2021年現(xiàn)代分離技術(shù)5 2新 e-phor1

1、1 2 一、電泳一、電泳 l20世紀(jì)40年代Tiselius建立了U形 管式移動界面電泳，將電泳發(fā)展成 分離技術(shù) 3 幾個基本概念幾個基本概念 l電泳和電泳淌度 l電滲和電滲流 4 電泳和電泳淌度電泳和電泳淌度 l帶電粒子在直流電場作用下于一定介質(zhì)（溶劑） 中所發(fā)生的定向運動稱為電泳。 l單位電場下的電泳速度稱為電泳淌度（mobility） 或電遷移率。 = /E= d/(tE) FE =Ff 球形離子： Ff = 6r =6rE =FE =qE 毛細(xì)管電泳的基本理論毛細(xì)管電泳的基本理論 Charge: cannot be altered for fully dissociated ions

2、(strong acids, small ions) Can be altered for weak acids and bases (pH dependent) Ionic volume can be affected by counter ion or complexing agent Viscosity of medium (identical for all ions) 5 定域電荷和雙電層定域電荷和雙電層 l定域電荷定域電荷：指牢固結(jié)合在 管壁上、在電場作用下不 能遷移的離子或帶電基團 l雙電層雙電層：定域電荷對溶液 中的反號離子的吸引即形 成了所謂的雙電層 lZeta電勢電勢：雙電

3、層與管壁 之間的電位差 電滲和電滲流電滲和電滲流 l由于毛細(xì)管的液固界面雙電層的存在，高壓電場作用下， 組成 擴散層的陽離子被吸引而向負(fù)極移動擴散層的陽離子被吸引而向負(fù)極移動，由于他們是 溶劑化溶劑化的， 故將帶動毛細(xì)管中的溶液整體向負(fù)極流動， 這便形成了電滲流電滲流 （electroosmotic flow, EOF） l電泳過程中伴隨著電滲現(xiàn)象，電滲流的速度比電泳速度大 5-10倍 l電滲是指毛細(xì)管中的溶劑 因軸向直流電場作用而發(fā) 生的定向流動 l電滲由液固表界面的定域 電荷引起 7 8 9 10 電滲的控制方法電滲的控制方法 l緩沖液pH l緩沖液成分和濃度 l徑向電場 l添加劑 l溫度

4、等 11 12 13 電泳的大致分類電泳的大致分類 l依據(jù)電泳原理，現(xiàn)有三種形式的電泳分離系統(tǒng) l移動界面電泳（moving boundary electrophoresis） l區(qū)帶電泳（zone electrophoresis ） l穩(wěn)態(tài)電泳（steady state electrophoresis ） 其中區(qū)帶電泳是目前常用的電泳系統(tǒng)。 14 區(qū)帶電泳的主要技術(shù)區(qū)帶電泳的主要技術(shù) l區(qū)帶電泳中的常用技術(shù) l載體電泳：粉末電泳、紙電泳、凝膠電泳、聚焦電泳 l無載體電泳：自由電泳、毛細(xì)管電泳 15 瓊脂糖和聚丙烯酰胺瓊脂糖和聚丙烯酰胺 實驗室最常用的凝膠電泳支持介質(zhì)實驗室最常用的凝膠電泳支持

5、介質(zhì) l化學(xué)惰性、不干擾大分子的電泳過程，化學(xué)穩(wěn)定 性好、均勻、重復(fù)性好、電內(nèi)滲小等特性 l瓊脂糖凝膠電泳： l凝膠孔徑度較大，一般用于核酸的分離分析 l聚丙烯酰胺凝膠電泳： l分辨率較高，用于核酸和蛋白質(zhì)的分離、純化及檢 測 16 凝膠電泳的分離原理凝膠電泳的分離原理 l生物分子按電荷電荷、分子量大小分子量大小、尺寸尺寸和形狀形狀在凝膠中遷移、分 離形成一個個區(qū)帶 l電荷效應(yīng)電荷效應(yīng) l粒子表面電荷多，則遷移快，反之則慢。 l分子篩效應(yīng)分子篩效應(yīng)（凝膠對樣品分子的篩選效應(yīng)） l電場中，顆粒小、呈球形的樣品分子泳動速度快；顆粒大、 形狀不規(guī)則的分子通過凝膠孔洞時受到的阻力大，泳動慢。 l濃縮效

6、應(yīng)濃縮效應(yīng)（ 緩沖液離子成分和pH的不連續(xù)性） l電場作用下，蛋白質(zhì)顆粒在大孔膠（濃縮膠）中泳動阻力小， 移動快；而在小孔膠（分離膠）中泳動阻力大，移動慢。因 此，在不連續(xù)的兩層凝膠界面處，樣品遷移受阻而壓縮成很 窄的區(qū)帶。 17 分子篩效應(yīng)分子篩效應(yīng) molecular sieving 圖中A，B，C均為陽離子，在直流電場作用下電泳情況示意圖 分子量大小依次為MA=MBMC，所帶電荷量相同QA=QB=QC。 A BC + - 18 電泳新介質(zhì)電泳新介質(zhì) N-取代聚丙烯酰胺介質(zhì)： lPoly-N-acryl-tris (NAT) gel lN-Acryloyl sugars lAcryloyl

7、 morpholine lHydrolink gels lN-acryloyl amino ethoxy ethanol (AAEE) 特點：特點： l具有極強的水解穩(wěn)定性 l具有高度親水性 l孔徑大 19 電泳系統(tǒng)的基本組成電泳系統(tǒng)的基本組成 l電泳槽：是凝膠電泳系統(tǒng)的核心部分，管式電泳槽、垂直板電泳 槽、水平板電泳槽 l電源:聚丙烯酰胺凝膠電泳200600V，載體兩性電解質(zhì)等電聚焦 電泳10002000V，固相梯度等電聚焦30008000V l外循環(huán)恒溫系統(tǒng):高電壓會產(chǎn)生高熱，需冷卻； l凝膠干燥器:用于電泳和染色后的干燥； l灌膠模具：制膠，玻璃板和梳子； l電泳轉(zhuǎn)移裝置：利用低電壓，大

8、電流的直流電場，使凝膠電泳的 分離區(qū)帶或電泳斑點轉(zhuǎn)移到特定的膜上，如PVDF膜 l電泳洗脫儀：回收樣品 l凝膠掃描和攝錄裝置：對電泳區(qū)帶進(jìn)行掃描，從而給出定量的結(jié) 果。 20 21 基本操作基本操作 22 玻璃片玻璃片 23 24 預(yù)染色的標(biāo)本預(yù)染色的標(biāo)本 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 二、二、瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳 l可分離的DNA片段大小因膠濃度的不同而異，膠 濃度為0.50.6%的凝膠可以分離的DNA片段范 圍為20bp50kb。 l電泳結(jié)果用溴化乙錠（EB）染色后可直接在紫外 下觀察。 l可觀察的DNA條帶濃度為納克級。 l整個過程一般1小時即可完成

9、。 Ethidium bromide 35 瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠（agarose gel） l瓊脂中的膠狀多糖，由1,3連接的-D吡喃半乳糖和1,4連接的 3,6脫水-D吡喃半乳糖交替形成的 l瓊脂糖在水中一般 90 溶解， 35-40 形成良好的半固 體狀的凝膠。（氫鍵） 1,3 連結(jié) 1, 連結(jié) 1, 連結(jié) 3,6- 脫水 3,6- 脫水 36 瓊脂糖凝膠的性能、結(jié)構(gòu)與特點瓊脂糖凝膠的性能、結(jié)構(gòu)與特點 l瓊脂糖凝膠孔徑較大，0.075%瓊脂糖的孔徑為800nm， 可以分析大分子，可用來分離酶的復(fù)合物、核酸、病毒 等百萬Dt的大分子物質(zhì)，但分辨率較PAGE低 l透明度較好，染色、脫色程序簡單

10、，背景色較低 l不吸收紫外光，可直接利用紫外光吸收法作定量測定 l生物中性：一般不與生物材料結(jié)合；對蛋白質(zhì)吸附極微， 故無拖尾現(xiàn)象 l熱可逆性 不同濃度瓊脂糖分離不同濃度瓊脂糖分離DNA片段的范圍片段的范圍 標(biāo)標(biāo) 準(zhǔn)準(zhǔn) (kb) 150 0.725 0.515 0.2512 0.156 0.084 濃度越高，孔隙越小，其分辨能力就越強。 38 分離原理分離原理 DNA分子在堿性環(huán)境中帶負(fù)電荷帶負(fù)電荷，在外加電場作 用下向正極泳動。 DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時，有電荷效應(yīng)電荷效應(yīng)與 分子篩效應(yīng)分子篩效應(yīng)。 DNA分子量大小及構(gòu)型不同，電泳時形成不同的 區(qū)帶。遷移速度與分子量的對數(shù)值成反比。

11、39 DNA遷移速率的影響因素遷移速率的影響因素 lDNA分子特性分子特性 l小片段DNA 大片段DNA l同一分子：超螺旋環(huán)狀線狀切口環(huán)狀 l凝膠凝膠 l膠濃度越高，電泳速率越慢 l濃度較稀的膠線性范圍較寬，而濃膠對小分子DNA 片段呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系 l緩沖溶液、電場強度、染色劑緩沖溶液、電場強度、染色劑 small large 40 瓊脂糖凝膠電泳中常用的緩沖液瓊脂糖凝膠電泳中常用的緩沖液 lBuffers for DNA agarose gel electrophoresis lTris-乙酸乙酸 Tris (tris-hydroxymethyl-aminomethane) aceta

12、te EDTA lTBE Tris borate EDTA lTPE 41 AGE protocol Mixture of DNA mol- ecules of different sizes Power source Power source Longer molecules CathodeAnode Wells Gel Shorter molecules RESULTS 1 2 42 AGE setup 電泳槽電泳槽 電源電源 電泳槽蓋子電泳槽蓋子 瓊脂糖凝膠容器瓊脂糖凝膠容器 梳子梳子 43 瓊脂糖瓊脂糖 緩沖液緩沖液 三角燒瓶三角燒瓶 瓊脂糖凝膠的配制瓊脂糖凝膠的配制 瓊脂糖的稱量瓊脂

13、糖的稱量 欲配制100 mL 1% 濃度的瓊 脂糖凝膠，稱取1 g瓊脂糖粉， 倒入指定三角瓶中，加入100 mL 1TAE 44 煮膠煮膠 瓊脂糖在常溫下是不融的煮化后呈透明狀 * 在微波爐中煮化時要小心不要讓凝膠暴沸，要間歇性煮。 45 待三角瓶冷卻到60 左右 時倒膠，趕走氣泡 保證每個梳子齒均能插入 膠5mm左右即可 待膠凝固后，小心拔去梳子，拔出時 注意不要破壞膠孔. 用刀片切下所需的膠塊，放入加有足夠電泳緩 沖液(1TBE)的電泳槽中，緩沖液面高于凝膠 表面35mm即可 倒膠倒膠 46 47 熒光染料的選擇熒光染料的選擇 溴化乙錠（溴化乙錠（ethidium bromide，EB）S

14、YBR Green Advantages Inexpensive Less toxic No UV light required No hazardous waste disposal Disadvantages Less sensitive More DNA needed on gel Longer staining/destaining time AGE Blotting Heavyweight Paper Towels Nitrocellulose membrane Gel Sponge Alkaline Solution = capillary action DNA電泳圖譜電泳圖譜 常

15、用常用DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物分子量標(biāo)準(zhǔn)物 Markers Samples Wells DNA restriction enzyme 3 2 1 4 Southern Blotting I Normal -globin allele II Sickle-cell allele III Heterozygote Restriction fragments Nitrocellulose membrane (blot) Heavy weight Gel Sponge Alkaline solution Paper towels IIIIII IIIIIIIIIIII Preparation of rest

16、riction fragments Gel electrophoresisDNA transfer (blotting) Radioactively labeled probe for -globin gene Nitrocellulose blot Probe base-pairs with fragments Fragment from sickle-cell -globin allele Fragment from normal - globin allele Film over blot Hybridization with labeled probeProbe detection5

17、51 52 聚丙烯酰胺凝膠電泳（聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE） lPAGE （Polyacrylamide gel electrophoresis），是由丙 烯酰胺單體（Acr）和少量的交聯(lián)劑N，N-甲叉雙丙烯酰 胺（Bis）在催化劑（過硫酸胺或核黃素）和加速劑（N， N，NN-四甲基乙二胺）的作用下聚合交聯(lián)成的三維網(wǎng)狀 結(jié)構(gòu)的凝膠。 lPAGE具有機械性能好、化學(xué)性能穩(wěn)定、靈敏度好、分辨 率高的優(yōu)點。 lPAGE應(yīng)用十分廣泛，可用于蛋白質(zhì)、酶、核酸等生物分 子的分離、定性、定量和少量制備，還可測定分子量和等 電點等。 Polyacrylamide N，N-甲叉雙丙烯酰胺（Bis） 54 影響

18、聚合的主要因素影響聚合的主要因素 l引發(fā)劑和增速劑的濃度引發(fā)劑和增速劑的濃度：濃度小易導(dǎo)致聚合速度慢；濃度過大則易導(dǎo) 致電泳時的燒膠以及電泳帶的畸變；一般控制使聚合過程在4060分 鐘內(nèi)完成。 l系統(tǒng)系統(tǒng)pH值值：酸性條件、堿性條件均可，但仍然存在一個最佳pH值， 以獲得最佳的聚合結(jié)果； l溫度溫度：低溫下聚合導(dǎo)致凝膠變脆和混濁；適當(dāng)提高溫度可以是凝膠透 明而有彈性； l分子氧分子氧：分子氧的存在會阻礙凝膠的化學(xué)聚合；抽氣 l系統(tǒng)純度系統(tǒng)純度：金屬離子會影響凝膠的聚合； 55 凝膠濃度 (C=2.6%) 分子量范圍 (kDa) 凝膠濃度 (C=5%) 分子量范圍 (kDa) 530200560

19、700 10151001022280 1510501510200 20215205150 凝膠濃度與分子量測定的關(guān)系 56 PAGE分離原理分離原理 l電荷效應(yīng)電荷效應(yīng) l分子篩效應(yīng)分子篩效應(yīng) l濃縮效應(yīng)濃縮效應(yīng) l凝膠孔徑的不連續(xù)性 l緩沖體系離子成分及pH值的不連續(xù)性 l電位梯度不連續(xù)性 lPAGE可以用圓盤電泳、垂直電泳或水平電泳 57 濃縮效應(yīng)濃縮效應(yīng) l凝膠孔徑的不連續(xù)性凝膠孔徑的不連續(xù)性 l濃縮膠為大孔膠，分離膠為小孔膠。在兩層凝膠交界處， 樣品遷移受阻而壓縮成很窄的區(qū)帶。 l緩沖體系離子成分及緩沖體系離子成分及pH值的不連續(xù)性值的不連續(xù)性 l濃縮膠pH6.8，Tris-Cl 0.

20、5 mol/L l分離膠pH8.8，Tris-Cl 1.5 mol/L l電極緩沖液pH=8.30，為Tirs-Gly緩沖液 l濃縮膠，pH6.8，蛋白質(zhì)分子的遷移率比Cl- 低，比Gly 高。 58 濃縮效應(yīng)濃縮效應(yīng) l電位梯度不連續(xù)性電位梯度不連續(xù)性 l快離子（ Cl- ）后面形成高電位梯度區(qū)，慢離子（Gly） 前面形成低電位梯度區(qū) l高、低電位梯度之間形成一個穩(wěn)定而不斷向陽極移動的 界面，蛋白質(zhì)分子在界面處濃縮成一個狹小的中間層 chloride ions (green) ， glycine ions (orange) ， proteins (blue wavy lines) separ

21、ating gel stacking gel 59 電泳前的準(zhǔn)備工作電泳前的準(zhǔn)備工作 l緩沖系統(tǒng)的選擇： l保證蛋白質(zhì)的溶解性能、穩(wěn)定性以及生物活性的 保持； l電泳時間和分辨率：從理論上講PAGE可以在任 何pH進(jìn)行，但實際上過酸或過堿的條件下將發(fā)生 某種水解（脫酰胺）。因此，pH應(yīng)限制在310之 間。 60 緩沖系統(tǒng)的選擇原則緩沖系統(tǒng)的選擇原則 l兩種標(biāo)準(zhǔn)的對立權(quán)衡 l如果緩沖液的pH選擇在遠(yuǎn)離樣品中各種蛋白的等電 點，蛋白質(zhì)分子所帶電荷的密度大，電泳時間短， 區(qū)帶細(xì)而窄； l如果緩沖pH選擇在靠近被分離樣品的一種或幾種蛋 白質(zhì)的等電點，則蛋白質(zhì)分子之間的電荷密度差別 大，分辨率就高； 因

22、此，常常選擇pH 8.09.5的緩沖，常用的緩沖液有 Tris-甘氨酸（pH 8.39.5），Tris-硼酸(pH 8.39.3)和 Tris-醋酸（pH 7.28.5） 61 離子強度的選擇離子強度的選擇 l離子強度不宜過高，此時電導(dǎo)率低，產(chǎn)熱少，電 泳速度快；但也不可過低，必須具有一定的緩沖 能力，過低的離子強度容易導(dǎo)致蛋白質(zhì)絮凝。 l一般選擇緩沖液的離子強度為0.010.1 mol/L之 間 62 凝膠濃度的選擇凝膠濃度的選擇 lPAGE電泳分離不僅取決于蛋白質(zhì)的電荷密度，而且 取決于分子的大小、形狀；與凝膠的分子篩效應(yīng)（即 凝膠的孔徑與電泳的分辨率、電泳速度）密切相關(guān)。 l按凝膠孔徑與

23、被分離分子的大小和形狀分為： l非排阻性凝膠（unrestrictive gel）:濃度0.7 1.0%的瓊脂糖凝膠； l排阻性凝膠（restrictive gel）：濃度大于1%的瓊 脂糖凝膠和常規(guī)PAGE l凝膠濃度大，孔徑?。荒z濃度小，孔徑大 63 PAGE的具體操作過程的具體操作過程 l制膠：確定凝膠配方（凝膠、引發(fā)劑、增速劑的濃度和緩沖 液），使用灌膠模具灌膠； l樣品準(zhǔn)備：選擇合適的樣品緩沖液、確定合適的樣品濃度 （12mg/L，考染），加樣（溴酚藍(lán)）； l電泳：46小時，待溴酚藍(lán)前沿到達(dá)陽極底部； l檢測：紫外掃描或染色（考馬斯亮藍(lán)R-250、銀染色靈敏 度比考染高100倍、熒

24、光探針）； l照相、凝膠干燥： l定量測定： 64 聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE） 平板電泳平板電泳 65 聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE） 管狀電泳圖譜 平板PAGE圖譜 66 67 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳 l十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳 l主要用于測定蛋白質(zhì)亞基分子量以及未知蛋白質(zhì)分子量的 測定； l特點：設(shè)備簡單、操作簡便、測定快速、重復(fù)性高、樣品 無需純化。 Effect of SDS on the conformation and charge of a protein. 68 蛋白質(zhì)分子的解聚蛋白質(zhì)分子的解聚 lSDS能作為變性劑和助溶性試劑斷裂分子內(nèi)和分

25、 子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋白質(zhì)分子的 二級、三級結(jié)構(gòu)； l強還原劑，如二硫蘇糖醇、-巰基乙醇能使半胱 氨酸殘基之間的二硫鍵斷裂。 l解聚后形成帶負(fù)電的氨基酸側(cè)鏈-SDS膠束，相同 分子量膠束的電荷量和形狀基本相同，消除了電 泳過程中蛋白質(zhì)分子形狀對遷移率的影響。 蛋白質(zhì)樣品用蛋白質(zhì)樣品用SDS處理后亞基的解聚和分子形狀的改變處理后亞基的解聚和分子形狀的改變 SDS與大多數(shù)蛋白質(zhì)平均結(jié)合比為與大多數(shù)蛋白質(zhì)平均結(jié)合比為 1.4g SDS/g蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) 70 SDS-PAGE測定未知蛋白的相對分子量測定未知蛋白的相對分子量 l分開蛋白質(zhì)亞基，SDS與蛋白質(zhì)亞基結(jié)合； l電泳時的遷移率取決于

26、蛋白質(zhì)單體的分子量，而與其 原來的凈電荷、形狀無關(guān)； l電泳時SDS-蛋白質(zhì)亞基向正極移動。 l分連續(xù)和不連續(xù)體系（圓盤電泳） 72 SDS-PAGE測定未知蛋白的相對分子量測定未知蛋白的相對分子量 l以不同分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳得到不 同標(biāo)準(zhǔn)蛋白的電泳遷移率，制作標(biāo)準(zhǔn)校正曲線， l對未知蛋白在相同條件下進(jìn)行SDS-PAGE電泳，測定 遷移率，從標(biāo)準(zhǔn)曲線得到相應(yīng)的分子量； 73 SDS-PAGE測定未知蛋白的相對分子量測定未知蛋白的相對分子量 74 SDS-PAGE測定未知蛋白的相對分子量測定未知蛋白的相對分子量 A B Rf=A/B 75 76 等電聚焦電泳 l等電聚焦（i

27、soelectrofocusing）, IEF l利用蛋白質(zhì)分子或其它兩性分子的等電點不同， 在一個穩(wěn)定的、連續(xù)的、線性的pH梯度中進(jìn)行蛋 白質(zhì)的分離和分析。 l利用等電聚焦技術(shù)分離、分析的對象僅限于蛋白 質(zhì)和兩性分子。 l根據(jù)建立pH梯度的原理不同，梯度有分為載體兩 性電解質(zhì)梯度（Carrier ampholytes pH gradient） 和固相梯度。 77 等電聚焦電泳 l蛋白質(zhì)的等電點 l蛋白質(zhì)最主要的特性是它的帶電行為，它們在不 同的pH環(huán)境中帶不同數(shù)量的正電或負(fù)電，只是在 某一pH時，蛋白質(zhì)的凈電荷為0，此pH即為該蛋 白的等電點（isoelectric point pI）。 l蛋白質(zhì)的等電點取決于它的氨基酸組成和構(gòu)象， 是一個物理化學(xué)常數(shù)。 l可以利用等電點差異來進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離、分析 78 等電聚焦電泳 79 等電聚焦電泳 蛋白質(zhì)在具有pH梯度的介質(zhì)中電泳 80 等電聚焦電泳 81 常規(guī)常規(guī)PAGE和等電聚焦電