葉綠體的分離

1、-作者xxxx-日期xxxx葉綠體的分離【精品文檔】葉綠體的分離、純化及熒光觀察實(shí)驗(yàn)報(bào)告一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1、通過(guò)植物細(xì)胞葉綠體的分離與純化，了解細(xì)胞器分離與純化的原理和方法。 2、熟悉熒光顯微鏡的使用方法，觀察葉綠體的自發(fā)熒光和間接熒光。二、實(shí)驗(yàn)原理 將組織勻漿后懸浮在等滲介質(zhì)中進(jìn)行差速離心，是分離細(xì)胞器的常用方法。一個(gè)顆粒在離心場(chǎng)中的沉降速率取決于顆粒的大小、形狀和密度，也同離心力以及懸浮介質(zhì)的粘度有關(guān)。通過(guò)控制離心力和離心時(shí)間等因素，不同的細(xì)胞器可以通過(guò)階梯離心的方式得到分離。在一給定的離心場(chǎng)中，同一時(shí)間內(nèi)，密度和大小不同的顆粒其沉降速度不同。依次增加離心力和離心時(shí)間，就能夠使非均一懸浮中的

2、顆粒按其大小、密度先后分批沉降在離心管底部分批收集即可獲得各種亞細(xì)胞組分。葉綠體是植物細(xì)胞中較大的一種細(xì)胞器，利用低速離心即可分離集中進(jìn)行各種研究。葉綠體的分離應(yīng)在等滲溶液(0.35mol/L氯化鈉或0.4mol/L蔗糖溶液)中進(jìn)行，以免滲透壓的改變使葉綠體受到損傷。將勻漿液在1000r/min的條件下離心2min，以去除其中的組織殘?jiān)鸵恍┪幢黄扑榈耐暾?xì)胞。然后，3000r/min的條件下離心5min，即可獲得沉淀的葉綠體(混有部分細(xì)胞核)。分離過(guò)程最好在05的條件下進(jìn)行：如果在室溫下，要迅速分離和觀察。熒光顯微術(shù)是利用熒光顯微鏡對(duì)可發(fā)熒光的物質(zhì)進(jìn)行觀察的一種技術(shù)。某些物質(zhì)在定短波長(zhǎng)的光(

3、如紫外光)的照射下吸收光能進(jìn)入激發(fā)態(tài)，從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時(shí)，就能在極短的時(shí)間內(nèi)放射出比照射光波長(zhǎng)更長(zhǎng)的光(如可見(jiàn)光)，這種光就稱為熒光若停止供能熒光現(xiàn)象立即停止。有些生物體內(nèi)的物質(zhì)受激發(fā)光照射后直接發(fā)出熒光，稱為自發(fā)熒光(或直接熒光)，如葉綠素的火紅色熒光和水質(zhì)素的黃色熒光等。有的生物材料本身不發(fā)熒光，但它吸收熒光染料后同樣也能發(fā)出熒光，這種熒光稱為次生熒光(或間接熒光)，如葉綠體吸附吖啶橙后可發(fā)桔紅色熒光。葉綠素吸收的光能主要用于光合作用。多余的能量可能以熱的形式散發(fā)，也可能以激發(fā)光的形式散發(fā)。這種激發(fā)光就稱為葉綠素?zé)晒狻Ｈ~綠素?zé)晒鈾z測(cè)技術(shù)作為一種強(qiáng)大的工具，廣泛應(yīng)用于生態(tài)學(xué)和植物生理學(xué)研究。

4、利用熒光顯微鏡對(duì)可發(fā)熒光物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，將受到許多因素的影響，如溫度、光、淬滅劑等。因此在熒光觀察時(shí)應(yīng)抓緊時(shí)間，有必要時(shí)立即拍照。另外，在制作熒光顯微標(biāo)本時(shí)最好使用無(wú)熒光載玻片，益玻片和無(wú)熒光油。三、實(shí)驗(yàn)用品 1.試劑：0.35mol/L氯化鈉溶液，0.01吖啶橙2.器具：粗天平、組織搗碎機(jī)、普通離心機(jī)、普通光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡、500ml燒杯、量筒、滴管、10ml刻度離心管、紗布若干，試管架、無(wú)熒光載玻片和蓋玻片3.材料：新鮮菠菜四、實(shí)驗(yàn)步驟 1.選取新鮮的嫩菠菜葉，洗凈擦干后去除葉梗及粗脈，稱30g于150ml0.35mol/LNaCI溶液中，裝入組織搗碎機(jī)；2.利用組織搗碎機(jī)低速（50

5、00r/min）勻漿3-5min；3.將勻漿液用6層紗布過(guò)濾到500ml燒杯中；4.取濾液4ml于離心管中，1000r/min下離心2min。棄去沉淀；5.將上清液取出于另一只離心管中，3000r/min下離心5min，棄去上清液，沉淀即為葉綠體（混有部分細(xì)胞核）；6.將最后一次的沉淀用2-3ml0.35mol/L氯化鈉等滲溶液懸??；7.取葉綠體懸液一滴滴于載片上，加蓋片后即可觀察。在普通光鏡下觀察。在熒光顯微鏡下觀察。8.另取葉綠體懸液一滴滴在載片上，再滴加一滴0.01%吖啶橙熒光染料，加蓋片后即可以在熒光顯微鏡下觀察。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 顯微鏡下的菠菜葉下表皮的氣孔圖像，氣孔由兩個(gè)保衛(wèi)細(xì)胞構(gòu)成

6、氣孔 保衛(wèi)細(xì)胞 熒光顯微鏡下觀察菠菜葉下表皮氣孔 氣孔光學(xué)顯微鏡下，葉綠體為橢圓形 葉綠體熒光顯微鏡下，葉綠體自發(fā)熒光為火紅色，呈斑狀分布，其他部分為黑色 葉綠體 吖啶橙染色后熒光顯微鏡下，葉綠體可發(fā)出桔紅色熒光，綠色熒光則為細(xì)胞核碎片 葉綠體 細(xì)胞核碎片六、分析與討論 1、在離心時(shí)，轉(zhuǎn)速不能過(guò)高或不能離心過(guò)長(zhǎng)的時(shí)間，否則葉綠體也會(huì)破碎，所以要控制好離心的速度和時(shí)間。 2、在使用熒光顯微鏡觀察時(shí)，不能過(guò)早的用吖啶橙染色，在觀察前染色，在熒光觀察時(shí)應(yīng)抓緊時(shí)間，先拍照，再觀察，因?yàn)榧す庹丈洳糠值娜~綠體會(huì)逐漸失去熒光。 3、葉綠體經(jīng)激發(fā)光波照射后，自發(fā)熒光呈現(xiàn)火紅色。因葉綠體在其懸液中呈現(xiàn)點(diǎn)狀均勻分布，且