兔血漿中葛根素濃度論文

1、兔血漿中葛根素濃度論文 【摘要】目的建立測(cè)定兔血漿中葛根素濃度的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法。方法血漿加入內(nèi)標(biāo)橙皮苷后經(jīng)固相萃取處理,采用aglientc18柱(150mm2.1mm,3.5m)分離,流動(dòng)相為甲醇10mmoll-1醋酸銨緩沖液乙腈(體積比702010),流速為0.2mlmin-1。樣品在串聯(lián)質(zhì)譜中經(jīng)esi源離子化后以多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)方式測(cè)定。結(jié)果葛根素在103000ngml-1線(xiàn)性良好(r=0.9986),檢測(cè)限為10ngml-1,回收率為99.91%103.92%,絕對(duì)回收率為91.33%100.40%,日內(nèi)、日間變異(rsd)均15%,色譜峰保留時(shí)間為1.67min。結(jié)論方法靈敏、準(zhǔn)確

2、、快速、特異性強(qiáng),適用于中藥葛根素的藥動(dòng)學(xué)研究。 【關(guān)鍵詞】液相色譜質(zhì)譜法;葛根素;血藥濃度 abstract:objectivetoestablishanhplcmsmsmethodfordeterminingthecontentofplasmapuerarin.methodstheplasmasamplepretreatedwithsolidphaseextractionafteradditionofinternalstandardofhesperidinwasanalyzedonanaglientc18column(150mm2.1mm,3.5m).themobilephaseconsi

3、stedofmethanol10mmoll-1nh4acbufferacetonitrile(702010)withtheflowrateof0.2mlmin-1.thesamplewasionizedbyelectrosprayionizationsourceinthetriplequadrupletandemmassspectrometer,then,itwasquantitatedwithmultiplereactionmonitoringmode.resultstherewasagoodlinearityovertheconcentrationrangesof103000ngml-1(

4、r=0.9986).thedetectionlimitofthismethodwas10ngml-1.therecoveryandabsoluterecoverywere99.91%103.92%and91.33%100.40%,respectively.thewithindayandbetweendaydeviationswerelessthan15%andthechromatographypeaktrwas1.67min.conclusionthemethodissensitive,accurate,rapidandsuitableforthedeterminationofpuerarin

5、inhumanplasma. keywords:liquidchromatography-tandemmassspectrometry;puerarin;plasmaconcentration 葛根素(puerarin)是中藥葛根的主要成分之一,具有擴(kuò)張冠脈血管、降低血壓和心肌耗氧量、抗心律失常等作用1。文獻(xiàn)報(bào)道的葛根素血藥濃度測(cè)定方法多數(shù)是高效液相色譜法2-4,但有時(shí)也難以滿(mǎn)足藥動(dòng)學(xué)研究中微量血藥濃度的測(cè)定要求,且分析用時(shí)較長(zhǎng)。本文建立測(cè)定葛根素血藥濃度的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(lcmsms)法,具有簡(jiǎn)便、靈敏度高、特異性強(qiáng)且檢測(cè)快速等優(yōu)點(diǎn),適用于葛根素的藥動(dòng)學(xué)研究。 1材料與方法 1.1儀器與試

6、藥美國(guó)ab公司api3000型液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng);waters20管型固相萃取儀;techne樣品濃縮儀;watershlb固相萃取小柱(100mg)。葛根素注射劑(浙江康恩貝制藥股份有限公司,0.25g/5ml);葛根素、橙皮苷對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào)分別為:0752200108,0721200104);甲醇、乙腈為色譜純;醋酸胺為分析純;重蒸餾水。 1.2色譜及質(zhì)譜條件色譜柱:aglientc18(150mm2.1mm,3.5m),流動(dòng)相:甲醇10mmoll-1醋酸銨緩沖液乙腈(體積比702010),流速為0.2mlmin-1。輔助氣化電噴霧離子源(esi),多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)(mrm)

7、模式正離子檢測(cè),檢測(cè)離子對(duì):m/z417.2267.2(葛根素),m/z611.2303.2(內(nèi)標(biāo)橙皮苷),輔助氣化氣流量:7500ccmin-1,霧化氣流量:8lmin-1,氣簾氣流量:8lmin-1,碰撞氣流量:6lmin-1,離子源噴霧電壓:5500v,離子源霧化溫度:350。 1.3對(duì)照品及內(nèi)標(biāo)溶液的配制精密稱(chēng)取適量的葛根素對(duì)照品,用甲醇溶解并定容得160gml-1的對(duì)照品溶液;精密稱(chēng)取適量的橙皮苷對(duì)照品,用甲醇溶解并定容得500ngml-1的內(nèi)標(biāo)溶液。 1.4血漿樣品處理固相萃取小柱用1.0ml甲醇活化和1.0ml雙蒸水平衡,取血樣300l加入10mmoll-1醋酸銨緩沖液300l和

8、內(nèi)標(biāo)溶液20l,混勻后上樣,雙蒸水1.0ml洗滌,0.5ml甲醇洗脫,收集洗脫液于45水浴下用n2吹干濃縮,加入150l流動(dòng)相復(fù)溶,取5l進(jìn)樣。 2結(jié)果 2.1方法專(zhuān)屬性根據(jù)葛根素和內(nèi)標(biāo)物橙皮苷的子離子質(zhì)譜掃描結(jié)果(見(jiàn)圖1),分別選擇特異的m/z417.2267.2和m/z611.2303.2用于定量監(jiān)測(cè)。按照血漿樣品處理方法和檢測(cè)條件,空白血漿的色譜圖、空白血漿加葛根素和內(nèi)標(biāo)對(duì)照品的色譜圖、用藥后血漿色譜圖,分別見(jiàn)圖2a、圖2b和圖2c。結(jié)果表明,葛根素和內(nèi)標(biāo)物的保留時(shí)間分別為1.67min和1.75min,血漿中無(wú)內(nèi)源性物質(zhì)和基質(zhì)效應(yīng)干擾,方法特異性強(qiáng)。 圖1葛根素(1)和橙皮苷(2)的質(zhì)

9、譜子離子掃描圖(略) fig.1fullscanms-msspectraofpuerarin(1)andhesperidin(2) a.空白血漿;b.空白血漿加入葛根素和橙皮苷對(duì)照品;c.兔給藥后血漿 1.葛根素m/z417.2267.2,tr=1.67min;2.橙皮苷m/z611.2303.2,tr=1.75min 圖2血漿中葛根素和橙皮苷的色譜圖(略) fig.2chromatogramsofpuerarinandhesperidininplasmabylcmsms 2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)及線(xiàn)性范圍取空白血漿加入葛根素對(duì)照品溶液,配制成濃度為10、30、100、300、1000、3000ngml

10、-1的血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)樣品,按“1.4”項(xiàng)下方法操作,計(jì)算葛根素與內(nèi)標(biāo)峰面積比,得回歸方程為:y=0.00299c+000234,r=0.9986,權(quán)重1/x2。血漿中葛根素在103000ngml-1范圍內(nèi)與峰面積比線(xiàn)性關(guān)系良好,定量下限為10ngml-1。 2.3精密度與相對(duì)回收率取空白血漿加入葛根素對(duì)照品溶液,制備濃度為10、1500和2500ngml-1的血漿質(zhì)控樣品,按“1.4”項(xiàng)下方法操作測(cè)定,每個(gè)濃度的樣品在1d內(nèi)作5份樣品分析,連續(xù)測(cè)定3d,計(jì)算方法的日內(nèi)和日間差,結(jié)果低、中、高3種濃度的日內(nèi)rsd分別為7.56%,4.43%,9.66%(n=5);日間rsd分別為13.58%,7.

11、20%,7.06%(n=15);將實(shí)測(cè)值與真實(shí)值相比得相對(duì)回收率,結(jié)果低、中、高3種濃度的相對(duì)回收率分別為(103.9214.12)%,(99.91719)%,(100.297.08)%(n=15)。 2.4提取回收率取空白血漿樣品按“1.4”項(xiàng)下提取、吹干,然后加入分別含10、1500和2500ngml-1葛根素對(duì)照品的流動(dòng)相150l復(fù)溶(n=5),使對(duì)照品溶液含空白血漿基質(zhì),測(cè)定其峰面積并計(jì)算得均值a1,a2,a3;另取低、中、高濃度的質(zhì)控血漿各5份,按“1.4”項(xiàng)下方法操作、測(cè)定峰面積,分別與a1,a2,a3進(jìn)行比較,計(jì)算本法的提取回收率(n=5),分別為(91.3311.06)%,(1

12、00.407.97)%,(96.366.28)%。 2.5稀釋能力試驗(yàn)取濃度為2500ngml-1的血漿質(zhì)控樣品5份,用空白血漿稀釋5倍后按“1.4”項(xiàng)下方法操作,將測(cè)定值乘稀釋因子后與標(biāo)示值比較,準(zhǔn)確度為(98.453.57)%。所以對(duì)高于定量上限的樣品可用空白血漿稀釋后測(cè)定。 2.6穩(wěn)定性試驗(yàn)取低、中、高3種濃度的血漿質(zhì)控樣品各5份,分別在-75保存5個(gè)月、室溫21放置24h及經(jīng)3個(gè)冷凍融解循環(huán)處置,然后按“1.4”項(xiàng)下方法操作,測(cè)定值與真實(shí)值比較,相對(duì)偏差均15%,表明血漿樣品穩(wěn)定;血樣制備后的待測(cè)液在自動(dòng)進(jìn)樣器中放置6h,其測(cè)定值與真實(shí)值比較,相對(duì)偏差均15%,表明待測(cè)液在測(cè)定過(guò)程中也

13、是穩(wěn)定的。 2.7兔體內(nèi)血藥濃度的測(cè)定取新西蘭兔6只(廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供),雌雄兼有,體重2.02.5kg,禁食12h后于耳緣靜脈注射葛根素100mg,于注射前、注射結(jié)束后0.25、0.5、1、2、3、4、6、8、10、12h取耳緣靜脈血2ml,置肝素抗凝管中,離心(3500r/min)15min,吸取上層血漿進(jìn)行分析,以標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)樣本中的葛根素濃度,同時(shí)測(cè)定質(zhì)控樣本以保證結(jié)果的可靠性。兔靜脈注射葛根素后的平均藥時(shí)曲線(xiàn)見(jiàn)圖3。 3討論 葛根素選擇m/z417.2267.2作為監(jiān)測(cè)離子對(duì),特異性強(qiáng)且具有較高的儀器響應(yīng)值。以含醋酸銨緩沖液的甲醇乙腈作為流動(dòng)相,可使靈敏度進(jìn)一步

14、提高和有利于檢測(cè)體系穩(wěn)定。使用spe法凈化血漿樣品,能有效消除lcmsms法檢測(cè)生物樣品時(shí)常有的基質(zhì)效應(yīng)的影響,而且使用watershlb小柱,提取效率很高,本試驗(yàn)曾對(duì)提取步驟中的洗滌液和二次甲醇洗脫液進(jìn)行跟蹤檢測(cè),均無(wú)葛根素的檢出。藥動(dòng)學(xué)研究涉及一系列的血樣采集、保存、制備和測(cè)定等步驟,藥物在紛繁的操作過(guò)程中是否保持穩(wěn)定,需預(yù)先在方法學(xué)確證試驗(yàn)中進(jìn)行考察,穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表明,在上述條件下血樣中的葛根素是穩(wěn)定的。lc/ms/ms技術(shù)已開(kāi)始在中藥藥動(dòng)學(xué)研究得到應(yīng)用,其特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)可滿(mǎn)足在復(fù)雜的生物樣品中進(jìn)行微量成分分析的要求。本試驗(yàn)采用此技術(shù)測(cè)定中藥葛根素的血藥濃度,定量下限達(dá)到10ngml-1,目標(biāo)物和內(nèi)標(biāo)物的保留時(shí)間均在2min之內(nèi),檢測(cè)快速。本方法的各項(xiàng)指標(biāo)符合生物樣品定量分析方法學(xué)的要求,可用于藥動(dòng)學(xué)研究的大量血樣的測(cè)定。 圖3兔靜脈注射葛根素100mg后的平均血藥濃度時(shí)間曲線(xiàn)(n=6)(略) fig.3theconcentrationtimecurveofpuerarininrabbitplasmaafteriv100mg(n=6) 【參考文獻(xiàn)】 1朱慶嘉,呂欣然.葛根素的藥理學(xué)和臨床