遺傳標(biāo)記與基因組作圖

1、第四章第四章 遺傳標(biāo)記與基因組作圖遺傳標(biāo)記與基因組作圖 第一節(jié)第一節(jié) 基因組多樣性（基因組多樣性（DiversityDiversity） 1、地球上眾多物種的存在以及種內(nèi)的多態(tài)性、地球上眾多物種的存在以及種內(nèi)的多態(tài)性 真細(xì)菌真細(xì)菌 古細(xì)菌古細(xì)菌 真核生物真核生物 生命樹顯示了古細(xì)菌、真細(xì)菌和真核生物的關(guān)系以及真菌生命樹顯示了古細(xì)菌、真細(xì)菌和真核生物的關(guān)系以及真菌 、植物和動(dòng)物的關(guān)系、植物和動(dòng)物的關(guān)系 原生動(dòng)物原生動(dòng)物 植物植物 真菌真菌 動(dòng)物動(dòng)物 1 tagagcaggt ctagaccgta atgtttataa tacaatttac ttagacccaa caaatcccac 1 taga

2、gcaggt ctagaccgta atgtttataa tacaatttac ttagacccaa caaatcccac 61 catgagcaag cacttggcga cagtggcaag aaaaaacttc ctttaagagg cagaaacctg 61 catgagcaag cacttggcga cagtggcaag aaaaaacttc ctttaagagg cagaaacctg 121 gagcagaacc agaatcattg gtgggtgacc atccactgct gtcgtgttag gttttgaaag 121 gagcagaacc agaatcattg gtgg

3、gtgacc atccactgct gtcgtgttag gttttgaaag 181 atttagagag 181 atttagagag agatagagag agagagagagagatagagag agagagagag agagagagag agagagaggg gttttggggg agagagagag agagagaggg gttttggggg 241 ggtgagggag agggagacac aatgcaaatt tggcaaggaa aaacttcctt taagaggcag 241 ggtgagggag agggagacac aatgcaaatt tggcaaggaa aaa

4、cttcctt taagaggcag 301 aacccttgta cagaacccaa cacaatgcaa ataccaccta gaatttttt 301 aacccttgta cagaacccaa cacaatgcaa ataccaccta gaatttttt 含有這種序列含有這種序列 3.蛋白質(zhì)標(biāo)記蛋白質(zhì)標(biāo)記：非酶蛋白質(zhì)和酶蛋白質(zhì)：非酶蛋白質(zhì)和酶蛋白質(zhì) 在非酶蛋白質(zhì)中，用得較多的是種子貯藏蛋白；在非酶蛋白質(zhì)中，用得較多的是種子貯藏蛋白； 酶蛋白質(zhì)主要是同功酶。酶蛋白質(zhì)主要是同功酶。 4.DNA 標(biāo)標(biāo) 記記： 也稱也稱DNA多態(tài)性標(biāo)記、多態(tài)性標(biāo)記、 DNA分子標(biāo)記，分子標(biāo)記， 是是 D

5、NA水平上遺傳多態(tài)性的直接反映。水平上遺傳多態(tài)性的直接反映。 1.： 是指那些能夠明確顯示遺傳多態(tài)的外是指那些能夠明確顯示遺傳多態(tài)的外 觀性狀，如株高、粒色等的相對(duì)差異觀性狀，如株高、粒色等的相對(duì)差異 2. ：是指能夠明確顯示遺傳多態(tài)的細(xì)胞學(xué)特征。：是指能夠明確顯示遺傳多態(tài)的細(xì)胞學(xué)特征。 如染色體結(jié)構(gòu)上和數(shù)量上的遺傳多態(tài)性等。如染色體結(jié)構(gòu)上和數(shù)量上的遺傳多態(tài)性等。 這里僅介紹這里僅介紹遺傳的分子標(biāo)記遺傳的分子標(biāo)記中的幾種重要的分子標(biāo)記中的幾種重要的分子標(biāo)記: 1.同工酶標(biāo)記同工酶標(biāo)記: 同工酶同工酶（IsozymeIsozyme）是一類分子結(jié)構(gòu)不同、是一類分子結(jié)構(gòu)不同、 功能相似、催化同樣功能

6、相似、催化同樣 的生化反應(yīng)的酶。的生化反應(yīng)的酶。 同工酶標(biāo)記是利用編碼同工酶的等位基因與同工酶酶譜的相關(guān)性及其共顯性的特同工酶標(biāo)記是利用編碼同工酶的等位基因與同工酶酶譜的相關(guān)性及其共顯性的特 點(diǎn)進(jìn)行染色體定位和遺傳連鎖分析。點(diǎn)進(jìn)行染色體定位和遺傳連鎖分析。 2.DNA分子標(biāo)記分子標(biāo)記: (1)基于基于DNA-DNA雜交的雜交的DNA標(biāo)記標(biāo)記 RFLP標(biāo)記標(biāo)記 (restriction fragment length polymorphism)： DNADNA某一位點(diǎn)上的變異有可能引起該位點(diǎn)特異性的限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的改某一位點(diǎn)上的變異有可能引起該位點(diǎn)特異性的限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的改 變，包括

7、原有位點(diǎn)的消失或出現(xiàn)新的酶切位點(diǎn)，致使酶切片段長(zhǎng)度隨之發(fā)生變化。變，包括原有位點(diǎn)的消失或出現(xiàn)新的酶切位點(diǎn)，致使酶切片段長(zhǎng)度隨之發(fā)生變化。 這種變化引起的多態(tài)現(xiàn)象即為限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性這種變化引起的多態(tài)現(xiàn)象即為限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLPRFLP) )。 對(duì)對(duì)RFLPRFLP的檢測(cè)主要是用的檢測(cè)主要是用SouthernSouthern雜交的方法進(jìn)行，即利用限制酶酶解及凝膠雜交的方法進(jìn)行，即利用限制酶酶解及凝膠 電泳分離不同生物體的電泳分離不同生物體的DNADNA分子，然后用經(jīng)標(biāo)記的特異分子，然后用經(jīng)標(biāo)記的特異DNADNA探針與之雜交，通過放探針與之雜交，通過放 射自顯影或非同位素顯色技術(shù)來揭

8、示射自顯影或非同位素顯色技術(shù)來揭示DNADNA的多態(tài)性。的多態(tài)性。( ( 圖圖 Southern Southern ) ) 1 39 39 Recombinants ZCL ZZA 1 2 3 4 (A) (B) Fig.1 The southern analysis of RFLP marker RG214. 1 The polymorphism of RFLP marker RG214 between 2 parents and 2 bulks 9RFLP analysis of plants in F2 population with RG214 （2 ）基于）基于PCRPCR的的DNA

9、DNA標(biāo)記：標(biāo)記： RAPDRAPD（random amplified polymorphic DNArandom amplified polymorphic DNA）標(biāo)記標(biāo)記： 隨機(jī)引物隨機(jī)引物PCRPCR標(biāo)記，標(biāo)記，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNADNA，用隨機(jī)短引物（人工合成，用隨機(jī)短引物（人工合成 的十核苷酸）進(jìn)行的十核苷酸）進(jìn)行DNADNA的的PCRPCR擴(kuò)增。所擴(kuò)增的擴(kuò)增。所擴(kuò)增的DNADNA區(qū)段是事先未知的，區(qū)段是事先未知的， 具有隨機(jī)性和任意性，因此隨機(jī)引物具有隨機(jī)性和任意性，因此隨機(jī)引物PCRPCR標(biāo)記技術(shù)可用于對(duì)任何未標(biāo)記技術(shù)可用于對(duì)任何未 知基因組的研究。（知基因組的研

10、究。（RAPD RAPD 原理）原理） ISSR (Inter-simple sequence repeats) ISSR (Inter-simple sequence repeats)標(biāo)記標(biāo)記: :簡(jiǎn)單序列重復(fù)簡(jiǎn)單序列重復(fù) 區(qū)間擴(kuò)增多態(tài)性。利用基因組中常出現(xiàn)的區(qū)間擴(kuò)增多態(tài)性。利用基因組中常出現(xiàn)的SSRSSR本身設(shè)計(jì)引物，無需本身設(shè)計(jì)引物，無需 預(yù)先克隆和測(cè)序。預(yù)先克隆和測(cè)序。 SSRSSR（simple sequence repeats)simple sequence repeats)標(biāo)記標(biāo)記: :簡(jiǎn)單重復(fù)序列多態(tài)簡(jiǎn)單重復(fù)序列多態(tài) 性。又稱微衛(wèi)星性。又稱微衛(wèi)星DNADNA多態(tài)性，即由二核苷酸

11、，三核苷酸或四核苷酸多態(tài)性，即由二核苷酸，三核苷酸或四核苷酸 串聯(lián)重復(fù)的拷貝數(shù)目不等而出現(xiàn)的多態(tài)現(xiàn)象。串聯(lián)重復(fù)的拷貝數(shù)目不等而出現(xiàn)的多態(tài)現(xiàn)象。(76)(76) STSSTS（sequence-tagged sitesequence-tagged site）標(biāo)記）標(biāo)記: :序列標(biāo)定位置序列標(biāo)定位置。 染色體上位置已定的、核苷酸序列已知的、且在基因組染色體上位置已定的、核苷酸序列已知的、且在基因組 中只有一份拷貝的中只有一份拷貝的DNADNA短片斷，一般長(zhǎng)短片斷，一般長(zhǎng)200200500bp500bp。STS STS 標(biāo)記是根據(jù)單拷貝的標(biāo)記是根據(jù)單拷貝的DNADNA片斷兩端的序列，設(shè)計(jì)一對(duì)特異片斷

12、兩端的序列，設(shè)計(jì)一對(duì)特異 引物，經(jīng)引物，經(jīng)PCRPCR擴(kuò)增基因組擴(kuò)增基因組DNADNA而產(chǎn)生的一段長(zhǎng)度為幾百而產(chǎn)生的一段長(zhǎng)度為幾百bpbp 的特異序列。的特異序列。（STS)STS) （3 3）基于）基于PCRPCR與限制性酶切技術(shù)結(jié)合的與限制性酶切技術(shù)結(jié)合的DNADNA標(biāo)記標(biāo)記 AFLPAFLP（amplified fragments length polymorphismamplified fragments length polymorphism） 標(biāo)記標(biāo)記: :擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性。通過對(duì)基因組擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性。通過對(duì)基因組DNADNA酶切片段的酶切片段的 選擇性擴(kuò)增來檢測(cè)選擇性擴(kuò)增來

13、檢測(cè)DNADNA酶切片段長(zhǎng)度的多態(tài)性。酶切片段長(zhǎng)度的多態(tài)性。AFLPAFLP揭示揭示 的的DNADNA多態(tài)性是酶切位點(diǎn)和其后的選擇性堿基的變異。多態(tài)性是酶切位點(diǎn)和其后的選擇性堿基的變異。 （AFLP AFLP 原理原理） CAPSCAPS（Cleaved amplified polymorphic sequenceCleaved amplified polymorphic sequence）標(biāo)記）標(biāo)記: : 是特異引物是特異引物PCRPCR與限制性酶切相結(jié)合而產(chǎn)生的一種與限制性酶切相結(jié)合而產(chǎn)生的一種DNADNA標(biāo)記標(biāo)記, ,當(dāng)當(dāng) SCARSCAR（sequence characterized

14、amplified regions)sequence characterized amplified regions)或或STSSTS的特異的特異 擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳譜帶不表現(xiàn)多態(tài)性時(shí)，一種補(bǔ)救辦法就是用限制性擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳譜帶不表現(xiàn)多態(tài)性時(shí)，一種補(bǔ)救辦法就是用限制性 內(nèi)切酶對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，然后再通過瓊脂糖或聚丙烯胺凝膠電內(nèi)切酶對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，然后再通過瓊脂糖或聚丙烯胺凝膠電 泳檢測(cè)其多態(tài)性泳檢測(cè)其多態(tài)性, ,這種多態(tài)性稱為這種多態(tài)性稱為CAPSCAPS標(biāo)記。它揭示的是特異標(biāo)記。它揭示的是特異PCRPCR產(chǎn)產(chǎn) 物物DNADNA序列內(nèi)限制性酶切位點(diǎn)變異的信息，也表現(xiàn)為限制性片段長(zhǎng)度序列內(nèi)限制

15、性酶切位點(diǎn)變異的信息，也表現(xiàn)為限制性片段長(zhǎng)度 的多態(tài)性。的多態(tài)性。 （4 4）單核苷酸多態(tài)性的）單核苷酸多態(tài)性的DNADNA標(biāo)記標(biāo)記 SNPSNP（single nucleotide polymorphismsingle nucleotide polymorphism）標(biāo)記）標(biāo)記: : 單核苷酸多態(tài)性。不同個(gè)體基因組單核苷酸多態(tài)性。不同個(gè)體基因組DNADNA序列同一位置上的序列同一位置上的 單個(gè)核苷酸的差別。其比較的不是單個(gè)核苷酸的差別。其比較的不是DNADNA的片段長(zhǎng)度，而是相同的片段長(zhǎng)度，而是相同 序列長(zhǎng)度里的單個(gè)堿基的差別序列長(zhǎng)度里的單個(gè)堿基的差別。 (SNP_)(SNP_) (5)(5

16、)主要類型的主要類型的DNADNA分子標(biāo)記的技術(shù)分子標(biāo)記的技術(shù)特點(diǎn)比較特點(diǎn)比較 第三節(jié)第三節(jié) 人類基因組作圖人類基因組作圖 1.人類基因組計(jì)劃的緣起人類基因組計(jì)劃的緣起 與與1945年日本廣島、長(zhǎng)崎的原子彈爆炸有著千絲萬縷的關(guān)系年日本廣島、長(zhǎng)崎的原子彈爆炸有著千絲萬縷的關(guān)系 原子彈爆炸、強(qiáng)烈輻射原子彈爆炸、強(qiáng)烈輻射 人群（人群（DNA損傷）損傷） 死亡死亡 誘發(fā)病癥誘發(fā)病癥 幸存者無明顯病癥幸存者無明顯病癥 白血病白血病 但基因發(fā)生了突變但基因發(fā)生了突變 可遺傳給后代可遺傳給后代 1984年年12月月9-13日日 美國(guó)猶他州阿爾他（美國(guó)猶他州阿爾他（Alta） 美國(guó)能源部美國(guó)能源部 環(huán)境誘變物

17、和致癌物防護(hù)國(guó)際會(huì)議環(huán)境誘變物和致癌物防護(hù)國(guó)際會(huì)議 科學(xué)家在討論中提出一個(gè)問題：科學(xué)家在討論中提出一個(gè)問題： 有什么新方法可以非常有效地、直接檢出人類基因的突變？有沒有有什么新方法可以非常有效地、直接檢出人類基因的突變？有沒有 新方法可在日本廣島、長(zhǎng)崎原子彈爆炸的幸存者及其子女的群體中新方法可在日本廣島、長(zhǎng)崎原子彈爆炸的幸存者及其子女的群體中 直接測(cè)定基因突變直接測(cè)定基因突變的增加？的增加？ 從理論上計(jì)算從理論上計(jì)算 幸存者后代的基因突變頻率比對(duì)照人群高幸存者后代的基因突變頻率比對(duì)照人群高3倍倍 實(shí)際調(diào)查實(shí)際調(diào)查 同正常的對(duì)照人群中的基因突變頻率相差無幾同正常的對(duì)照人群中的基因突變頻率相差無幾

18、 于是有科學(xué)家提出：只有測(cè)定人基因的全序列，通過比較分析以于是有科學(xué)家提出：只有測(cè)定人基因的全序列，通過比較分析以 檢出所有突變，才能精確地測(cè)定突變頻率。檢出所有突變，才能精確地測(cè)定突變頻率。 美國(guó)科學(xué)家美國(guó)科學(xué)家Dulbecco 1986年年3月月 Science Human Genome Project, HGP 1990年首先在美國(guó)開始實(shí)施。年首先在美國(guó)開始實(shí)施。 中國(guó)：中國(guó)：1994年國(guó)家自然科學(xué)基金資助的重大項(xiàng)目年國(guó)家自然科學(xué)基金資助的重大項(xiàng)目 “中華民族基因組若干位點(diǎn)基因結(jié)構(gòu)的研究中華民族基因組若干位點(diǎn)基因結(jié)構(gòu)的研究” 1999年年9月：中國(guó)科學(xué)院遺傳研究所人類基因組中心獲準(zhǔn)參加月

19、：中國(guó)科學(xué)院遺傳研究所人類基因組中心獲準(zhǔn)參加 HGP，負(fù)責(zé)測(cè)定人類基因組全部序列的，負(fù)責(zé)測(cè)定人類基因組全部序列的1%3號(hào)染色體上的號(hào)染色體上的 3000萬個(gè)堿基對(duì)。萬個(gè)堿基對(duì)。 夏家輝教授：神經(jīng)性耳聾的致病基因夏家輝教授：神經(jīng)性耳聾的致病基因GJB3GJB3克隆，克隆， 定位于定位于11號(hào)染色體號(hào)染色體 2. 人類基因組計(jì)劃大事記人類基因組計(jì)劃大事記 1990年年10月，國(guó)際人類基因組計(jì)劃啟動(dòng)。月，國(guó)際人類基因組計(jì)劃啟動(dòng)。 1999年年9月，中國(guó)獲準(zhǔn)加入人類基因組計(jì)劃。月，中國(guó)獲準(zhǔn)加入人類基因組計(jì)劃。 1999年年12月月1日，人類首次成功地完成人體染色體基因完整序日，人類首次成功地完成人體染

20、色體基因完整序 列的測(cè)定。列的測(cè)定。 2000年年4月底，中國(guó)科學(xué)家完成月底，中國(guó)科學(xué)家完成1人類基因組的工作框架圖。人類基因組的工作框架圖。 2000年年5月月8日，由德國(guó)和日本等國(guó)科學(xué)家組成的國(guó)際科研小組日，由德國(guó)和日本等國(guó)科學(xué)家組成的國(guó)際科研小組 宣布，他們已基本完成了人體第宣布，他們已基本完成了人體第21對(duì)染色體的測(cè)序工作。對(duì)染色體的測(cè)序工作。 2000年年6月月26日，六國(guó)科學(xué)家公布人類基因組工作框架圖。日，六國(guó)科學(xué)家公布人類基因組工作框架圖。 2001年年2月月12日，人類基因組圖譜及初步分析結(jié)果首次公布。日，人類基因組圖譜及初步分析結(jié)果首次公布。 2001年年8月月26日，中國(guó)提

21、前兩年完成日，中國(guó)提前兩年完成1人類基因組測(cè)序任務(wù)。人類基因組測(cè)序任務(wù)。 2003年年4月月15日，六個(gè)國(guó)家共同宣布人類基因組序列圖完成。日，六個(gè)國(guó)家共同宣布人類基因組序列圖完成。 (美、英、德、日、法、中美、英、德、日、法、中) 3. The organization of the human genomeThe organization of the human genome ( (人基因組組構(gòu)人基因組組構(gòu)) ) 返回返回 4. 已完成的多種生物基因組測(cè)序情況已完成的多種生物基因組測(cè)序情況 水稻基因組水稻基因組 2002 老鼠基因組老鼠基因組 2002 5.作圖策略和方法問題作圖策略和方法

22、問題 5.1 經(jīng)典的遺傳學(xué)圖譜經(jīng)典的遺傳學(xué)圖譜: 主要用來確定生物體的基因在染色體上的排列，只能標(biāo)明基因主要用來確定生物體的基因在染色體上的排列，只能標(biāo)明基因 之間的相對(duì)位置，無法指明基因在染色體上的具體位置，因此無法之間的相對(duì)位置，無法指明基因在染色體上的具體位置，因此無法 按圖直接克隆分離基因。在人類基因組計(jì)劃中顯然利用價(jià)值不大按圖直接克隆分離基因。在人類基因組計(jì)劃中顯然利用價(jià)值不大. 5.2 現(xiàn)現(xiàn) 代代 遺傳學(xué)圖譜遺傳學(xué)圖譜： 其概念是其概念是David Botstein等等 于于1980年提出來的，當(dāng)時(shí)由于年提出來的，當(dāng)時(shí)由于DNA 限制性內(nèi)切酶和連接酶的應(yīng)用，限制性內(nèi)切酶和連接酶的應(yīng)

23、用，RFLP成為一種嶄新的成為一種嶄新的DNA多態(tài)性多態(tài)性 標(biāo)記。他們提出來利用標(biāo)記。他們提出來利用RFLP作為標(biāo)記去構(gòu)建多態(tài)性基因與這些標(biāo)作為標(biāo)記去構(gòu)建多態(tài)性基因與這些標(biāo) 記連鎖關(guān)系，進(jìn)而確定多態(tài)性基因的位置。其精髓在于將單純的表記連鎖關(guān)系，進(jìn)而確定多態(tài)性基因的位置。其精髓在于將單純的表 型研究深入到型研究深入到DNA分子的本質(zhì)上去。分子的本質(zhì)上去。 即：即：表型多樣性對(duì)應(yīng)于表型多樣性對(duì)應(yīng)于DNA分子的多樣性分子的多樣性 將單純的表現(xiàn)多態(tài)性的界標(biāo)改變?yōu)橐詫渭兊谋憩F(xiàn)多態(tài)性的界標(biāo)改變?yōu)橐訢NA序列的多態(tài)作為作圖序列的多態(tài)作為作圖 界標(biāo)。這些界標(biāo)包括：界標(biāo)。這些界標(biāo)包括： RFLP、 VNTR和

24、和STR等。等。 （1）.Genetic mapping Genes were the first markers DNA markers Biochemical markers Linkage analysis is the basis of genetic mapping Partial linkage is explained by the behavior of chromosomes during meiosis Linkage analysis with different types of organism fruit flies and mice-with which we c

25、an carry out planned breeding experiments. with human- with whom we can make use of family Pedigrees with bacteria- conjugation,transduction, transformation A. 基于基于DNA分子標(biāo)記的一條分子標(biāo)記的一條 人類染色體上的（基因）連鎖圖人類染色體上的（基因）連鎖圖 B. 基于基于VNTR標(biāo)記的人系譜分析圖標(biāo)記的人系譜分析圖 A B (2).(2).Physical mapping Physical mapping （測(cè)序策略）（測(cè)序策略）

26、By the clone contig By the clone contig approach approach (60)(60) 建立連續(xù)重疊克隆系（建立連續(xù)重疊克隆系（overlapping clonesoverlapping clones)/)/重疊群重疊群(Contig(Contig) )， 對(duì)單個(gè)重疊群對(duì)單個(gè)重疊群, ,采用鳥槍法對(duì)其中的克隆逐個(gè)進(jìn)行測(cè)序采用鳥槍法對(duì)其中的克隆逐個(gè)進(jìn)行測(cè)序, ,最后在重最后在重 疊群內(nèi)進(jìn)行拼接疊群內(nèi)進(jìn)行拼接, ,拼接出全長(zhǎng)序列。拼接出全長(zhǎng)序列。 這種方法也稱為這種方法也稱為 Top-down mapping Top-down mapping ： “

27、“自上而下自上而下” 或由長(zhǎng)到短作圖或由長(zhǎng)到短作圖: : 先構(gòu)建大先構(gòu)建大DNADNA克隆克隆(100Kb-10000Kb),(100Kb-10000Kb),并把克隆依染色并把克隆依染色 體排列體排列-染色體的克隆圖。當(dāng)把每個(gè)克隆測(cè)序完成后，染色體的克隆圖。當(dāng)把每個(gè)克隆測(cè)序完成后， 就可以拼裝出整個(gè)染色體的就可以拼裝出整個(gè)染色體的DNADNA序列。序列。 (99)(99) 注：重疊群：相互間存在重疊順序的一組克隆，根據(jù)重疊順序的注：重疊群：相互間存在重疊順序的一組克隆，根據(jù)重疊順序的 相對(duì)位置將各個(gè)克隆首尾連接，構(gòu)成連續(xù)順序圖。相對(duì)位置將各個(gè)克隆首尾連接，構(gòu)成連續(xù)順序圖。 By the who

28、le-genome shotgun method By the whole-genome shotgun method (60)(60) 直接將基因組直接將基因組DNADNA隨機(jī)切成隨機(jī)切成 2Kb 2Kb 左右的小片段左右的小片段, ,（BACBAC 克隆克隆, ,）隨機(jī)末端測(cè)序）隨機(jī)末端測(cè)序, ,再以基因組的分子標(biāo)記為起點(diǎn)進(jìn)行再以基因組的分子標(biāo)記為起點(diǎn)進(jìn)行 DNADNA片段拚接，其余過程輔以少量大片段片段拚接，其余過程輔以少量大片段( (約約10Kb) ,10Kb) ,計(jì)算計(jì)算 機(jī)分析串連得全序列機(jī)分析串連得全序列. . 這是一種這是一種“自下而上自下而上”或由短到長(zhǎng)作圖或由短到長(zhǎng)作圖 B

29、ottom-up approach/mappingBottom-up approach/mapping: : 6. 6. 物理圖的類型物理圖的類型 染色體組型染色體組型/ /帶型帶型 ( (粗略的物理圖粗略的物理圖) ) 限制酶切圖譜限制酶切圖譜 大尺度限制酶切圖譜大尺度限制酶切圖譜: :將將YAC DNAYAC DNA用稀切點(diǎn)限制酶用稀切點(diǎn)限制酶 ( (如如sfisfi ,Not,Not 等等) )酶解后經(jīng)脈沖凝膠電泳酶解后經(jīng)脈沖凝膠電泳(pulsed (pulsed field gel electrophoresis) field gel electrophoresis)分離分離DNADN

30、A片段片段, ,經(jīng)特經(jīng)特 異異 DNA(DNA(如如AluAlu順序順序) )探針雜交后繪制出圖譜探針雜交后繪制出圖譜 YAC-STS YAC-STS物理圖譜物理圖譜: :有足夠多的有足夠多的STSSTS位標(biāo)并在染色體位標(biāo)并在染色體 上的分布達(dá)到足夠密度上的分布達(dá)到足夠密度, ,根據(jù)每個(gè)根據(jù)每個(gè)YACYAC所含有的所含有的STSSTS把把 各各YACYAC排在染色體上排在染色體上, ,得到一個(gè)相互重疊排列的染色得到一個(gè)相互重疊排列的染色 體的體的YACYAC圖譜圖譜 (96)(96) （110110） 輻射雜種圖譜輻射雜種圖譜(RH(RH圖譜圖譜,Radiation hybrid),Radia

31、tion hybrid) 用輻射方法產(chǎn)生的雜種細(xì)胞是含有全部小鼠染色體背景的細(xì)胞用輻射方法產(chǎn)生的雜種細(xì)胞是含有全部小鼠染色體背景的細(xì)胞 內(nèi)同時(shí)含有唯一的人類染色體的一個(gè)片段。這樣得到一系列細(xì)胞株，內(nèi)同時(shí)含有唯一的人類染色體的一個(gè)片段。這樣得到一系列細(xì)胞株， 每個(gè)細(xì)胞株分別含有不同的人類染色體片段。其所含的染色體片段每個(gè)細(xì)胞株分別含有不同的人類染色體片段。其所含的染色體片段 可以用已知的可以用已知的STSSTS或特定的或特定的DNADNA探針，用探針，用PCRPCR或或FISHFISH方法進(jìn)行鑒定方法進(jìn)行鑒定 核苷酸順序圖：核苷酸順序圖： (100)(100) 7.7.物理圖與遺傳圖的關(guān)系物理圖

32、與遺傳圖的關(guān)系: :兩者之間既有聯(lián)系又有差異兩者之間既有聯(lián)系又有差異(100)(100) 8.“8.“位點(diǎn)位點(diǎn)”的概念：的概念：在經(jīng)典的定義中對(duì)于在經(jīng)典的定義中對(duì)于“位點(diǎn)位點(diǎn)”的概念是基的概念是基 因即遺傳位點(diǎn)。而目前基因組研究中通常染色體位點(diǎn)不僅是指基因，因即遺傳位點(diǎn)。而目前基因組研究中通常染色體位點(diǎn)不僅是指基因， 還包括客觀物組成的染色體上的位點(diǎn)。還包括客觀物組成的染色體上的位點(diǎn)。在物理圖譜中，位點(diǎn)是指一在物理圖譜中，位點(diǎn)是指一 系列的客觀物：包括探針位點(diǎn)、限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)、克隆位點(diǎn)、系列的客觀物：包括探針位點(diǎn)、限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)、克隆位點(diǎn)、 基因位點(diǎn)、中間粒及端粒位點(diǎn)等?；蛭稽c(diǎn)、

33、中間粒及端粒位點(diǎn)等。 位點(diǎn)染色體上任何可以區(qū)分的染色體位置位點(diǎn)染色體上任何可以區(qū)分的染色體位置。 9.國(guó)際人類基因組國(guó)際人類基因組單體型圖單體型圖計(jì)劃計(jì)劃 中國(guó)科學(xué)家開始繪制中國(guó)科學(xué)家開始繪制10人類基因組單體型圖人類基因組單體型圖 2002.10 2004.10 “ “國(guó)際人類基因組國(guó)際人類基因組單體型圖單體型圖計(jì)劃計(jì)劃”將以世界亞、非、歐將以世界亞、非、歐 三大族群為研究對(duì)象，三大群體樣本各占三分之一。其中，三大族群為研究對(duì)象，三大群體樣本各占三分之一。其中，中中 國(guó)漢族將提供一半的亞裔樣本，即占世界樣本的六分之一。國(guó)漢族將提供一半的亞裔樣本，即占世界樣本的六分之一。 “ “國(guó)際人類基因組

34、國(guó)際人類基因組單體型圖單體型圖計(jì)劃計(jì)劃”（）是繼）是繼 “國(guó)際人類基因組計(jì)劃國(guó)際人類基因組計(jì)劃”之后，人類基因組研究領(lǐng)域的又一重大之后，人類基因組研究領(lǐng)域的又一重大 研究計(jì)劃?？茖W(xué)家們將在已完成的人類全基因組序列圖的基礎(chǔ)上，研究計(jì)劃?？茖W(xué)家們將在已完成的人類全基因組序列圖的基礎(chǔ)上， 確定人類經(jīng)世代遺傳仍保持完整的確定人類經(jīng)世代遺傳仍保持完整的單體型圖單體型圖。以及在不同族群中。以及在不同族群中 這些這些單體型單體型的的類型與分布。并將這些不同的類型與分布。并將這些不同的單體型單體型標(biāo)上標(biāo)簽。標(biāo)上標(biāo)簽。 單體型（單體型（haplotypehaplotype）:對(duì)于多基因座復(fù)等位基因遺傳系統(tǒng)而言，

35、對(duì)于多基因座復(fù)等位基因遺傳系統(tǒng)而言， 每條染色體上帶有分屬各個(gè)基因座上的某個(gè)等位基因。一條染色體每條染色體上帶有分屬各個(gè)基因座上的某個(gè)等位基因。一條染色體 上這些不同的等位基因組合就是不同的單體型上這些不同的等位基因組合就是不同的單體型。 年月，中國(guó)、美國(guó)、英國(guó)、日本、加拿大五國(guó)代年月，中國(guó)、美國(guó)、英國(guó)、日本、加拿大五國(guó)代 表在美國(guó)華盛頓正式啟動(dòng)了這項(xiàng)計(jì)劃。表在美國(guó)華盛頓正式啟動(dòng)了這項(xiàng)計(jì)劃。 中國(guó)完成中國(guó)完成 美國(guó)完成美國(guó)完成 日本占日本占 英國(guó)占英國(guó)占 加拿大占加拿大占 中國(guó)負(fù)責(zé)號(hào)、號(hào)和號(hào)染色體單體型圖的繪制。其中，香港中國(guó)負(fù)責(zé)號(hào)、號(hào)和號(hào)染色體單體型圖的繪制。其中，香港 大學(xué)、香港科技大學(xué)和

36、香港中文大學(xué)的工作占整個(gè)計(jì)劃的，臺(tái)大學(xué)、香港科技大學(xué)和香港中文大學(xué)的工作占整個(gè)計(jì)劃的，臺(tái) 灣科學(xué)家將負(fù)責(zé)灣科學(xué)家將負(fù)責(zé). .。 意義：人類單體型圖的繪制，將為不同群體的遺傳多態(tài)性研究、疾意義：人類單體型圖的繪制，將為不同群體的遺傳多態(tài)性研究、疾 病和遺傳關(guān)聯(lián)分析、治病基因和治病因子的確定、藥效及副作用和病和遺傳關(guān)聯(lián)分析、治病基因和治病因子的確定、藥效及副作用和 疾病風(fēng)險(xiǎn)的分析、人類起源進(jìn)化遷徙歷史的研究等提供完整的人類疾病風(fēng)險(xiǎn)的分析、人類起源進(jìn)化遷徙歷史的研究等提供完整的人類 基因組信息和有效的研究工具。將為人類常見疾病的研究提供最強(qiáng)基因組信息和有效的研究工具。將為人類常見疾病的研究提供最強(qiáng)

37、大、最經(jīng)濟(jì)的工具。大、最經(jīng)濟(jì)的工具。 HapMap的科學(xué)基礎(chǔ)是染色體上的的科學(xué)基礎(chǔ)是染色體上的SNP的的 “板塊板塊”（block）結(jié)構(gòu)。）結(jié)構(gòu)。SNPs在一段染在一段染 色體上是成組遺傳的，在色體上是成組遺傳的，在DNA上構(gòu)成無形上構(gòu)成無形 的區(qū)域的區(qū)域“板塊板塊” 。每個(gè)板塊在進(jìn)化上非常。每個(gè)板塊在進(jìn)化上非常 保守，在多世代的傳遞中沒有或極少發(fā)生保守，在多世代的傳遞中沒有或極少發(fā)生 DNA重組，其重組，其SNPs的構(gòu)成在單個(gè)染色體上的構(gòu)成在單個(gè)染色體上 的模式，即單體型（的模式，即單體型（Haplotype，圖，圖1） 個(gè)體1 個(gè)體2 個(gè)體3 個(gè)體4 Polymorphism (more

38、fully genetic polymorphism) refers to the simultaneous occurrence in the population of genomes showing variations at a given position. The original definition applied to alleles producing different phenotypes. Now it is also used to describe changes in DNA affecting the restriction pattern or even t

39、he sequence. For practical purposes, to be considered as an example of a polymorphism, an allele should be found at a frequency 1% in the population. Single nucleotide polymorphism (SNP) describes a polymorphism (variation in sequence between individuals) caused by a change in a single nucleotide. T

40、his is responsible for most of the genetic variation between individuals. Recombination frequency can be measured between a restriction marker and a visible phenotypic marker as illustrated in Figure 3.3. So a genetic map can include both genotypic and phenotypic markers. Because restriction markers

41、 are not restricted to those genome changes that affect the phenotype, they provide the basis for an extremely powerful technique for identifying genetic loci at the molecular level The identification of such a marker has two important consequences: It may offer a diagnostic procedure for detecting

42、the disease. Some of the human diseases that are genetically well characterized but ill defined in molecular terms cannot be easily diagnosed. If a restriction marker is reliably linked to the phenotype, then its presence can be used to diagnose the disease. It may lead to isolation of the gene. The

43、 restriction marker must lie relatively near the gene on the genetic map if the two loci rarely or never recombine. Although relatively near in genetic terms can be a substantial distance in termsof base pairs of DNA, nonetheless it provides a starting point from which we can proceed along the DNA t

44、o the gene itself. The frequency of polymorphism means that every individual has a unique constellation of SNPs or RFLPs. The particular combination of sites found in a specific region is called a haplotype, a genotype in miniature. Haplotype was originally introduced as a concept to describe the ge

45、netic constitution of the major histocompatibility locus, a region specifying proteins of importance in the immune system (see Molecular Biology 5.25 Immune diversity). The concept now has been extended to describe the particular combination of alleles or restriction sites (or any other genetic mark

46、er) present in some defined area of the genome. The frequent occurrence of SNPs in the human genome makes them useful for genetic mapping. From the 1.4 106 SNPs that have already been identified, there is on average an SNP every 1- 2 kb. This should allow rapid localization of new disease genes by l

47、ocating them between the nearest SNPs (1442). Microsatellite DNAs consist of repetitions of extremely short (typically 10 bp) units. Minisatellite DNAs consist of 10 copies of a short repeating sequence. the length of the repeating unit is measured in 10s of base pairs. The number of repeats varies

48、between individual genomes. VNTR (variable number tandem repeat) regions describe very short repeated sequences, including microsatellites and minisatellites. DNA fingerprinting analyzes the differences between individuals of the fragments generated by using restriction enzymes to cleave regions tha

49、t contain short repeated sequences. Because these are unique to every individual, the presence of a particular subset in any two individuals can be used to define their common inheritance (e.g. a parent-child relationship). Minisatellites are useful for genetic mapping 2002年年4月：日本月：日本RGP在在Science上公布

50、了以上公布了以O(shè)ryza sativa L.ssp. japonica 為材料的基因組草圖，所用的方法也是鳥為材料的基因組草圖，所用的方法也是鳥 槍法，結(jié)果表明槍法，結(jié)果表明Oryza sativa L.ssp. japonica 大約由大約由 420Mb組成，含有組成，含有32000-50000個(gè)基因個(gè)基因，與其他禾谷類作，與其他禾谷類作 物有很大的同線性，但與擬南芥的同線性有限。 參與測(cè)序的科研機(jī)構(gòu)及其染色體分配參與測(cè)序的科研機(jī)構(gòu)及其染色體分配 國(guó)際水稻基因組計(jì)劃大事記 1998.2 測(cè)序工程啟動(dòng) 2002.11 中國(guó)、日本率先完成水稻第4號(hào)和第1號(hào) 染色體的序列精確測(cè)定，并在英國(guó)自然雜志

51、上發(fā)表了 有關(guān)成果。 2002.12 水稻基因組“草圖”繪就 2003.6 美國(guó)科學(xué)家完成了水稻第10號(hào)染色體的序 列精確測(cè)定，研究結(jié)果發(fā)表在美國(guó)科學(xué)雜志上 2004.12 水稻基因組“精細(xì)圖”全部完成 2005.8“ 精細(xì)圖”刊登于自然雜志上 共定位了水稻中37500個(gè)基因。相比3年 前的“草圖”，新繪制的“精細(xì)圖”覆蓋率 達(dá)到95.3%，誤差率不超過萬分之一，并首次 在高等動(dòng)植物中完成了對(duì)著絲粒的測(cè)序 SNP 本節(jié)本節(jié) 結(jié)束結(jié)束 謝謝 謝謝 返回返回返回返回 AFLP 返回返回 RFLP 返回返回 RAPD 返回返回 隨機(jī)引物隨機(jī)引物PCRPCR產(chǎn)物多態(tài)性的分子基礎(chǔ)：類型產(chǎn)物多態(tài)性的分子基

52、礎(chǔ)：類型1 1和和2 2為顯性標(biāo)記，是最常見到多態(tài)性，為顯性標(biāo)記，是最常見到多態(tài)性， 類型類型3 3和和4 4為共顯性標(biāo)記，但較少見為共顯性標(biāo)記，但較少見 返回返回 F76 返回返回 返回返回 isozyme返回返回 返回返回 DNA樣品限制酶樣品限制酶 酶解酶解 電泳電泳 SNP One way of detecting an SNP by solution hybridization SSLPSSLP(Simple sequence length polymorphisms) are arrays of (Simple sequence length polymorphisms) are

53、arrays of repeat sequences that display length variations, different repeat sequences that display length variations, different alleles containing different numbers of repeat unitalleles containing different numbers of repeat unit(F85)(F85). . Unlike RFLPs, SSLPsUnlike RFLPs, SSLPs can be multi-alle

54、lic as each SSLP can can be multi-allelic as each SSLP can have a number of different length variation.have a number of different length variation. 1.1.MinisatellitesMinisatellites（小衛(wèi)星（小衛(wèi)星 DNADNA）, ,also known asalso known as variable number variable number of tandem repeatsof tandem repeats（可變數(shù)串聯(lián)重復(fù)

55、，（可變數(shù)串聯(lián)重復(fù)，VNTRsVNTRs),in),in which the repeat which the repeat unit is up to 25 bpunit is up to 25 bp in length; in length; 2.2.MicrosatellitesMicrosatellites（微衛(wèi)星微衛(wèi)星 DNADNA） or simple tandem repeats or simple tandem repeats (STRs),whose repeats are shoter,usually dinucleotide(STRs),whose repeats are

56、 shoter,usually dinucleotide or or tetranucleotidetetranucleotide units. units. Microsatellites are more popular than minisatellites Microsatellites are more popular than minisatellites as as DNA markers because Microsatellites are more convenientlyDNA markers because Microsatellites are more conven

57、iently spaced throughout the genome and the quickest way to type spaced throughout the genome and the quickest way to type a length polymorphism is by PCRa length polymorphism is by PCR 返回返回 F85 返回返回 返回返回STS 返回返回 56 54 返回返回 99 返回返回 返回返回 具體技術(shù)路線：染色體具體技術(shù)路線：染色體YACYAC重疊群重疊群?jiǎn)蝹€(gè)單個(gè)YACYAC克隆克隆 cosmidcosmid重疊群重

58、疊群?jiǎn)蝹€(gè)單個(gè)cosmidcosmid克隆克隆質(zhì)粒亞克質(zhì)粒亞克 隆隆隨機(jī)測(cè)序隨機(jī)測(cè)序 計(jì)算機(jī)分析串連得大片段計(jì)算機(jī)分析串連得大片段 返回返回 Genome Res 8(12):1229, 1998 Science 291:1331 (2001) SNP Databases: (Dec. 2000) Celera+PFP : 2,104,820 entries TSC : 585,811 entries Kwok (Wash U): 438,032 entries Dec. 2001 The Trend & Applications of SNP markers Diseased Families

59、 Microsatellite Linkage Studies Candidate Regions Candidate Genes Single Gene Disease Drug Targets/Diagnostics Positional Cloning Functional Studies Diseased Families Isolate Populations Case - Control cohorts Association studies Candidate Genes or genome-wide Complex Diseases Drug Targets Diagnosti

60、c/Prognostic/Risk Markers Prevention Pharmacogenetics Genome scans for Linkage Analysis: 1,000 to 5,000 markers. Candidate Gene (LD mapping): 100 to 1,000 markers per cM. Genome scans for Association Studies: 100,000 markers ? Requires PCR amplification per variant position. Currently resource inten