存液進行儲存進行儲存 液氮或加入液氮或加

6、入RNaseRNase抑制劑中保存，抑制劑中保存， 避免反復凍融避免反復凍融 RNA提取流程 樣品前處理中如何保存樣本 RNA提取系列 樣品的前處理方式 RNA提取流程 樣本前處理的目的：離散，均一，細胞集或細胞液 液氮研磨液氮研磨 勻漿或液氮研磨勻漿或液氮研磨 應用紅細胞裂解液處理應用紅細胞裂解液處理 蛋白酶蛋白酶K K處理處理 RNA提取系列 RNA提取流程 處理樣品量 RNA得率 實際得率 預期得率 最大量 RNA提取系列 RNA提取流程 RNA提取系列 1、樣本前處理樣本前處理 2、細胞裂解細胞裂解 3、 RNA的純化及獲得的純化及獲得 RNA提取流程 RNA提取系列 RNA提取流程細

7、胞裂解，以釋放RNA 異硫氰酸胍異硫氰酸胍/酚酚TRNzol總總RNA提取試劑提取試劑 獨特配方獨特配方-RNAplant植物植物RNA提取試劑提取試劑 胍鹽胍鹽/-巰基乙醇巰基乙醇RNAprep系列系列RNA提取試劑盒提取試劑盒 RNA提取系列 RNA提取流程 1、樣本前處理 2、細胞裂解 3、 RNA的純化及獲得 RNA提取系列 RNA提取流程 RNA的純化及獲得 RNA純化要求 1 1 純化后不應存在對酶純化后不應存在對酶( (如逆轉(zhuǎn)錄酶如逆轉(zhuǎn)錄酶) )有抑制作用物質(zhì)有抑制作用物質(zhì) 2 2 排除有機溶劑和金屬離子的污染排除有機溶劑和金屬離子的污染 3 3 蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子等的污染降

8、低到最低程度蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子等的污染降低到最低程度 4 4 排除排除DNADNA分子的污染分子的污染 RNA提取系列 1RNA相關(guān)知識及提取原理相關(guān)知識及提取原理 1RNA提取流程提取流程 1實驗舉例及實驗中注意點實驗舉例及實驗中注意點 1特殊組織特殊組織RNA的提取的提取 1RNA的評價與鑒定的評價與鑒定 1RNA的保護的保護 RNA提取系列 實驗舉例 l 使用試劑（以TRNzol A為例） l使用試劑盒（以RNAprep pure試劑盒為例） RNA提取系列 操操 作作 流流 程程 樣品前處理、細胞裂解樣品前處理、細胞裂解 試劑試劑試劑盒試劑盒 純化純化 沉淀沉淀 加入吸附柱加入吸附

9、柱 洗滌洗滌 溶解溶解RNARNA沉淀沉淀 獲得獲得RNARNA產(chǎn)物產(chǎn)物 加緩沖液加緩沖液 漂洗漂洗 RNARNA洗脫收集洗脫收集 RNA提取系列 細胞細胞 基因組基因組DNA 水相 有機相 RNA 氯仿氯仿 純化純化 pH5.7 離心離心 加入裂解液加入裂解液 (TRNzol-A+) 實驗舉例實驗舉例應用應用TRNzol-A+提取動物細胞提取動物細胞RNA 細胞選擇細胞選擇 貼壁細胞貼壁細胞 懸浮細胞懸浮細胞 樣品處理量與加入的樣品處理量與加入的TRNzol-A+的量要對應的量要對應 1mlTRNzol-A+對應：對應： 1 血液血液0.2-1ml 2 動植物組織動植物組織30-50mg 3

10、 貼壁細胞：每貼壁細胞：每10cm2培養(yǎng)面積培養(yǎng)面積 4 懸浮細胞：懸浮細胞：5-10106細胞細胞 RNA提取系列 等體積異丙醇沉淀等體積異丙醇沉淀70乙醇洗滌沉淀乙醇洗滌沉淀晾干溶解晾干溶解 RNA吸附柱吸附柱去蛋白液去蛋白液漂洗漂洗洗脫洗脫 水相水相 RNA 傳統(tǒng)方法：有機溶劑抽提，得率高傳統(tǒng)方法：有機溶劑抽提，得率高 柱純化法：純度高柱純化法：純度高 實驗舉例實驗舉例應用應用TRNzol-A+提取動物細胞提取動物細胞RNA RNA提取系列 圖片說明：圖片說明： M: TIANGEN Marker III A: A公司同類產(chǎn)品提取動物細胞結(jié)果公司同類產(chǎn)品提取動物細胞結(jié)果 T: TIANG

11、EN公司公司TRNzol-A 提取動物細胞結(jié)果 提取動物細胞結(jié)果 試驗材料：試驗材料： Hela cell/10Hela cell/106 6 實驗方法：實驗方法： TIANGENTIANGEN公司公司 TRNzol-ATRNzol-A+ + A A公司同類產(chǎn)品公司同類產(chǎn)品 試驗結(jié)果：試驗結(jié)果： 得率：得率：TRNzol-ATRNzol-A+ +得率與得率與A A公司同公司同 類產(chǎn)品略高類產(chǎn)品略高 純度：純度： 經(jīng)經(jīng)TRNzol-ATRNzol-A+ +純度較高，純度較高， 無明顯無明顯DNADNA、蛋白殘留、蛋白殘留 M TA 1 2 3 4 5 6 實驗舉例實驗舉例應用應用TRNzol-A

12、+提取動物細胞提取動物細胞RNA RNA提取系列 實驗注意事項應用TRNzolA的注意點 前處理 裂解 沉淀 洗滌 抽提 溶解 RNA降解 處理樣品量 上清吸取，雜質(zhì)去除 適量異丙醇 乙醇，鹽離子殘留 RNA不宜太干 RNA提取系列 操操 作作 流流 程程 樣品前處理、細胞裂解 試劑試劑試劑盒試劑盒 純化純化 沉淀沉淀 加入吸附柱加入吸附柱 洗滌洗滌 溶解溶解RNARNA沉淀沉淀 獲得獲得RNARNA產(chǎn)物產(chǎn)物 加緩沖液加緩沖液 漂洗漂洗 RNARNA洗脫收集洗脫收集 RNA提取系列 實驗舉例應用RNAprep pure提取動物組織 動物組織動物組織 研磨或勻漿研磨或勻漿 裂解裂解 結(jié)合結(jié)合 漂

13、洗漂洗 洗脫洗脫 植物組織30-50mg 動物組織10-20mg 懸浮細胞107 貼壁細胞10cm2 血液0.5-1.5ml RNA提取系列 胍鹽、胍鹽、-巰基乙醇巰基乙醇 裂解細胞滅活裂解細胞滅活RNase RNA在在高鹽低高鹽低pH值條件下與硅膠膜結(jié)合值條件下與硅膠膜結(jié)合 RW1除去蛋白殘留除去蛋白殘留 RW除去鹽離子除去鹽離子 在漂洗過程中利用在漂洗過程中利用DNase 除去基因組除去基因組 DNA RNA在底鹽高在底鹽高PH條件下被洗脫條件下被洗脫 用經(jīng)用經(jīng)DEPC處理過的水或?qū)ｉT的試劑來處理過的水或?qū)ｉT的試劑來 洗脫或溶解洗脫或溶解RNA 裂解裂解 結(jié)合結(jié)合 漂洗漂洗 洗脫洗脫 實驗

14、舉例應用RNAprep pure提取動物組織 RNA提取系列 胍鹽、胍鹽、-巰基乙醇巰基乙醇 裂解細胞滅活裂解細胞滅活RNase RNA在在高鹽低高鹽低pH值條件下與硅膠膜結(jié)合值條件下與硅膠膜結(jié)合 RW1除去蛋白殘留除去蛋白殘留 RW除去鹽離子除去鹽離子 在漂洗過程中利用在漂洗過程中利用DNase 除去基因組除去基因組 DNA RNA在底鹽高在底鹽高PH條件下被洗脫條件下被洗脫 用經(jīng)用經(jīng)DEPC處理過的水或?qū)ｉT的試劑來處理過的水或?qū)ｉT的試劑來 洗脫或溶解洗脫或溶解RNA 裂解裂解 結(jié)合結(jié)合 漂洗漂洗 洗脫洗脫 實驗舉例應用RNAprep pure提取動物組織 RNA提取系列 胍鹽、胍鹽、-巰基

15、乙醇巰基乙醇 裂解細胞滅活裂解細胞滅活RNase RNA在在高鹽低高鹽低pH值條件下與硅膠膜結(jié)合值條件下與硅膠膜結(jié)合 RW1除去蛋白殘留除去蛋白殘留 RW除去鹽離子除去鹽離子 在漂洗過程中利用在漂洗過程中利用DNase 除去基因組除去基因組 DNA RNA在底鹽高在底鹽高PH條件下被洗脫條件下被洗脫 用經(jīng)用經(jīng)DEPC處理過的水或?qū)ｉT的試劑來處理過的水或?qū)ｉT的試劑來 洗脫或溶解洗脫或溶解RNA 裂解裂解 結(jié)合結(jié)合 漂洗漂洗 洗脫洗脫 實驗舉例應用RNAprep pure提取動物組織 RNA提取系列 胍鹽、胍鹽、-巰基乙醇巰基乙醇 裂解細胞滅活裂解細胞滅活RNase RNA在在高鹽低高鹽低pH值條

16、件下與硅膠膜結(jié)合值條件下與硅膠膜結(jié)合 RW1除去蛋白殘留除去蛋白殘留 RW除去鹽離子除去鹽離子 在漂洗過程中利用在漂洗過程中利用DNase 除去基因組除去基因組 DNA RNA在底鹽高在底鹽高PH條件下被洗脫條件下被洗脫 用經(jīng)用經(jīng)DEPC處理過的水或?qū)ｉT的緩沖液處理過的水或?qū)ｉT的緩沖液 洗脫或溶解洗脫或溶解RNA 裂解裂解 結(jié)合結(jié)合 漂洗漂洗 洗脫洗脫 實驗舉例應用RNAprep pure提取動物組織 RNA提取系列 試驗材料：大鼠肝臟試驗材料：大鼠肝臟/10mg/10mg 實驗方法：實驗方法： TIANGENTIANGEN公司公司 RNAprep pure KitRNAprep pure K

17、it A A公司某柱式公司某柱式RNARNA提取試劑盒提取試劑盒 試驗結(jié)果：試驗結(jié)果： 得率：得率：RNAprep pure RNAprep pure 得率比得率比A A公司產(chǎn)公司產(chǎn) 品高品高1515左右左右 高純度：純度較高，且無鹽份殘留高純度：純度較高，且無鹽份殘留 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 TiangenA公司 OD260/280OD230/260 TIANGEN A公司 TIANGEN A公司 MTIANGENA 實驗舉例應用RNAprep pure提取動物組織 RNA提取系列 裂解裂解 結(jié)合結(jié)合 漂洗漂洗 洗脫洗脫 控制提取樣品量控制提取樣品量 防止堵柱或漏柱防

18、止堵柱或漏柱 鹽離子去除鹽離子去除 得率控制得率控制 實驗注意事項應用RNAprep pure的注意點 RNA提取系列 RNA回收率 實驗注意事項洗脫體積與得率關(guān)系 RNA提取系列 1RNA相關(guān)知識及提取方法原理相關(guān)知識及提取方法原理 1RNA提取流程提取流程 1實驗舉例及實驗中注意點實驗舉例及實驗中注意點 1特殊組織特殊組織RNA的提取的提取 1RNA的評價與鑒定的評價與鑒定 1RNA的保護的保護 RNA提取系列 一些特殊組織的RNA提取 纖維組織纖維組織 蛋白蛋白/脂肪含量高組織脂肪含量高組織 核酸核酸/RNase含量高組織含量高組織 植物組織植物組織/真菌組織真菌組織 徹底破碎徹底破碎

19、多次氯仿抽提多次氯仿抽提 減少處理量，多次氯仿抽提減少處理量，多次氯仿抽提 多次氯仿抽提，特殊試劑多次氯仿抽提，特殊試劑 RNA提取系列 1RNA相關(guān)知識及提取方法原理相關(guān)知識及提取方法原理 1RNA提取流程提取流程 1實驗舉例及實驗中注意點實驗舉例及實驗中注意點 1特殊組織特殊組織RNA的提取的提取 1RNA的評價與鑒定的評價與鑒定 1RNA的保護的保護 RNA提取系列 RNA的評價與鑒定的評價與鑒定 v 純度（純度（ ODOD260260 /OD /OD280280 ）：）： 紫外分光光度計進行測量（選擇正確的稀釋倍數(shù)，確保紫外分光光度計進行測量（選擇正確的稀釋倍數(shù)，確保ODOD26026

20、0 值在值在0.11.00.11.0之間，之間， 通常離心柱法稀釋通常離心柱法稀釋1010倍左右；溶液裂解法稀釋倍左右；溶液裂解法稀釋40405050倍）倍） ODOD260260 /OD /OD280280 1.9 1.9 1.9 2.12.1說明有部分降解說明有部分降解 v 得率得率 紫外分光光度計進行測量；紫外分光光度計進行測量； YieldYield ODOD260260稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù)40ng/ul40ng/ul v 電泳檢測電泳檢測 1 1瓊脂糖，瓊脂糖，6V/cm6V/cm，15min15min，上樣，上樣1 13 ul 3 ul M 1 2 M 1 2 DNA殘留 蛋白殘留 R

21、NA提取系列 1RNA相關(guān)知識及提取方法原理相關(guān)知識及提取方法原理 1RNA提取流程提取流程 1實驗舉例及實驗中注意點實驗舉例及實驗中注意點 1特殊組織特殊組織RNA的提取的提取 1RNA的評價與鑒定的評價與鑒定 1RNA的保護的保護 RNA提取系列 RNA的保護RNA的不穩(wěn)定性 4內(nèi)因：內(nèi)因：核糖殘基的核糖殘基的2和和3位置帶有羥基，易被水解位置帶有羥基，易被水解 4外因：外因：內(nèi)源、外源內(nèi)源、外源RNA酶含量豐富，加熱后仍能酶含量豐富，加熱后仍能 夠正確折疊恢復活性，不易失活夠正確折疊恢復活性，不易失活 RNA提取系列 RNA的保護常用的RNA酶抑制劑 RNA提取系列 RNA的保護提取前的

22、保護 材料樣品中的材料樣品中的RNA保護保護 RNA提取工作區(qū)提取工作區(qū)RNase的清除的清除 實驗耗材，器皿的實驗耗材，器皿的RNase清除清除 塑料器皿可用塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡水浸泡4-10小時，再滅菌小時，再滅菌 玻璃器皿可在玻璃器皿可在180烘烤烘烤4小時小時 塑料制品和槍頭避免交叉污染塑料制品和槍頭避免交叉污染 RNA提取系列 RNA的保護提取過程中的RNA保護 組織破碎 細胞裂解 實驗人員 適當?shù)钠扑榉椒?適量的裂解液 正確的操作和防護措施 RNA提取系列 RNA的保護保存過程中及后續(xù)實驗中的RNA保護 保存過程保存過程 RNAsafe 后續(xù)實驗后續(xù)實驗 RNasin

23、 RNA提取系列 TIANGEN讓您的RNA實驗更順利！ RNA提取系列 TIANGEN公司公司 RNA提取試劑提取試劑/盒盒 硅膠膜吸附法硅膠膜吸附法硅膠膜吸附法硅膠膜吸附法 DP419 RNAsimple 總總RNA 提取提取 試劑盒試劑盒 DP315 TIANamp 病毒病毒 DNA/RNA 提取試劑盒提取試劑盒 DP405 TRNzol 總總RNA提提 取試劑取試劑 DP421 TRNzol-A 總 總RNA提提 取試劑取試劑 DP407 RNAplant 植物總植物總 RNA提取提取 試劑試劑 RNAprep pure 系列試劑系列試劑 盒盒 DP430 RNAprep pure培養(yǎng)

24、細胞培養(yǎng)細胞 /細菌總細菌總RNA 提取試劑盒提取試劑盒 DP431 RNAprep pure 動物組織總動物組織總 RNA提取提取 試劑盒試劑盒 DP432 RNAprep pure 植物總植物總RNA 提取試劑盒提取試劑盒 DP433 RNAprep pure 血液總血液總RNA 提取試劑盒提取試劑盒 DP420 RNAprep pure 微量總微量總RNA 提取試劑盒提取試劑盒 RNA提取系列 TRNzolA 總RNA提取試劑 RNAprep pure 總RNA提取試劑盒 1 樣品預處理方式相同樣品預處理方式相同 2 裂解原理不同裂解原理不同 3 RNA純化原理不同：純化原理不同： TR

25、NzolA：有機溶劑抽提，異丙醇沉淀：有機溶劑抽提，異丙醇沉淀 RNAprep pure：硅基質(zhì)吸附膜分離純化：硅基質(zhì)吸附膜分離純化 分析比較 RNA提取系列 TRNzolA 系列系列 血液、細胞、動物組織血液、細胞、動物組織1.5 h RNAsimple血液、細胞、動物組織血液、細胞、動物組織1.5 h RNAprep pure系列系列 血液、細胞、動物組織血液、細胞、動物組織20-30 min RNA提取方法比較提取方法比較 RNA提取系列 材料處理量RNA得率 人白細胞7107 cells15-20 ug 成纖維細胞1106 cells5-7 ug 上皮細胞1106 cells8-15 ug 材料材料處理量處理量總總RNA產(chǎn)量產(chǎn)量OD260 / OD280 人類全血人類全血 250ul 2.64.0 ug 1.9 - 2.1 RNA提取得率比較提取得率比較 RNA提取系列 大鼠組織大鼠組織樣品量樣品量總總RNA量（量（g）OD260 / OD280 腦腦10 mg 8 1.9-2.1 心臟心臟10 mg 101.9-2.1 腎臟腎臟10 mg 351.9-2.1 肝臟肝臟10 mg 401.9-2.1 脾臟脾臟10 mg 351.9-2.1 肺肺10 mg 101.9-2.1 RNA提取系列 TIANGEN公司公司 RNA相關(guān)試劑相關(guān)試劑/盒盒 R